マウス単離された灌流腎臓テクニック
2016年11月17日
マウス単離された灌流腎臓（MIPK）が1時間灌流し、機能的なex vivoでの条件の下でのマウスの腎臓を維持するための技術です。緩衝液および外科技術を詳細に説明します。
このプロトコルの全体的な目標は、ex vivo 灌流マウス腎臓における単離された腎機能を分析することです。血圧、ホルモン、自律神経の影響は除きます。この方法は、ネフロロジーの主要な質問に答えるのに役立ちます。
孤立した臓器機能に内部を与え、急性腎障害を研究するためのエレガントなツールとして機能します。IPKの主な利点は、全身的な影響がない場合に臓器機能が研究されることです。マウスを手術用に準備した後、はさみを使用して、恥骨の頂上から胸骨まで中程度の開腹術を行います。
最初に皮膚を開き、次に腹筋を開きます。次に、腸を取り出し、マウスの左側、腹部から外側に置きます。次に、膀胱を結合組織から解放し、尿管と尿道の両方を露出させます。
これらの手順では、5-0縫合糸を使用してすべての結紮糸を配置します。最初に配置する結紮糸は左尿管の周りです。これをダブルサージカルノットでしっかりと閉じます。
次に、同じ手法を使用して尿道の周りに結紮糸を配置します。次に、膀胱全体に投げ縄結紮糸を置きますが、ほどいたままにしておきます。最初の3つの縫合糸を所定の位置に配置したら、アイハサミを使用して膀胱に1ミリメートルの長さの切開を行います。
この切開部に、2センチメートルのPE-50チューブで作られたカニューレを挿入します。次に、膀胱を投げ縄で固定する結紮糸を閉じ、カニューレを固定します。膀胱をカニューレに挿入した状態で、左尿管と尿道を結紮糸から遠位に切断します。
これで、膀胱は右尿管にのみ取り付けられ、自由に動くはずです。次に、腹部大動脈の周囲の結合組織と脂肪を取り除きます。次に、露出した大動脈の中点の周り、上腸間膜動脈と腹腔幹の間の横隔膜のすぐ下に結紮糸を配置します。
これらもそれぞれ緩めておきます。次に、上腸間膜動脈の周りに結紮糸を配置します。次に、右腎動脈の真下と左腎動脈の上に大動脈の周りに3番目の結紮糸を配置します。
これが合字番号7です。最後に、尾静脈パッケージの周りに結紮糸を置きます。次に、結紮糸番号7と左腎動脈の分岐との間にクランプを配置します。
次に、大動脈に小さな切開を行い、背壁を切らないように注意しながら、尾側から結紮糸7まで、血管拡張器で開口部を伸ばします。開口部に、2センチ引っ張ったPE-50カニューレを挿入し、先端をクランプに押し込みます。次に、clを開きますamp.
次に、針の先端を右腎臓動脈と大動脈の接合部に達するまで頭蓋骨に押します。次に、結紮糸7を閉じ、次に腹部大動脈の中点で結紮糸を閉じます。横隔膜を解剖してハサミで胸を開いて進めます。
次に、1回の切り傷で、大動脈、大静脈、心臓、および栄養神経を分離します。次に、灌流ポンプの圧力制御を開始し、平均圧力を80〜100ミリメートル水銀柱に維持します。次に、大動脈と尾静脈のパッケージの周りに残っている3つのほどけていない結紮糸を閉じます。
はさみを使用して、右腎臓を周囲の結合組織から解放し、脂肪嚢から放出します。上腸間膜動脈と腹腔幹の間の結紮糸に近位で大動脈を切断します。次に、上腸間膜動脈の周りの結紮糸に対して遠位に上腸間膜動脈を切断します。
次に、血管自体に切り込まないように注意しながら、腎臓を支える血管束を取り外します。次に、腎臓への接続部で肝臓を切断しますが、肝臓のごく一部を肝臓に付着させたままにして、大静脈が腎臓によって開いたままになるようにします。次のステップは、マウスから腎臓束を取り除くことです。
次に、腎臓をチャンバーに残し、マウスを取り出します。肝臓と腎臓の間の接続部に、なげなわ結紮糸を置きます。次に、静脈線で大静脈をカニューレし、なげなわ結紮糸を閉じます。
これで、腎臓は箱の中に安定して収まるはずです。静脈線を通る静脈流出はすぐに開始する必要があります。尿の流出は約3分後に始まります。
尿管の蠕動運動はすぐに開始し、少なくとも1時間は安定しているはずです。.ボックスを閉じます。これで準備は完了し、少なくとも1時間は生存可能な状態を維持する必要があります。
記載された方法をC57黒色6マウスで使用した後、4つの腎臓の組織生存率を1時間の連続灌流後に試験した。圧力は連続100ミリメートル水銀柱に維持されました。灌流と血管抵抗は、4つの腎臓すべてで安定したままでした。
糸球体濾過率は、時間の経過とともに増加することを意図したが、有意ではないFITCイヌリンクリアランスを使用して評価されました。ナトリウムとカリウムの分別排 ?? は、55 分間の灌流後に評価されました。.これらのパラメータは、in vivoの状況と比較して増加しました。
55分後、小便器のモル濃度は静脈流出の浸透圧を超えて上昇しなかった。次に、腎臓を固定し、その超微細構造をTEMで評価しました。近位尿細管のS1セグメントの糸球体はほとんど変化していないように見えました。
血管束に近くない厚い上行肢の近位尿細管の一部のS2、S3セグメントは、臓器損傷の兆候を示しました。詳しく調べたところ、遠位の回旋細管と収集管には壊死の兆候は見られませんでした。全体として、腎臓はラット分離された灌流腎臓について報告されているものを反映していました。
この手順に続いて、イメージングやファクト、それに続くタンパク質またはRNA分析などの分析方法を組織に対して実行して、さらなる洞察を得ることができます。
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概要
マウス単離灌流腎（MIPK）法を用いることで、ex vivo の環境で1時間にわたり腎機能を解析することが可能です。この手法は全身性の影響を排除できるため、単離臓器の機能や急性腎障害に関する知見を得ることができます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 腎臓学
- 臓器灌流法
- 急性腎障害研究
背景
- MIPK法は、血圧やホルモンの影響を受けずに腎機能を研究するために設計されています。
- この手法は、単離臓器の機能を理解する上で不可欠です。
- 急性腎障害を調査するための有用なツールとして機能します。
- 外科的準備では、腎臓にアクセスするために正中開腹術を行います。
研究目的
- 制御されたex vivo環境において、単離腎機能を生体外で解析すること。
- 腎機能に対する全身的な影響を排除すること。
- 急性腎障害のメカニズムに関する知見を得ること。
使用した手法
- 手術に向けたマウスの準備。
- 恥骨稜から胸骨までの正中開腹。
- 分離腎への特定の緩衝液による灌流。
- 灌流期間中の腎機能のモニタリング。
主な結果
- ex vivo で1時間の腎機能維持に成功したこと。
- 制御された環境下で急性腎障害の影響を実証したこと。
- 灌流に対する単離臓器の反応に関する知見を得たこと。
- 研究ツールとしてのMIPK法の妥当性を検証したこと。
結論
- MIPK法は、全身的な影響を受けることなく腎機能を研究するのに有効です。
- この手法により、急性腎障害のメカニズムに関する理解が深まります。
- 本手法は、今後の腎臓学研究のためのプラットフォームを提供します。
よくある質問
業界における有用性の概要
マウス単離灌流腎 (MIPK) 法は、器官機能を全身性の混絡要因から分離することで、腎臓標的のメカニズム的なリスク低減を可能にします。これにより、腎臓疾患に焦点を当てた創薬プログラムにおける標的バリデーションおよびアッセイ開発が支援されます。本手法は、制御可能で再現性の高い ex vivo システムにおいて、候補薬を評価するための予測的信頼性を提供します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： ホルモンや神経による干渉がない状態で、化合物に対する単離腎臓の反応を評価することで、治療仮説を検証します。
- 運用的価値： 腎血流量、血管抵抗、および尿量を直接測定することにより、機能的なターゲットバリデーションを可能にします。
- 予測的価値： 疾患に関連する系において、糸球体濾過量または電解質調節を変化させる化合物を特定し、ポートフォリオの優先順位付け（トリアージ）を支援します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 定量的な機能的および分子的な読み取りによるダウンストリームスクリーニングに向けて、検証済みの生物学的システムを調製します。
- 運用的価値： 制御された灌流圧と一貫した尿採取スケジュールを通じて、アッセイ条件を標準化します。
- 拡張性の価値： 急性腎障害のモデリングや、ネフロンセグメント全体のトランスポータープロファイリングに対するプラットフォームの再利用をサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナル価値： TEM超微細構造や輸送タンパク質のウェスタンブロット解析を含む構造的および分子的なリードアウトを通じて、疾患との関連性を維持します。
- 前臨床の連続性： 灌流後の組織を用いてイメージング、タンパク質、またはRNA研究の解析を可能にすることで、創薬から前臨床バリデーションへの橋渡しを行います。
- リスク調整後の意思決定： 灌流ストレス下におけるセグメント特異的な尿細管損傷パターンを明らかにすることで、開発進展の意思決定に情報を供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
MIPK法は、標的仮説の検証からリード化合物の同定に至る創薬の連続的なプロセスに組み込まれており、前臨床試験への移行前に機能的な妥当性確認を行うことができます。
- 創薬生物学：腎機能を単離して経路特異的な薬物効果を明確にすることで、メカニズム解析におけるリスク低減を支援します。
- スクリーニング：安定した灌流パラメータと、FITC-インリンクリアランスや分画電解質排泄量などの定量可能なアウトプットにより、アッセイの即時利用性を実現します。
- アナリティクス：血管抵抗、糸球体濾過量、浸透圧の測定を通じて比較データセットを生成し、化合物の効果をランク付けします。
- トランスレーショナルリサーチ：灌流後の組織解析により、バイオマーカーの整合性とメカニズムの洞察を得ることで、研究の継続性を可能にします。
- エンタープライズ再利用：ネフロンセグメントのプロファイリングやトランスポーター阻害研究に利用可能な、再利用可能な灌流プラットフォームとして機能します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：腎機能評価における全身的な変数を排除することで、メカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用的価値：標準化された外科的準備および灌流圧制御（80–100 mmHg）により、再現性を確保する。
- 戦略的価値：腎臓特異的なコンテキストにおける早期の機能的リスクデータを提供し、go/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：薬理学的摂動に対する直接的な臓器レベルの反応に基づいた、リスク調整後の優先順位付けを可能にする。
実施上の留意点
- マウスの血管外科手術およびカニュレーション技術の専門知識が必要です。
- 安定した圧力と流量を維持できる灌流装置に依存します。
- 結紮位置と膀胱カニュレーションの一貫性を保つため、チーム間での標準化が必要です。
- 適応上の検討事項として、種特有の血管サイズおよび灌流緩衝液の組成が挙げられます。
- 実用上の制限：生存可能時間が約1時間であるため、化合物への長期曝露研究は制限されます。
