に薬剤耐性に関連する新規スプライス変異体を検出するために、RNA配列決定を使用して、インビトロがんモデル

このプロトコルの全体的な目標は、固形腫瘍および血液悪性腫瘍のin vitroモデルにおける薬物耐性プロファイルと異常なスプライシングとの関連を調査することです。この方法は、転写後レベルでの薬剤耐性の根底にあるメカニズムは何かなど、分子薬理学と化学療法耐性の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、確立された細胞毒性スクリーニングプロトコルと強力な次世代シーケンシングベースのトランスクリプトーム解析を組み合わせることです。

この技術は、化学療法の失敗の根底にある分子メカニズムの理解を深めることにつながり、薬剤耐性の早期検出を改善する可能性があります。この手法は、細胞株モデルにおける薬剤耐性のゲノムワイドな決定要因に関する洞察を得ることができます。しかし、一次患者サンプルや異種移植片などの他のシステムにも適用できます。

この手順を実演するのは、アムステルダムがんセンターの当研究室の技術者であるヨハン・フォミルノです。白血病細胞のMTTアッセイを行うには、96ウェル平底実験プレートを調製します。ウェルを薬物濃度専用にして細胞を制御し、細胞を含まない培地を制御します。

デキサメタゾンまたはdexの薬物希釈範囲を準備します。各dex希釈液から30マイクロリットルを96ウェルプレートの適切なウェルに加えます。各濃度をトリプリケートに含めるようにしてください。

指数関数的に増殖する白血病細胞を収穫し、最適な播種濃度で再懸濁します。120マイクロリットルの細胞懸濁液を、薬物溶液または増殖培地のいずれかを含む各ウェルに加え、5%二酸化炭素と摂氏37度で72時間インキュベートします。インキュベーションステップの後、反復ピペットを使用して各ウェルに15マイクロリットルのMTT試薬を加えます。

プレートシェーカーでプレートを5分間、毎分最大900回振ってください。プレートを5%の二酸化炭素を含む摂氏37度に戻し、細胞培養インキュベーターに置き、さらに4〜6時間インキュベートします。インキュベーション後、吸光度値は化合物の適切な可溶化に依存するため、ホルマザン結晶を完全に再懸濁してください。

150マイクロリットルの酸性化イソプロパノールを各ウェルに加え、マルチチャンネルピペットでよく混合して、すべてのホルマザン結晶を完全に再懸濁します。マイクロプレートリーダーを使用して、540ナノメートルと720ナノメートルでの光学密度またはODを決定し、バックグラウンドを補正して正確な測定を確保し OD.To 膵臓癌細胞のSRBアッセイを実行し、96ウェル平底実験プレートを準備します。膵臓癌細胞を、マルチチャンネルピペットを用いて、培地100マイクロリットル中において適切な密度で96ウェル平底プレート中で指数関数的に三重に増殖させる。

100マイクロリットルの中型から中型のみのウェルを追加し、5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩インキュベートして、細胞がプレートに適切に接着するようにします。マルチチャンネルピペットを使用して、各希釈液から100マイクロリットルを96ウェルプレートの適切なウェルに加えます。各濃度が3倍になるようにしてください。

氏37度で5%二酸化炭素と72時間インキュベートします。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、25マイクロリットルの冷たいTCA溶液をウェルに加えます。プレートを摂氏4度で少なくとも60分間インキュベートして、タンパク質をウェルの底に沈殿させて固定します。

培地を取り出してプレートを空にし、ティッシュで短時間乾かします。水道水で5回洗ってから、プレートを空にして室温で乾燥させます。反復ピペットを使用してウェルあたり50マイクロリットルのSRB溶液を加え、室温で15分間染色します。

次に、SRBの汚れを取り除いてプレートを空にします。プレートを1%酢酸で4回洗浄した後、プレートを空にして室温で乾燥させます。マルチチャンネルピペットを使用してウェルあたり150マイクロリットルのトリス溶液を加え、プレートシェーカーで3分間、毎分最大900シェイクまで混合します。

540ナノメートルの光学密度を読み取ります。サンプルを300倍gで3分間スピンダウンします。上清を除去した後、市販のシリカ膜スピンカラムを用いて全mRNAを抽出します。

UV-Vis分光光度計を使用して、全RNAの濃度と純度を測定します。シーケンシングライブラリーを調製するには、サンプルあたり2マイクログラムの総mRNAを使用します。mRNAライブラリー調製プロトコルは、製造元の指示に従って行ってください。

バイオアナライザーを使用して、1リットルあたり10ナノモルの最終濃度まで1つのサンプルにライブラリをプールした後、シングルリード100塩基対モードのハイスループットシーケンシングシステムを使用します。すべてのプライマーは、テキストプロトコルで説明されているように設計します。第一鎖cDNA合成では、滅菌水で1〜5に希釈した反応バッファーに、Moloneyマウス白血病ウイルス逆転写酵素1マイクロリットルあたり200単位を使用して、単離されたRNAの1マイクログラムをcDNAに逆転写します。

RT-PCR反応を行うには、PCR反応ミックスに1マイクロリットルのcDNAを加え、チューブをサーモサイクラーに入れます。テキストプロトコルで説明されているようにプログラムを実行します。PCR後、サンプルを1%アガロースゲルにロードし、電気泳動システムで100ボルトのTBEバッファーにゲルを約30分間泳動します。

クロスコンタミネーションを避けるため、qRT-PCRアッセイを実施する際にはフィルターチップを使用してください。qRT-PCRを実施するには、検出する特定のスプライスバリアントごとに、ハウスキーピング遺伝子に対してシアニングリーンPCR反応ミックスを調製します。マスターミックスを白い96ウェルプレートにロードし、各サンプルに重複を調製します。

プレートをサーモサイクラーに入れる前に、水で10倍に希釈した5マイクロリットルのcDNAを各混合物に加えます。ここでは、白血病細胞のMTTアッセイと膵臓がん細胞のSRBアッセイによって決定される増殖阻害曲線が示されています。デキサメタゾン耐性細胞とゲムシタビン耐性細胞の曲線は右にシフトしており、親の感受性細胞と比較して成長阻害を示しています。

すべての細胞株のcDNAライブラリの濃度と品質は、バイオアナライザーDNAチップで測定されます。エレクトロフェログラムでは、約300塩基対に蛍光ピークが見られ、これはその後のRNAシーケンシング手順の品質が良好であることを示しています。遺伝子候補DDX5の短いリードは、接続線がスプライスジャンクションを表す刺身プロットとして視覚化できます。

DDX5転写産物は、グルココルチコイド耐性細胞株であるCEM-C3およびCEM-R5と比較して、エクソン12およびCEM野生型およびCEM/R30dm細胞の異なる使用を示しています。RNAシーケンシングの結果は、選択的にスプライシングされたエクソンの上流および下流に位置するエクソンにプライマーペアと収量を持つ選択した遺伝子に対してRT-PCRを行うことにより検証されます。ここでは、DDX5遺伝子の示差スプライシングを示します。

アイソフォーム特異的リバースプライマーを用いたqRT-PCRアッセイによる示差スプライシング転写産物の定量により、DDX5デルタエクソン12スプライスバリアントおよび特異的グルココルチコイド耐性サブラインの特異的ダウンレギュレーションが確認されました。一度習得すれば、このテクニックは3〜4週間で完了します。この手順を試みる際には、分解を避けるために、RNAサンプルを氷上に保つことを忘れないでください。

この手順に続いて、新規スプライスバリアントの異所性過剰発現のような他の方法を実行することができる。これにより、代替スプライシングプロファイルが薬剤耐性に及ぼす機能的影響などの追加の疑問に答えることができます。この技術は、薬剤耐性のゲノムワイドな決定要因を探求するための分子薬理学の分野における研究への道を開く可能性があります。