TEM分析のための低細胞数とサンプル調製のための代替的アプローチ

この手順の全体的な目標は、効率的で再現性のある方法でTEM分析を実行するために、細胞数が少ないサンプルを調製することです。この方法は、実際の細胞のすべての構造を明らかにし、生物医学分野におけるより良い生理学的環境を明らかにするのに役立ちます。この手法の主な利点は、低い細胞数から再現性のある方法で定性的および定量的な結果を取得できることです。

まず、事実を使用して、10, 000個の造血幹細胞、またはHSCを1.5mLの微量遠心チューブに選別します。600マイクロリットルのイソコーブ改質ダルベッコ培地を10%FBSで含んでいます。スイングアウトバケット付きの遠心分離機を使用して、選別されたHSCを1, 000倍Gで10分間スピンダウンします。

非ユダヤ人の吸引を使用して、200マイクロリットルを除くすべての媒体を取り除きます。細胞を固定するには、新たに調製した2つのX固定液0.2 mLを加え、室温で1時間インキュベートします。次に、600マイクロリットルの0.1モルカコジル酸緩衝液を加えて細胞を洗浄します。

細胞を再度遠心分離します、今度は摂氏30度で。次に、遠心分離後、200マイクロリットルを除くすべてのバッファーを除去し、カコジル酸緩衝液にエバンスブルー1ミリリットルあたり2ミリグラムの200マイクロリットルを加え、室温で20分間インキュベートして細胞を染色します。600マイクロリットルの0.1モルカコジル酸緩衝液を使用して、細胞を3回洗浄します。

次に、細胞の懸濁液を0.5mLチューブに移す前に、残りの200マイクロリットルのバッファーに細胞を再懸濁します。このステップでは、ペレットがチューブ内に見えるはずです。卓上遠心分離機を使用して、細胞をGの1, 000倍で10分間回転させます。

次に、目に見えるようになった小さな細胞ペレットを乱すことなく緩衝液を静かに除去し、チューブ内に50マイクロリットルの緩衝液を残します。15 mLチューブ内の5ミリリットルの0.1モルカコジル酸緩衝液に200ミリグラムの低融点アガロースを加えて、4%アガロース溶液を調製します。チューブを100mLのガラス瓶の沸騰水に移して、アガロースを溶かします。

細胞懸濁液のチューブに200マイクロリットルのアガロース溶液を加えます。直ちにGの1, 000倍、摂氏30度で10分間遠心分離します。チューブの底にある半固体のアガロースに細胞がペレット化されたことを確認したら、すぐにチューブを摂氏4度または氷に20分間移してアガロースを固めます。

27ゲージの針を使用して、細胞ペレットを含む固化したアガロースを、0.1モルのカコジル酸緩衝液を含む35mLのプラスチックシャーレに慎重に移します。メストリムを使用して、細胞ペレットを含む固化したアガロースを約1〜2ミリメートルの1つのピースにします。その後、新しい1.5mLチューブに移します。

600マイクロリットルの0.1モルカコジル酸緩衝液を添加し、ピペットを使用してアガロース細胞ペレットを洗浄し、緩衝液を添加および除去します。アガロース細胞ペレットから緩衝液を取り出し、防護服と手袋を着用しながら、ドラフト内で1ミリリットルの1%四酸化オスミウム溶液を加えます。細胞ペレットを摂氏4度で1時間インキュベートします。

インキュベーション後、サンプルを3回洗浄します。キャップ付きの20mLガラスシンチレーションバイアルに移します。次に、エタノールシリーズを使用してサンプルを脱水します。

次に、エタノール中のLX 112樹脂の濃度を上げてサンプルに浸透させ、100%樹脂に毎回60分間2回インキュベートします。鉗子を使用して、サンプルをピラミッドチップ形状のゴム型の底に慎重に移し、サンプルの上に純粋な樹脂を加えて型を充填します。サンプルを摂氏60度で72時間インキュベートし、樹脂を重合します。

樹脂が重合したら、ゴム型をひねって型から取り除きます。重合樹脂ピラミッドに小さな黒い細胞のクラスターが見えるはずです。シアノアクリレートを使用して、重合した樹脂ピラミッドを取り付けシリンダーに取り付けて切断します。

ブロックをウルトラミクロトームに取り付けた後、カミソリの刃とダイヤモンドナイフを使用してピラミッドブロックをトリミングし、ブロックの上部と下部が互いに平行で、側面が等角の短くて広い台形を作ります。次に、ダイヤモンドナイフを使用してセルペレットの周りのブロックを切り取り、セルペレットのアガロースピースの周りのプラスチック部分を取り除きます。ウルトラミクロトームで1マイクロメートルの切片をカットし、まつげツールと金属ループを使用して、切片をウォーターボートからスライドガラスに移動します。

次に、スライドを摂氏37度のホットプレートに置き、乾燥させます。0.22μmフィルター付きのシリンジを使用して、テルアチンブルー溶液を切片に一滴加え、3分間インキュベートします。次に、蒸留水でスライドを上げ、切片を乾かします。

乾燥後、光学顕微鏡で切片を確認し、細胞の位置を特定します。次に、ダイヤモンドナイフを使用して極薄切片をカットします。次に、まつげツールを使用して、ウォーターボートから2〜3つのセクションを200メッシュグリッドに移動し、ガラスのペトリ皿に入れます。

グリッド付きの皿を摂氏30度のホットプレートに30分間移し、切片を乾燥させます。1%酢酸ウラニルを滴下し、室温で10分間インキュベートしてグリッドを染色します。次に、蒸留水を使用して6〜8回すすぎます。

Reynoldsのクエン酸鉛で室温で5分間染色した後、6〜8回すすぎます。グリッドが入ったガラスシャーレを摂氏37度のホットプレートに移し、切片を乾燥させます。最後に、87キロボルトの電子顕微鏡で切片を分析します。

ここに低倍率で示されているのは、細胞のクラスターを確認する小さな細胞ペレットを含むブロックからの半薄のトルイジンブルー染色切片です。この高倍率の画像は、細胞の無傷の形態を示しています。この図は、酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色し、電子顕微鏡で分析した極薄切片からの細胞クラスターのオーバービューフィールドを表しています。

ここに示されているのは単一のHSCであり、細胞の形態と超構造が良好に保存されていることを示しています。個々のHSCの高倍率の非常に詳細な電子顕微鏡写真は、細胞内の超構造を示しています。さらに、高倍率画像は、ミトコンドリアなどの細胞内小器官のよく保存された構造と完全性を捉えました。

一度習得すれば、この技術は5〜6時間で実行できますが、高度な青色染色やアガロース包埋の場合、通常のTEM処理は適切に実行されれば5〜6日かかります。このビデオを見れば、TEM分析のために実際の細胞調製からサンプルを調製する方法を十分に理解することができます。