Name: ラット肝臓肝門部クランプモデルを用いたダイレクトセグメント別肝臓内送達方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 学ぶラット肝門部クランプモデルを用いた門脈直接注入法で、虚血再灌流障害における薬理分子の効果を評価します。肝移植研究における治療薬の標的送達と臓器保護戦略の開発に応用可能です。

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私たちは、彼の説明の仕事の​​ためにデニース・マタイアス確認したいと思います。この作品は、NIH T32AI 106704-01A1、オハイオ州立大学の臓器移植、灌流、工学と再生のためのT・フルズチ基金によってサポートされていました。

すべての手順は、施設内動物実験及び実験動物の愛護管理と使用に関する米国学術研究会議・ガイド（IACUC）のガイドラインに従って行ったとオハイオ州立大学IACUC委員会による承認を受けています。 1.初期設定<ol><li>セットアップ手術用顕微鏡と手術室（ 図3、 図4）。麻酔を維持し、バイタルサインを監視するためのものを含むすべての機器の電源をオンにします。電気外科ユニットと温暖化パッドをオンにします。手術台の近くに注入ポンプを配置します。 <ol><li>麻酔注射器に吸入（分子量184.5）のために液体イソフルラン10mLのを描き、麻酔部に配置します。 </li><li>手術台の近くに液体窒素の200mLの容器に、セットアップ及び血液サンプルが処理される遠心分離機の近くにもう。 </li><li>順位外科用器具、4-0及び7-0編み絹縫合糸、滅菌綿棒、4x4の不織布スポンジ、5 mLの注射器、および手術台の近くに27本のゲージのインスリンシリンジをition。 </li></ol></li><li>イソフルランチャンバを準備し、十分なイソフルラン麻酔を誘導送達系に滴下されていることを確認します。 </li></ol>麻酔の誘導2。 <ol><li>手術用マスク、手術用手袋、使い捨てガウン：以下の個人用保護具（PPE）の上に置いたラットを取り扱う前に。 </li><li>ラットを計量し、重量を記録します。 注：SDラットを使用する必要があります。 </li><li>麻酔室にラットを置き、イソフルランと酸素をオンにします。イソフルランチャンバーを用いて麻酔を誘導します。 </li><li>クリーナー露出（ 図5）を可能にするために、電気バリカンを使用して、動物の腹部の毛をクリップ。 </li><li> additioためバックイソフルランチャンバ内に動物を置きNAL 1分。麻酔の深さを確認するために、つま先のピンチを実行します。 </li></ol> 3.手順<ol><li>ノーズコーンと温暖化パッド上の制約やテープで固定化された四肢動物の鼻にラットを置きます。 </li><li> 250グラムを超える計量動物について200〜250 gの4％体重動物について3.6％で麻酔による麻酔送達システム、ノーズコーンとイソフルランを用いて麻酔を続けます。つま先のピンチと皮膚のピンチを実行することにより、麻酔の深さを確認してください。 </li><li>鋭いハサミ（ 図6）を用いて皮膚を介して剣状突起する恥骨から正中腹部切開を行います。 </li><li>剣状突起と膀胱や腸に損傷を与えないように腹部世話を入力するには恥骨から白線に沿って腹膜の切開を行います。肝臓はまた、剣状突起の近くに前方腹膜にこだわっとして、それは前にこのARで腹壁を切開に放出することを確認してくださいEA。 </li><li>肝臓の右葉の下縁のレベルで、皮膚や腹膜を通して横方向の切開を行います。 </li><li>より大きい250gの動物のための200％〜250 gで2計量動物について1.6％に麻酔を断ります。 </li><li>湾曲した蚊のクランプを使用して、剣状突起を後退させます。 </li><li>正中線からできるだけ離れたリブを引く場所リブリトラクタ（ 図7）。偃月形の、横隔膜と胃の靭帯を切りました。湿らせた滅菌綿棒を使用して肝臓を反転します。 </li><li>ポルタへのアクセスを得るために、必要に応じて追加の靭帯を切りました。生理食塩水を湿らせたガーゼ（ 図7）と内臓の回転を行います。 </li><li>シャープまたは鈍的切開を使用してポータル門の上にある疎性結合組織を削除します。門脈の長さを覆う疎性結合組織を削除します。 </li><li>緩い結合トンを押し通すために鉗子を使用して、ウィンドウを作り、左門脈、動脈や胆管に問題の後部とは4-0ポッツ縫合糸を置きますが（ 図8）を押し締めるません。 </li><li>右の腎臓の約レベルで来る門脈に後部ブランチを覆う疎性結合組織オフクリア。この静脈は、カニューレ挿入のために使用されます。 </li><li>インスリン注射器（ 図9）と下大静脈（IVC）から0.5mLの血液を描きます。 、小さなバイアル中で12分間135×gで遠心分離を0.5mLの血液を置き。血清を引き出すしようとします。 <ol><li> 135×gで3分間 - 明確なラインは、赤血球と血清の間には理解できない場合、追加の2ために遠心分離しよう。血清をオフに描画し、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）のためにバイアルに入れます。スナップは、液体窒素の中に直接置くことにより、この試料を凍結します。 </li></ol></li><li>カニューレのために使用される静脈の近くに7-0縫合糸と場所の2枚をカットション。限り内側できるだけこの静脈の周りに最初の7-0のループを置きます。このループを結ぶと曲がった蚊のクランプ（ 図10）を使用して後退するためにそれを使用します。門脈との交差点の近くにカニュレーションのために使用される静脈の2番目7-0のループを置き、1本のネクタイを置くが、ダウン締めるません。 </li><li>試薬3mLで5 mLの注射器で注入ポンプを準備します。プライムチューブ。 </li><li>顕微クランプを使用して、遠位門脈をクランプします。 注：静脈をカニュレーションのために切開されたときにこれが出血を軽減します。 </li><li> 7-0ステー縫合糸と小さな顕微はさみを用いて、門脈との交差点の間に静脈が0.5mmの穴を開け。左門脈系（ 図11、 図12）をカニューレ挿入する27-0カテーテルを使用。左右の門脈の分岐を過ぎてカテーテルを挿入します。 </li><li> infusによってカニューレの配置を確認してください生理食塩水を1ml INGのと白くに肝臓の左側葉および中葉を監視。手動でそのカテーテルを確認し、右門脈の離陸過去ではなく、中葉を供給門脈の離陸を超えています。 </li><li>ポッツ縫合ダウン楽勝と虚血時間を開始します。所定の位置にそれを保持し、遠位門脈からクランプを取り除くために静脈および27-0カテーテルの周りに7-0縫合糸を締めます。 </li><li>注入ポンプを使用してポリエチレングリコール - スーパーオキシドジスムターゼ（PEG-SOD、0.00067グラム/ mL）での注入を開始します。虚血時間の開始にできるだけ近い注入を開始します。 </li></ol> 4.モニタリング<ol><li>点滴を通して動物のバイタルサインを監視し続けます。 15分間にわたって0.9％生理食塩水に溶解し、0.9％生理食塩水またはPEG-SOD（0.00067グラム/ mL）を2mLの2mLのを送達します。 </li></ol> 5.再灌流<ol><li>一時間は私の最初から合格することを許可しますschemic時間。これは暖かい虚血時間の1時間です。 </li><li>ポッツの縫合糸を外します。 27-0カテーテルを削除します。静脈の周りに7-0縫合糸を下に楽勝。時間に注意してください。これは、再灌流の時間をマーク。 </li></ol> 6.継続的なサンプリング<ol><li> 120分後の再灌流にIVCから血液0.5mLのを描きます。赤血球を溶解避けるために、ゆっくりと血液を描画します。ゆっくりとバイアルに血液を滴下します。 IVCからの出血は、各採血後に制御されていることを確認してください。 <ol><li>出血が継続される場合、滅菌綿棒またはガーゼから1cmの部分切断による小さい1センチメートルと穏やかな圧力をかけます。 </li></ol></li><li> 12分間135×gで遠心します。 135×gで3分間 - 十分な分離が達成されない場合、追加の2を試みます。 </li><li> ALTのために後で処理するためにバイアル中で血清の半分を置きます。スナップは、これらの試料を凍結します。 </li></ol> 7.安楽死<ol><li>ラットは、まだ麻酔下IVCとsをカットしている間uperior ヴェナ・キャバ（SVC）と、血流、呼吸や心拍やめるまで監視します。 </li><li>横隔膜を切開し、円形にダイアフラムを切開し、腹膜腔への肝臓を接続のままで追加の結合組織を切開することによって簡単に肝切除を行います。腹膜腔から肝臓を取り出します。 </li><li>肝臓の右葉から肝臓の左葉および中葉から4つのサンプルと4つのサンプルを取ります。試料はできるだけ大きくあるべきであり、そのサイズは、利用可能な肝臓組織の量によって制限されます。小さな標識バイアルにこれらを置き、液体窒素で凍結スナップ。組織アデノシン三リン酸（ADP）、マロンジアルデヒド（MDA）およびグルタチオン（GSH）のために、後の処理のためにこれらを使用してください。 </li></ol> 8.ポスト実験解析<ol><li>診断キットを用いて、グルタチオン（GSH）、マロンジアルデヒド（MDA）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）肝臓組織における活動および血清サンプルを決定します製造元の指示に従って。 </li><li>溶解緩衝液で肝臓組織をホモジナイズし、Bradfordアッセイを用いて定量化します。切断されたカスパーゼ3およびアクチンに対する抗体を用いて、ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびイムノブロットにより組織ライセートを分析します。公に利用可能なソフトウェアで実行ウェスタンブロットを定量化します。 </li></ol>

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</ol>

すべての著者は、彼らが何の開示を持っていない報告しています。

この一連の実験は、実証されているコントロールと比較して、左にPEG-SODとALTのリリースでは有意な減少につながった中央ローブ、細胞膜の脂質過酸化（MDA）、およびグルタチオンのメンテナンス（GSH）の注入（生理食塩水）。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）を含む肝組織トランスアミナーゼは、肝細胞傷害のマーカーを確立しています。左葉をPEG-SODを注入されたALTの減少はPEG-SODの保護効果を示唆しています。増加した組織MDAが増加し、脂質過酸化を示し、酸化ストレスと組織傷害のマーカーと考えられています。活性酸素種の過剰産生は、MDA 26の生産を増加させます。 PEG-SODを注入した動物の左葉および中葉における組織MDAの大幅な減少がPEG-SODの保護効果を示しています。これは、PEG-SODはダメージから細胞を保護することを現在の理解と一致しています部分的に還元活性酸素種27によって引き起こされます。また、活性酸素種の存在下で、グルタチオンジスルフィドはグルタチオン（GSH）28に還元されます。 PEG-SODを注射し、肝臓の左側葉および中葉におけるGSHでメンテナンスがさらにPEG-SODの保護効果を強化します。さらに、虚血 - 再灌流傷害に曝された組織では、切断されたカスパーゼ-3、アポトーシスの積が増加することが実証されています。 PEG-SODで処理した左葉に切断されたカスパーゼ3の減少はPEG-SODは、アポトーシスの減少につながることを示唆しています。 スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）は活性酸素種の解毒に重要な酵素です。酵素は、過酸化水素と水に2つのスーパーオキシドアニオンの変換を触媒します。酵素カタラーゼは、プロセス25を完了し 、水及び酸素に過酸化水素に変換します。の半減期ネイティブSODは、共役ポリエチレングリコール - スーパーオキシドジスムターゼ（PEG-SOD）の開発まで、実験モデルにおけるその使用を制限しました。ポリエチレングリコールのSODの結合は、14時間に6分の半減期を増加させます。グエンら。全身送達29を用いて、ラットモデルにおいて肝臓虚血における脂質過酸化を軽減する能力を実証しました。 技術ここで詳しく説明し、いくつかは、以前に文献に記載されているの潜在的な変更の様々なものがあります。モデルによって使用される分子は、吸入11、硬膜外注入12、腹腔内注射17、18、21、22、静脈内投与の10、14、15を用いて送達されています<su周辺上腸間膜静脈8に&gt; P、19、23、24または注射。 このプロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。最も重要なのは、門脈のカニューレ挿入です。ケアは、静脈にカット穴が大きすぎないように注意しなければなりません。組織は、非常に弾力性があると穴が独自に拡大します。我々は、顕微はさみで0.5mmである穴を切断することによって起動することをお勧めします。カニューレは、手動で手順のこの部分を実行しようとした場合よりも高い敏捷性を可能にする器具を使用して、穴を介して供給することができます。最初にカニューレを送りながらさらに、静脈の後壁に穴を突っつい避けるために、左と右の門脈の分岐部に向けて直接目的としなければなりません。カニューレ先端が分岐部に到達すると、それは、左静脈特異的に供給することができます味方。カニューレが左と中央ローブの両方を提供し、左門脈に供給されると、その位置は、静脈内、それを感じて、手動で確認することができます。その位置は、また、冷食塩水を少量注入し、肝臓の供給セグメントにブランチング効果を見て確認することができます。 ラットにおける肝門部クランプモデルは、肝臓虚血再灌流傷害を実証するための再現性と安定したプラットフォームを提供します。可変肺門クランプモデルは、抗酸化剤および他の小分子6、7、8、9、10、11、12、13、14の保護効果を研究するために研究者によって使用されてきました。変化のポイントは、クランプされた船舶が含ま<html>胆管が含まれているか否か虚血性作られるセグメントED、および再灌流6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18の期間の長さ、 19、20、21。 このモデルは、分子の投与の経路の投与の影響を研究するために使用される場合、さらに、不均一である8、10、11、「&gt; 12、14、15、17、18、19、21、22、23、24に記載の手法にはいくつかの利点がある。まず、虚血性セグメントへのポータル供給の直接挿管が直接分節肝送達を可能にします研究中の薬理学的物質。これは内部コントロールとして肝臓の他のローブの利用を可能にする。第二に、分節肝臓カニュレーションが検討されて分子に対する分布の容積減少を可能にする。このアプローチは、それによってなど、全身副作用のリスクを減少させます物質は、対象の肝臓セグメントに直接注入される。肝臓セグメントの直接挿管が虚血前、送達されるべき物質を可能にします内、虚血または虚血後。これは、虚血再灌流障害サイクルの任意の時点で、分子の効果の研究が可能になります。虚血時間の長さの増加と利用できるようになる肝臓の再生を研究する傷害追加の機会の増加レベルを持ちます。 このアプローチのいくつかの制限もあります。最初は、起動コストです。手術用顕微鏡の購入はすでに1を所有していないラボのための重要なスタートアップコストである可能性があります。この技術は、顕微鏡なしでは困難または不可能であり得ます。第二は、曲線の時間を学んでいます。この手順は比較的簡単ですが、それにはいくつかの練習が必要ですし、初心者が専門家になるための手続きのかなりの数が必要になる可能性が高いです。 要約すると、このモデルは、肝虚血再灌流障害を研究するために、再現性のあるシンプル、かつ費用対効果の高いプラットフォームが可能になります。プロトコルにポリエチレンGLここに記載されているがycol-スーパーオキシドジスムターゼ、フリーラジカル捕捉剤25、注入されたが、このモデルは、肝臓におけるI / R損傷に及ぼす影響を評価するために、異なる薬理学的物質の多様性を注入するために使用することができます。

流入閉塞、および肝臓移植の主要な肝臓手術は、暖かい虚血の期間、及び虚血/再灌流（I / R）傷害1に至る再灌流の期間を必要とします。肝臓でのI / R損傷の影響は広範囲に1、2、3詳述されています。文献に詳述I / R傷害の結果は、次のとおり、反応性酸素種の生成、好中球の活性化を含む炎症カスケードの開始、クッパー細胞、および内皮細胞、Toll様受容体のヘムオキシゲナーゼ系と活性化の活性化、ANをエンドセリンおよび一酸化窒素、核因子κBの活性化および炎症性サイトカインおよび接着分子の合成1、2、3の促進との間の不均衡。これらの前炎症性のイベントかもしれLアポトーシス、壊死、臓器不全および最終的に臓器不全3にEAD。 I /肝移植宛ての器官におけるR損傷は早期移植片喪失につながると限界臓器が傷害3の影響を受けやすいように、現在のドナー不足に寄与することができます。 2015年5で行った米国4における肝移植の待機中リストに15226人の潜在的な受信者のみ5950肝臓移植は現在ありません。臓器の可用性では、この極端な制限のために、肝I / R傷害を探索研究は、移植片機能や臓器の利用率を最適化するために必要とされています。 肝I / R傷害を研究するために使用される動物モデルはラット肺門クランプモデルおよびラット肝移植モデルが含まれます。現在使用中のラット肝門部クランプモデルの様々なものがあります。最も一般的なのは1つである門脈、肝動脈および胆汁デュCT左側葉および中葉は顕微クリップ6、7、8、9、10、11、60分間の再灌流の30次いで分6、7、10、13、14、および60の期間12を用いてクランプされる供給H 7、9、10、13 24、14が許可されています。ラット肝臓の左側葉および中葉は、肝実質9の約70％を含みます。虚血プレコンディショニングを研究するために設計された一部のプロトコルでは、肺門血管の断続的なクランピングが含ままたは肺門血管9、13をクランプすることにより誘導される虚血のより長い期間に後肢先行。文献に記載されているいくつかの変更もあります。最初の左葉および中葉を供給門脈及び肝動脈をクランプするが、胆管15を排除することです。第二の変形例は、前のそれらの分割16、17、18、19、20に門脈、肝動脈、および胆管をクランプすることによって、総肝臓虚血を誘導することです。第三の変形例は、30〜60分間で8右葉に肺門血管のクランプを含みます。さらなる修飾は、21肝臓13に損傷を誘導するために、1つの後肢における血管束をクランプすることを含みます</suP&gt;。肺門クランプ手順に種々のアプローチが、図1A-Dに示されています。 ラット肝門部クランプモデルは、肝臓I / R上の異なる分子および化合物の影響を研究するために使用されてきました。周辺上腸間膜静脈8内に吸入11、硬膜外注入12、腹腔内注射17、18、21、22、静脈内投与の10、14、15、19、23、24、または注射を用いて送達されてきたこれらの分子は、モデルで使用によって。 このレポートはこちらよりで詳述したラットの肝門部クランプのためのモデル研究中の薬理学的物質の直接分節肝送達を可能にする門脈の側枝を介して虚血性セグメント（ 図2）へのポータルの供給ES直接挿管。我々のアプローチは、研究中の物質の注入、その間、この場合には、PEG化スーパーオキシドジスムターゼ、フリーラジカル捕捉剤25は 、虚血性セグメントに直接注入され、60分間放置葉および中葉における虚血を誘導することです。血液サンプルを前、虚血の誘導および120分後の再灌流に取られます。この時点で、ラットを屠殺して、サンプルは左葉および中葉から取得されます。また、サンプルは、内部コントロールとして機能する右葉から採取されます。 このアプローチには多くの利点があります。まず第一に、研究中の薬理学的物質を直接虚血セグメントに注入することができるボリュームOF分布は、全身循環又は腹腔への注射の分布の容積と比較して非常に低いです。 、全身性副作用の可能性を排除しないが、さらに、このアプローチは、減少させます。

<table><tbody><tr><td>スプレイグ・ドーリーラット&nbsp;</td><td>ハーラン・スプレイグ・ドーリー社&nbsp;</td><td>200〜250グラム&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>手術用顕微鏡&nbsp;</td><td>ライカ&nbsp;</td><td>M500-N w / OHS</td><td></td></tr><tr><td>チャコールキャニスターケン</td><td>トサイエンティフィック</td><td>SOMNO-2001-8</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン分子量184.5&nbsp;</td><td>Piramal Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pressure-Lok Precision Analytical シリンジ&nbsp;&nbsp;</td><td>Valco Instruments Co, Inc.&nbsp;</td><td>SOMNO-10ML</td><td></td></tr><tr><td>電気メスユニット</td><td>マカン&nbsp;</td><td>MV-7A</td><td></td></tr><tr><td>ウォーミングパッド</td><td>ブレインツリー・サイエンティフィック&nbsp;</td><td>HHP2</td><td></td></tr><tr><td>SomnoSuite 小動物麻酔システム</td><td>ケント・サイエンティフィック&nbsp;</td><td>SS-MVGモジュール</td><td></td></tr><tr><td>PhysioSuite</td><td>ケントサイエンティフィック&nbsp;</td><td>PS-MSTAT-RT</td><td></td></tr><tr><td>イソフルランチャンバー&nbsp;</td><td>ケントサイエンティフィック</td><td>SOMNO-0530LG</td><td></td></tr><tr><td>SurgiVet</td><td>Isotec</td><td>CDS 9000 卓上</td><td></td></tr><tr><td>酸素&nbsp;</td><td>Praxair</td><td>98015</td><td></td></tr><tr><td>27-0マイクロカニューレ</td><td>Braintreeサイエンティフィック&nbsp;</td><td>MC-28</td><td></td></tr><tr><td>リブリトラクター&nbsp;</td><td>ケント・サイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td>INS600240</tr>ポリエチレン<tr><td>グリコール-スーパーオキシドジスムターゼ(PEG-SOD)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>S9549 SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>GenieTouch</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ノーマル生理食塩水</td><td>Baxter</td><td>NDC 0338-0048-04</td><td></td></tr><tr><td>4 x 4 不織布スポンジ&nbsp;</td><td>基準</td><td>104-2411</td><td></td></tr><tr><td>滅菌 Q-Tips</td><td>ヘンリー・シャイン アニマルヘルス</td><td>1009175</td><td></td></tr><tr><td>U-100 27 ゲージ インスリン注射器</td><td>テルモ</td><td>22-272328</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>BD&nbsp;</td><td>REF 309603</td><td></td></tr><tr><td>4-0 編組シルク縫合糸</td><td>Deknatel, Inc.</td><td>198737LP</td><td></td></tr><tr><td>7-0 編組シルク縫合</td>糸 <td>テレフレックスメディカル&nbsp;</td><td>REF 103-S</td><td></td></tr><tr><td>1.8 mL Arcticle 極低温チューブ</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>1418-7410</td><td></td></tr><tr><td>Microsurgical Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>Company&nbsp;</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</strong</td></tr><tr><td>>小さなはさみ&nbsp;</td><td>ロボズ&nbsp;</td><td>RS-5610</td><td></td></tr><tr><td>大型はさみ</td><td>S&T&nbsp;</td><td>SAA-15</td><td></td></tr><tr><td>鉗子 - ラージアングル</td><td>S&T&nbsp;</td><td>JFCL-7</td><td></td></tr><tr><td>鉗子 - 小角度&nbsp;</td><td>S&T</td><td>FRAS-15 RM-8</td><td></td></tr><tr><td>クリップ アプライヤー</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5440</td><td></td></tr><tr><td>はさみ - ノンマイクロ</td><td>FST 14958-11</td><td>14958-11</td><td></td></tr><tr><td>鉗子 - ストレート チップ&nbsp;</td><td>S&T&nbsp;</td><td>FRS-15 RM8TC</td><td></td></tr><tr><td>大型顕微手術用クリップ</td><td>精密科学ツール</td><td>18055-01</td><td></td></tr><tr><td>小型顕微手術用クリップ</td><td>精密科学ツール</td><td>18055-01</td><td></td></tr><tr><td>小型精密手術用クリップ</td><td>精密科学ツール</td><td>18055-02</td><td></td></tr><tr><td>小型精密手術用クリップ</td><td>精密科学ツール</td><td>18055-03</td><td></td></tr><tr><td>その他の器具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社&nbsp;</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>小さな蚊クランプジェ</td><td>ネリック&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分析&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社&nbsp;<</td><td>strong>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Alannine aminotransferase (ALT) assay&nbsp;</td><td>Biovision</td><td>K752-100</td><td></td></tr><tr><td>Malondialdehye(MDA)アッセイ&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>ab118970</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione (GSH) assay</td><td>Cayman Chemical</td><td>7030002</td><td></td></tr><tr><td>抗体 - Cleaved Caspase-3 and Actin&nbsp;</td><td>Cell Signaling Tecnology</td><td>Antibody 9661</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ ソフトウェア&nbsp;</td><td>国立衛生研究所&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RIPA溶解および抽出バッファー&nbsp;</td><td>ミリポア</td><td>10-188</td><td></td></tr></tbody></table>

ラット肝臓肝門部クランプモデルを用いたダイレクトセグメント別肝臓内送達方法

Method of Direct Segmental Intra-hepatic Delivery Using a Rat Liver Hilar Clamp Model

流入閉塞、および肝移植と主な肝臓の手術は、暖かい虚血の期間、及び虚血/再灌流（I / R）無数の負の影響を持つ怪我につながる再灌流の期間を必要とします。肝移植宛ての限界臓器における潜在的なI / R損傷は減少した臓器の利用率への二次電流ドナー不足に貢献しています。重要な必要性は、移植における移植片機能への影響を仲介するために、肝I / R損傷を探索するために存在します。ラット肝門部クランプモデルは、肝臓I / R損傷における異なる分子の影響を調査するために使用されます。モデルによっては、これらの分子は、周辺上腸間膜静脈に吸入、硬膜外注入、腹腔内注射、静脈内投与または注射を使用して配信されています。ラット肝門部クランプモデルは、I / R傷害の改善に薬理学的分子の影響を研究に使用するために開発されました。 describラット肝門部クランプ用EDモデルは直接セグメント肝送達を可能にする、門脈の側枝を介して虚血性肝セグメントへのポータル供給の直接挿管を含みます。我々のアプローチは、研究対象の物質が注入され、その間に60分間放置葉および中葉に虚血を誘導することです。この場合、ペグ化、スーパーオキシドジスムターゼ（PEG-SOD）、フリーラジカル捕捉剤は、虚血性セグメントに直接注入されます。この一連の実験は、PEG-SODの注入は肝臓I / R傷害に対する保護であることを示しています。このアプローチの利点は、全身性の副作用における分布と減少量の結果として減少に虚血セグメントへの分子の直接注射が含まれます。

この実験は、nの2つの群= 3匹のラットそれぞれを用いて行きました。三人のラットの肝臓を15分間かけて注入ポンプの通常の生理食塩水（NS）の2mLの注射しました。三人のラットの肝臓を15分間かけて注入ポンプを用いてPEG化スーパーオキシドジスムターゼ（PEG-SOD、0.00067グラム/ mL）で混合した生理食塩水の2ミリリットル（NS）を注射しました。上記のプロトコールに記載されているように、血液サンプルを予め肺門クランプおよび120分間の再灌流後に採取しました。さらに、再灌流の120分の4つの肝臓組織サンプルの完了後、左及び中央値葉から採取した四の肝臓試料は、ラット肝臓の右葉から採取しました。 血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）が予め肺門クランプ及び120分の制御におけるポスト再灌流（NS）および（PEG-SOD）実験動物で測定しました。コントロールのALTレベルとの間に有意な差があった（NS）動物プレ肺門クランプ及び120分後の再灌流時。 ALTコントロールのレベル（NS）および実験動物（PEG-SOD）120分で（ 図13A）との間に有意な差がありました。組織マロンアルデヒド（MDA）は、対照（NS）と実験（PEG-SOD）肝臓の右と左の葉の両方の動物について測定しました。制御注入（NS）および実験注射（PEG-SOD）と右葉（非肺門クランプ）における組織MDAは有意差を示しませんでした。対照注射と左葉（ポスト肺門クランプおよび再灌流）組織MDA（NS）は、右葉（非肺門クランプ）p &lt;0.001よりも有意に異なっています。左葉（ポスト肺門クランプおよび再灌流）は、実験噴射対対照注射（NS）（PEG-SOD）p &lt;0.005（ 図13B）で組織MDAの著しく異なるレベルを有します。組織グルタチオン（GSH）は、制御注入（NS）Aと右葉（非肺門クランプ）で測定し、組織グルタチオンましたND実験インジェクション（PEG-SOD）は有意な差を示しませんでした。対照注射と左葉（ポスト肺門クランプおよび再灌流）組織GSH（NS）は、制御注入（NS）は、p &lt;0.05と右葉（非肺門クランプ）よりも有意に異なっています。左葉（ポスト肺門クランプおよび再灌流）が実験的注入（PEG-SOD）p &lt;0.005（ 図13C）に対する制御注入（NS）を有する組織グルタチオンの著しく異なるレベルを有します。ウェスタンブロットは、対照動物の右および左葉を比較行い、肺門クランプおよび再灌流（ 図13D）の後左葉に切断されたカスパーゼ-3の増加を実証します。第二のウェスタンブロットを対照とし、PEG-SOD（ 図13E）で処置した動物の左葉を比較して行きました。これは、PEG-SODで治療した動物の肝臓組織に切断されたカスパーゼ3を減少を示しています。デンシトメトリーもdemonstraを行いました。肝臓組織で切断カスパーゼ3のレベルは、対照動物の右葉（ 図13F）に対する左に増加することをティン。 PEG-SODを注入した実験動物の左葉の肝組織、および生理食塩水を注入した対照動物の左葉の肝組織を、比較では、デンシトメトリーは、動物と比較してPEG-SODで処置した動物で切断カスパーゼ-3を有意に減少を示しコントロール（ 図13G）で処理しました。 <img alt="肝臓の解剖学図;詳細な門脈、肝動脈、胆道枝;医学教育。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54729/54729fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図1"> 図1： 解剖イラスト。ラット肝臓のA.解剖図。 B.ラット肝臓の解剖図。肝臓の左葉および中葉へのポータル茎がクランプされています。左と中央ローブは虚血性です。 C.解剖ラットの肝臓のイラスト。左葉へのポータル茎がクランプされています。左葉が虚血性です。ラットの肝臓のD.解剖イラスト。右葉へのポータル茎がクランプされ、右葉が虚血性です。 <img alt="解剖学的構造を示す血管研究用のカニューレを使用した肝灌流図。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54729/54729fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図2"> 図2： 解剖イラスト。側枝を経由してカニューレを挿入門脈とラットの肝臓の解剖図。肝臓の左葉および中葉へのポータル茎は、縫合糸に囲まれ、微小血管クランプは、維管束の周りに締め付けるために使用されてきました。左と中央ローブは虚血性です。 <img alt="手術器具のセットアップ;道具:はさみ、鉗子、メス。滅菌装置が見えます。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54729/54729fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図3"> 図3： 機器設定アップ。この図は、目を実証します電子機器のセットアップ。 <img alt="精密な作業のための手術用顕微鏡セットアップ。顕微鏡、コントロールパネル、作業台ツールが見えます。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54729/54729fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図4"> 図4： オペレーティングルームセットアップ。この図は、手術室のセットアップを示しています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="室内実験;研究のためにげっ歯類を扱う研究者。生物学的研究手順。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54729/54729fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図5"> 図5： 腹部の毛のトリミング。この図は、腹部の毛のトリミングを示しています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ロード/ 54729 / 54729fig6.jpg」/&gt; 図6： 固定化し、皮膚切開。この図は、ラットおよび皮膚切開の固定化を示しています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="外科的ラットの解剖、解剖学的研究、実験のセットアップ、内臓の展示、組織分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54729/54729fig7.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図7"> 図7： リブリトラクタの配置と内臓摘出。この図は、リブリトラクタの配置や内臓摘出を示しています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="動物の解剖、外科的処置、内臓の露出、解剖学的研究、教育研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54729/54729fig8.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図8"> 図8： 場所縫合糸のMENT。この図は、縫合糸の配置を示しています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="実験研究のための実験ラットの外科的処置、器具の解剖、精密な技術。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54729/54729fig9.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図9"> 図9： 下大静脈から採血。この図は、下大静脈から採血を示しています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig9large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="内臓を示す動物の解剖。教育生物学実験のセットアップ。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54729/54729fig10.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図10"> 図10： 静脈支店縛りと後退。この図は、縛りと後退静脈枝を示しています。 ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig10large.jpg」ターゲット= 『_空白』&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="実験用ラットの外科的処置;解剖学的研究と生物医学研究のための解剖セットアップ。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54729/54729fig11.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図11"> 図11： カニューレ挿入のプロセス。この図は、カニューレ挿入のプロセスを示しています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig11large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="内臓を示すラットの解剖;手術器具が見える。解剖学的研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54729/54729fig12.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図12"> 図12： カニューレ挿入。この図は、カニュレーションを示しています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54729/54729fig12large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> コンテンツ」FO：キープtogether.withinページ= "1"&gt; <img alt="肝虚血再灌流研究;棒グラフ、イムノブロッティング;ALT、MDA、グルタチオンレベル;ペグソード。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54729/54729fig13.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図13"> 図13： 代表的な結果：ラット肝門部クランプモデルを使用してPEG化スーパーオキシドジスムターゼの直接分節肝内配達。 NS =通常の生理食塩水。 PEG-SOD =ペグ化、スーパーオキシドジスムターゼ、ALT =アラニンアミノトランスフェラーゼ、MDAは=マロンジアルデヒド。 A.血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT、μ/ mL）を予め肺門クランプ及び120分後の再灌流の間で比較しました。対照（NS）プレ肺門クランプおよび制御120分後の再灌流時（NS）（P &lt;0.001）との間に有意な差があります。 120分後の再灌流（P &lt;0.05）で対照（NS）と実験群（PEG-SOD）との間に有意な差があります。スチューデントのt検定を用いました。エラーバーは標準偏差を表します。制御注入（NS）ANと右葉（非肺門クランプ）におけるB.組織マロンジアルデヒドD実験インジェクション（PEG-SOD）は有意な差を示しませんでした。制御注入（NS）と左葉（ポスト肺門クランプおよび再灌流）組織マロンジアルデヒドは、右葉（非肺門クランプ）p &lt;0.001よりも有意に異なっています。左葉（ポスト肺門クランプおよび再灌流）が実験的注入（PEG-SOD）p &lt;0.005対対照注射（NS）と組織マロンアルデヒドの著しく異なるレベルを有します。スチューデントのt検定を用いました。エラーバーは標準偏差を表します。制御注入（NS）および実験注射（PEG-SOD）とC.右葉（非肺門クランプ）における組織グルタチオンは有意差を示しませんでした。制御注入（NS）と左葉（ポスト肺門クランプおよび再灌流）組織グルタチオンは、制御注入（NS）は、p &lt;0.05と右葉（非肺門クランプ）よりも有意に異なっています。左葉（ポスト肺門クランプおよび再灌流）を対照と組織グルタチオンの著しく異なるレベルを有するinjectio実験注射（PEG-SOD）P &lt;0.005対N（NS）。スチューデントのt検定を用いました。エラーバーは標準偏差を表します。 D.ウェスタンブロットは、対照動物の右葉（非肺門クランプ）に対する左葉（ポスト肺門クランプおよび再灌流）（生理食塩水）の肝臓組織で切断カスパーゼ-3の増加が実証されました。 E.ウエスタンブロット実証は、コントロール（生理食塩水）で処置した動物と比較して、PEG-SODで処置した動物の肝臓組織で切断カスパーゼ-3を減少させました。切断されたカスパーゼ3の肝臓組織でのF.レベルが有意後肺門クランプおよび再灌流動物（p &lt;0.05）に増加されます。スチューデントのt検定を用いました。エラーバーは標準偏差を表します。 G.は （PEG-SODを注入）実験動物の左葉の肝臓組織及び（生理食塩水を注入した）対照動物の左葉の肝組織を比較すると、中に切断されたカスパーゼ-3が著しく減少されますコントロール（生理食塩水）で処置した動物と比較して、PEG-SODで処理imals。スチューデントのt検定を用いました。エラーバーは標準偏差を表します。

ユニークなラット肝門部クランプモデルは虚血再灌流障害を改善するのに薬理学的分子の影響を研究するために開発されました。このモデルは、直接肝臓送達を可能にする、門脈の分岐を介して虚血性肝セグメントにポータル供給の直接挿管を含みます。

Major hepatic surgery with inflow occlusion, and liver transplantation, necessitate a period of warm ischemia, and a period of reperfusion leading to ...

このユニークなラット肝肺門クランプモデルの全体的な目標は、虚血再灌流障害の改善に関心のある薬理学的分子の影響の研究を可能にすることです。この方法は、虚血再灌流障害を媒介するためにどの分子を肝臓に直接注入できるかという肝移植の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、目的の分子が門脈に直接注入され、分布量が減少することです。この技術の意味は、虚血再灌流障害の軽減のために臓器灌流液に添加される可能性のある分子の試験を可能にするため、すべての臓器の移植にまで及びます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、カニューレ挿入に使用される門脈枝のサイズが小さいため、非常に重要です。つま先をつまんで適切な鎮静レベルを確認することから始め、次にラットを解剖顕微鏡下の加温パッドに置き、手足を拘束します。次に、恥骨から剣状突起まで腹部の正中線を切開し、続いてalba線に沿って腹膜を同様に切開します。膀胱や腸を傷つけないように注意しながら腹部に入り、剣状突起の近くの腹膜から肝臓を解放します。肝臓の右葉の下縁にある皮膚と腹膜を横切開し、湾曲した蚊クランプを使用して剣状突起を引っ込めます。リブリトラクターを使用して、正中線からできるだけ離れた肋骨を開き、鎌状靭帯、横隔膜靭帯、胃靭帯を切断します。次に、湿らせた滅菌綿棒を使用して肝臓を跳ね上げ、必要に応じて追加の靭帯を切断してポルタにアクセスします。生理食塩水で湿らせたガーゼを使用して、肝臓を内臓で回転させ、次に門脈の上にある緩い結合組織と、門脈の長さを覆っている緩い結合組織を取り除きます。鉗子を使用して、左門脈、動脈、胆管の後方にある緩い結合組織を押し込んで窓を作り、4-0 Potts縫合糸で血管をゆるく包み込みます。次に、右腎臓の門脈の後枝を覆っている緩い結合組織を取り除きます。次に、インスリン注射器を使用して、下大静脈から0.5ミリリットルの血液を採取し、血液を小さなバイアルに移します。サンプルを遠心分離し、血清を新しいバイアルに集めて、液体窒素でスナップ凍結します。7-0縫合糸を2枚カットします。最初の7-0ループを左門脈の周りのできるだけ内側に配置し、湾曲した蚊クランプを使用して静脈を引っ込めます。ポータル静脈との交点近くのポータル静脈の後枝に、緩く結ばれた2番目の7-0ループを配置します。次に、0.9%生理食塩水に3ミリリットルの試薬が入った5ミリリットルの注射器を輸液ポンプにロードし、チューブをプライミングします。マイクロサージェリークランプを使用して遠位門脈をつかみ、カニューレ挿入中の出血を減らし、小さなマイクロサージェクリーハサミを使用して、7-0ステー縫合糸と門脈との交差部との間の静脈に0.5ミリメートルの穴を開けます。27-0カテーテルを使用して、左門脈系をカニューレ挿入し、左右の門脈の分岐部を越えてカテーテルを挿入します。1ミリリットルの生理食塩水を注入してカニューレの配置を確認し、肝臓の左外側葉と正中葉が湯通しするのを観察します。カテーテルが右門脈の離陸を過ぎているが、正中葉に供給されている門脈の離陸を超えていないことを手動で評価し、ポッツ縫合糸を締め、カテーテルを7-0縫合糸で固定し、遠位門脈からクランプを取り外します。直ちに2ミリリットルの目的の試薬の注入を15分間の送達期間にわたって開始し、注入全体を通じて動物のバイタルサインを継続的に監視します。虚血時間の開始から 1 時間後に、ポッツ縫合糸とカテーテルを取り外し、門脈の後枝に 7-0 縫合糸を締めます。再灌流を開始してから2時間後、下大静脈から0.5ミリリットルの血液をゆっくりと採取し、続いて血液を新しいバイアルにゆっくりと点滴移します。必要に応じて、静脈からの出血を止めるために穏やかな圧力をかけます。次に、血液を遠心分離し、先ほど示したように、血清の半分を凍結して下流の処理を行います。実験のエンドポイントで、横隔膜を円状に切開し、肝臓と腹腔を接続したままの追加の結合組織を切断します。肝臓を採取し、左葉と正中葉から4つの大きなサンプルを採取し、右葉から4つの大きなサンプルを採取します。次に、サンプルを個々の標識バイアルに入れ、下流の処理のために組織を液体窒素でスナップ凍結します。生理食塩水およびPEG-SODを注入した肺門クランプ動物における血清アラニンアミノトランスフェラーゼの測定は、再灌流後120分での血清コントロールと実験動物の肝酵素発現レベルとの間に有意差を示しています。右側の非肺門クランプローブにおける組織マロンジアルデヒドの発現は、対照群と実験群との間に有意差を示さなかった。ただし、左の肺門後クランプと再灌流ローブは、コントロールの非再灌流、非注入ローブ、および右側のPEG-SOD注入ローブと比較して、組織マロンジアルデヒド発現のレベルが有意に高いことを示しています。組織グルタチオンの発現についても同じパターンが観察されます。ウェスタンブロット分析では、PEG-SOD注入で治療された動物では、肺門クランプおよび再灌流後の左葉における切断されたカスパーゼ-3の発現レベルが増加し、デンシトメトリーによって有意な差が確認されていることが示されました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば3時間30分で完了することができます。この手順を試みる際には、遠位門脈クランプを配置するときに、カニューレ挿入のために門脈枝にかなりの牽引力を得ることを覚えておくことが重要です。この手順を習得すると、さまざまな薬理学的物質の影響を調査するために使用できます。このビデオを見た後、左門脈系にカニューレを抜く方法についてよく理解しているはずです。

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