ラット肝臓肝門部クランプモデルを用いたダイレクトセグメント別肝臓内送達方法

このユニークなラット肝肺門クランプモデルの全体的な目標は、虚血再灌流障害の改善に関心のある薬理学的分子の影響の研究を可能にすることです。この方法は、虚血再灌流障害を媒介するためにどの分子を肝臓に直接注入できるかという肝移植の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、目的の分子が門脈に直接注入され、分布量が減少することです。

この技術の意味は、虚血再灌流障害の軽減のために臓器灌流液に添加される可能性のある分子の試験を可能にするため、すべての臓器の移植にまで及びます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、カニューレ挿入に使用される門脈枝のサイズが小さいため、非常に重要です。つま先をつまんで適切な鎮静レベルを確認することから始め、次にラットを解剖顕微鏡下の加温パッドに置き、手足を拘束します。

次に、恥骨から剣状突起まで腹部の正中線を切開し、続いてalba線に沿って腹膜を同様に切開します。膀胱や腸を傷つけないように注意しながら腹部に入り、剣状突起の近くの腹膜から肝臓を解放します。肝臓の右葉の下縁にある皮膚と腹膜を横切開し、湾曲した蚊クランプを使用して剣状突起を引っ込めます。

リブリトラクターを使用して、正中線からできるだけ離れた肋骨を開き、鎌状靭帯、横隔膜靭帯、胃靭帯を切断します。次に、湿らせた滅菌綿棒を使用して肝臓を跳ね上げ、必要に応じて追加の靭帯を切断してポルタにアクセスします。生理食塩水で湿らせたガーゼを使用して、肝臓を内臓で回転させ、次に門脈の上にある緩い結合組織と、門脈の長さを覆っている緩い結合組織を取り除きます。

鉗子を使用して、左門脈、動脈、胆管の後方にある緩い結合組織を押し込んで窓を作り、4-0 Potts縫合糸で血管をゆるく包み込みます。次に、右腎臓の門脈の後枝を覆っている緩い結合組織を取り除きます。次に、インスリン注射器を使用して、下大静脈から0.5ミリリットルの血液を採取し、血液を小さなバイアルに移します。

サンプルを遠心分離し、血清を新しいバイアルに集めて、液体窒素でスナップ凍結します。7-0縫合糸を2枚カットします。最初の7-0ループを左門脈の周りのできるだけ内側に配置し、湾曲した蚊クランプを使用して静脈を引っ込めます。

ポータル静脈との交点近くのポータル静脈の後枝に、緩く結ばれた2番目の7-0ループを配置します。次に、0.9%生理食塩水に3ミリリットルの試薬が入った5ミリリットルの注射器を輸液ポンプにロードし、チューブをプライミングします。マイクロサージェリークランプを使用して遠位門脈をつかみ、カニューレ挿入中の出血を減らし、小さなマイクロサージェクリーハサミを使用して、7-0ステー縫合糸と門脈との交差部との間の静脈に0.5ミリメートルの穴を開けます。

27-0カテーテルを使用して、左門脈系をカニューレ挿入し、左右の門脈の分岐部を越えてカテーテルを挿入します。1ミリリットルの生理食塩水を注入してカニューレの配置を確認し、肝臓の左外側葉と正中葉が湯通しするのを観察します。カテーテルが右門脈の離陸を過ぎているが、正中葉に供給されている門脈の離陸を超えていないことを手動で評価し、ポッツ縫合糸を締め、カテーテルを7-0縫合糸で固定し、遠位門脈からクランプを取り外します。

直ちに2ミリリットルの目的の試薬の注入を15分間の送達期間にわたって開始し、注入全体を通じて動物のバイタルサインを継続的に監視します。虚血時間の開始から 1 時間後に、ポッツ縫合糸とカテーテルを取り外し、門脈の後枝に 7-0 縫合糸を締めます。再灌流を開始してから2時間後、下大静脈から0.5ミリリットルの血液をゆっくりと採取し、続いて血液を新しいバイアルにゆっくりと点滴移します。

必要に応じて、静脈からの出血を止めるために穏やかな圧力をかけます。次に、血液を遠心分離し、先ほど示したように、血清の半分を凍結して下流の処理を行います。実験のエンドポイントで、横隔膜を円状に切開し、肝臓と腹腔を接続したままの追加の結合組織を切断します。

肝臓を採取し、左葉と正中葉から4つの大きなサンプルを採取し、右葉から4つの大きなサンプルを採取します。次に、サンプルを個々の標識バイアルに入れ、下流の処理のために組織を液体窒素でスナップ凍結します。生理食塩水およびPEG-SODを注入した肺門クランプ動物における血清アラニンアミノトランスフェラーゼの測定は、再灌流後120分での血清コントロールと実験動物の肝酵素発現レベルとの間に有意差を示しています。

右側の非肺門クランプローブにおける組織マロンジアルデヒドの発現は、対照群と実験群との間に有意差を示さなかった。ただし、左の肺門後クランプと再灌流ローブは、コントロールの非再灌流、非注入ローブ、および右側のPEG-SOD注入ローブと比較して、組織マロンジアルデヒド発現のレベルが有意に高いことを示しています。組織グルタチオンの発現についても同じパターンが観察されます。

ウェスタンブロット分析では、PEG-SOD注入で治療された動物では、肺門クランプおよび再灌流後の左葉における切断されたカスパーゼ-3の発現レベルが増加し、デンシトメトリーによって有意な差が確認されていることが示されました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば3時間30分で完了することができます。この手順を試みる際には、遠位門脈クランプを配置するときに、カニューレ挿入のために門脈枝にかなりの牽引力を得ることを覚えておくことが重要です。

この手順を習得すると、さまざまな薬理学的物質の影響を調査するために使用できます。このビデオを見た後、左門脈系にカニューレを抜く方法についてよく理解しているはずです。