Name: CNSへの標的化物質送達のためのマウス顕微注入法経由で内頸動脈 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: 学ぶマウス顕微注入法による内頸動脈を経由した脳内標的物質送達。神経ネットワークの保全と最小侵襲性を実現し、薬物や病原体、エクソソームの脳内作用を研究する効果的な神経科学手法です。

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このモデルを私たちの研究室で初めて確立したLei Chen博士(ニューヨーク州マウントサイナイのアイカーン医科大学)と、この技術を私たちの研究室で広めてくださったGretchen Wolff博士(ドイツがん研究センター、ハイデルベルク、ドイツ)に感謝します。HL126559、DA039576、MH098891、MH63022、MH072567、DA027569、NSC 2015/17/B/NZ7/02985 で一部サポートされています。

以下のプロトコルに関係する手順は、マイアミ大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。また、すべての手順は、実験動物管理・インターナショナルの評価と認定協会（AAALAC）によって承認された施設で行われています。 手術のためのマウスの作製<ol><li>実験室麻酔システムを使用して、酸素と混合イソフルランでマウスを麻酔。 （材料表を参照してください）商用マシンに2 L / minで％と酸素の流れ4-5との間で設定でイソフルランを使用してください。実体顕微鏡下で、手術の表面に動物を移し、ノーズコーンを使用して麻酔を維持（ - 2 L / minで2.5と酸素流量1.5を設定イソフルランを使用します）。 <ol><li>あえぎなし2呼吸/秒 - マウス呼吸数は約1であることを確認してください。また、動物は、ウィスカ刺激反応とペダルrを示さないことを確認eflex（つま先ピンチ）。手術中の呼吸数と労力、少なくとも5分ごとに監視します。齧歯類麻酔監視のために特定の施設内動物管理使用委員会や獣医のガイドラインに従ってください。 </li></ol></li><li>乾燥を防ぐために無菌の綿棒を使用して、各眼に点眼潤滑剤の液滴を適用します。抗炎症や不快感を軽減するために鎮痛剤の投与が推奨されます。 </li><li>動物がその背中の上に横たわると、ノーズコーンを使用して麻酔を維持します。 </li><li>エタノール70％とクロルヘキシジンと面積を3回拭くことによって、動物の首のエリアを清掃してください。 （詳細は下記）カミソリを使用して、動物の手術のエリアを剃ります。 </li></ol>一般的な頸動脈の2解剖（CCA） <ol><li>実体顕微鏡下で全体のマイクロサージェリーの手順を実行します。手術用ハサミとピンセットを使用すると、胸骨上からトン以下に、首に浅い正中切開を行います彼の顎（約3〜4センチ）。 </li><li>鉗子を注意深く別個の脂肪および結合組織を使用して気管を露出させます。 </li><li>さらにエリアを露出し、首を拡張するために、マウスの首の後ろに枕（丸い物体、直径約0.5cm）を配置します。 </li><li>組織リトラクターやフックのいずれかを使用して組織を分離します。 </li><li>気管の動物の左側には、慎重に左CCAを露出させるために結合組織を離れてピンセットで抜きます。 </li><li>鉗子を使用して、慎重にCCAの分岐部を露出させるために、すべての結合組織、および外部と内部の両方の頸動脈の先頭を削除します。 </li></ol>物質の注入のためのCCAの調製<ol><li>鉗子を使用して、外頸動脈（ECA）の下にナイロン縫合糸の二つのセグメント（約1cmずつ）挿入します。 </li><li> ECAの可能な限り最高の時点での恒久的な結び目を置きます。 </li><li> ECAの可能な最低点、すぐにCCA分岐上記の場所で取り外し可能な結び目。この結び目は、上部の結び目に比べて緩いすべきです。 </li><li>可能な限り低い点で、血管クリップを使用して、CCAを閉じます。 </li><li>血管クリップを使用して、内頸動脈（ICA）を閉じます。 </li><li>使用して顕微解剖春のはさみは2ノットの間、ECA（約2mm）の小さなカットを行います。 </li></ol> ICA を介した 4物質注入<ol><li>輸液システムを組み立てます。注入される物質を250μl（薬物、病原体、細胞外ベシクル、とりわけ）を含むツベルクリン注射器にと行っ切開部に静かにキャピラリー先端を挿入します。キャピラリーチューブの6インチ（X 1.2ミリメートル2.5ミリメートル理想的な寸法）を取り付けステップ3.6インチ</li><li>それが分岐し、CCAを閉じるクリップの中間点に達するまで毛細管を下にスライドし続けます。 </li><li>下ECAの結び目を下に接続します。結び目は、毛細管流動を可能にするのに十分な緩みとleakinを防止するのに十分タイトであることを確認しますグラム。 </li><li> ICAからクリップを削除します。 </li><li>ゆっくりと注射器ピストン可能物質の点滴毎秒約10μlに圧力を加えます。 </li></ol> 5.注入後の手順<ol><li>バックICA上のクリップを配置します。 </li><li>静かにキャピラリーチューブを取り外します。 </li><li>完全に下ECAの結び目を下に接続します。 </li><li> ICAとCCAからクリップを削除します。 </li></ol> 6.切開閉会と術後ケア<ol><li>開創または組織フックと枕を削除します。 </li><li>滅菌生理食塩水を使用して、きれいな縫合エリア。 </li><li>ナイロン縫合糸/針とピンセットを用いて切開を閉じます。 </li><li>術後の不快感を軽減するために、抗炎症および鎮痛管理します。 </li><li>少なくとも1時間とモニタ回復のための加熱パッド上に配置されたケージに動物を置きます。 </li></ol>

<ol><li>Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+microport+technique+for+applications+in+cerebrovascular+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research.</a> J Neurosci Res. 87 (7), 1718-1727 (2009).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで説明する輸液顕微は、本体1、12を通じて不要な普及を防止する、CNSに様々な生物学的特徴の外因性物質を提供する上で非常に成功することが証明されています。血液脳関門の破壊は、いくつかのCNS関連疾患の病理学的特徴です。したがって、血液脳関門と外因性物質の関係を評価することは非常に重要かつ興味深いものです。 提示され、この手術モデルは、動物に限定外傷を引き起こし、非常に低い死亡率1、12に関連しています。また、手順は、CNSの機能又は脳血流1、12と干渉しません。この手順の最も重要な側面は、のみを許可すべきであるECAでの正しいカットを実行することですキャピラリーチューブを挿入します。広いカットが反対サイト上の他のECAの手術を必要...

中枢神経系のin vivoモデル（CNS）疾患は、脳の中に、このような薬物、病原体、またはエキソソームなどの外因性物質の効果的な送達を必要とします。したがって、理想的な配信方法は、動物に最小限の外傷を引き起こす神経ネットワークの整合性を維持し、脳の1の高い物質の濃度を達成する必要があります。 局所物質送達のいくつかの外科的方法は、内シース、脳内、及び脳室内注射またはインプラント2、3、4、5を含む、記載されています。これらのアプローチは、しかし、CNSへの外傷と考えられており、目的の物質の唯一の少量の投与を可能にしています。また、外因性の物質が急速に脳脊髄液6によって除去することができることが示唆されています</s&gt;まで、および上記の技術が使用されるときに脳実質への低い浸透範囲が7観察されています。それらは他の器官8,9による取り込みに起因するCNSに物質を送達するの低い有効性を示すものの、経口、肺、皮下、および静脈内経路などの全身送達方法は、より一般的に、動物モデルにおいて使用されています。したがって、これらの送達経路は、副作用および毒性10,11のリスクを増加させる、投与物質の高められた用量を必要とします。 ここでは、効果的に内頸動脈を介して脳に直接物質を提供するマウス輸液顕微法を、説明します。 CNSへの送達を標的化することに加えて、この技術は、正常な生理学的障壁を迂回し、従ってバイオロジカに非常に関連していません脳への治療薬または病原体の通路に関与リットルを処理します。

<table><tbody><tr><td>麻酔器</td><td>Vetequip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>外科用ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14558-09</td><td></td></tr><tr><td>外科用鉗子ストレートチップ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>00108-11</td><td></td></tr><tr><td>外科用鉗子 先端角度付き</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>00109-11</td><td></td></tr><tr><td>スプリングハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>ナイロン縫合糸</td><td>Braintree Scientific</td><td>SUT-S 104</td><td></td></tr><tr><td>毛細管 (Micro-Renathane 0.010" x 0.005" per ft.)&nbsp;</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE01050</td><td></td></tr><tr><td>Closing Suture</td><td>VWR</td><td>95057-036</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride</td><td>FisherScientific</td><td>50-121-8005</td><td></td></tr></tbody></table>

cnsへの標的化物質送達のためのマウス顕微注入法経由で内頸動脈

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

中枢神経系(CNS)疾患の動物モデル、そしてその結果として血液脳関門破壊疾患のモデルは、脳内への外因性物質の送達を必要とします。これらの外因性物質は、有害な影響を誘発したり、治療戦略を構成したりする可能性があります。外因性物質の脳への最も一般的な送達方法は、皮下または静脈内経路などの全身送達に基づいています。これらのアプローチは一般的に使用されていますが、脳への送達効果が低いなど、いくつかの制限があります。対照的に、物質をCNSに局所的に送達する外科的方法は、より特異的であり、他の臓器による外因性物質の取り込みを防ぎます。CNS送達にはいくつかの外科的方法があります。しかし、彼らは非常にトラウマになる傾向があります。ここでは、外傷を最小限に抑え、正常な中枢神経系の機能に支障をきたさずに、内頸動脈を介して脳に物質を効果的に送達するマウス注入マイクロサージェリー技術について説明します。

ここに記載のマウス注入顕微法は、非常に多用途であり、脳転移の形成1、12の代表的なモデルでの腫瘍細胞の送達を含む、直接脳内に異なる物質を送達するために使用されてきました。 この技術はまた、CNS内の異なる病原体の病理学的側面を評価するのに適しています。 HIV感染症のマウスモデルでは、注入手術はCCAに直接ウイルス粒子を注入するために使用しました。我々は、7日目、手術後、CNSは、リアルタイムPCRにより、HIVに対して陽性であることがわかりました。また、同側半球感染は6-10半球（ 図2）よりも高い折り目ました。 ここで説明する注入手術の別の適切なアプローチが提供することです CN...

現在のプロトコルは、内部頸動脈を介して物質を直接脳に効果的に送達するマウスのマイクロサージェリー注入技術を説明しています。

CNSへの標的化物質送達のためのマウス顕微注入法経由で内頸動脈

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

この外科的技術の全体的な目標は、頭蓋骨を貫通せずに外因性物質をマウスの脳に送達することです。この方法は、脳内の薬物、病原体、エクソソームの作用に関する神経科学の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、動物への外傷を最小限に抑え、ニューロンネットワークの完全性を維持し、脳内の物質の高濃度を達成することです。まず、酸素と混合したイソフルランを投与して、誘導チャンバーでマウスに麻酔をかけます。麻酔導入後、動物を実体顕微鏡下で手術面に移し、鼻円錐を配置して麻酔の手術面を維持します。呼吸数があえぎ声を出さずに、1秒間に約1〜2回の呼吸であることを確認してください。さらに、動物がひげの刺激やつま先のつま先つまみに反応しないようにしてください。滅菌綿棒を使用して、乾燥を防ぐために各眼に眼科用潤滑剤を一滴塗布します。手術部位をカミソリで剃った後、70%エタノールとクロルヘキシジンでその部分を準備します。実体顕微鏡を覗きながら、手術用ハサミと鉗子を使用して、胸骨の上から顎の下まで首に正中線を切開します。鉗子を使用して、脂肪組織と結合組織を慎重に分離し、気管を露出させます。次に、直径約0ポイント5センチの柔らかく丸い物体を首の後ろの下に置いて、首を伸ばし、その領域をさらに露出させます。次に、フックまたはティッシュリトラクターを使用して気管の周りの組織を分離します。気管の左側で、結合組織を慎重につまんで離し、左総頸動脈(CCA)を露出させます。鉗子を使用して、すべての結合組織を慎重に除去し、外部頸動脈と内部頸動脈の両方の開始部にあるCCA分岐部を露出させます。ECAとICAが露出したら、鉗子を使用して、1センチメートルのナイロン縫合糸の一部を外部頸動脈の下に配置します。次に、2 つ目の 1 センチメートルのセグメントを配置します。次に、ECAの可能な限り高い位置で恒久的な結び目を結びます。ECAの可能な限り低い位置、CCA分岐点のすぐ上で、緩くて取り外し可能な結び目を結びます。次に、ベッセルクリップを使用して、可能な限り低いポイントでCCAを閉じ、ICAを閉じます。外頸動脈に小さな切り込みを入れる前に内頸動脈を適切に閉じると、出血を防ぐことができます。次に、マイクロダイセクションスプリングハサミを使用して、2つの結び目の間にECAに2ミリメートルの切り込みを入れます。大きな切り傷は注入する物質の漏れを引き起こすため、切り傷を小さく保つことが重要です。注入する物質が250マイクロリットル含まれているツベルクリン注射器に6インチの毛細管を取り付けて、輸液システムを組み立てます。次に、キャピラリーチューブの先端をECAの切開部にそっと挿入します。分岐部とCCAのクリップの中間に達するまで、先端を前進させ続けます。下部のECAノットを結びます。結び目が毛細管の流動性を可能にするのに十分緩く、漏れを防ぐのに十分なほど締まっていることを確認します。次に、ICAからクリップを取り外します。シリンジピストンに静かに圧力をかけ、毎秒約10マイクロリットルで物質を注入できるようにします。試験物質を注入した後、クリップをICAに戻します。キャピラリーチューブをそっと取り外します。次に、下部のECAノットを完全に結びます。ICAとCCAからクリップを取り外します。次に、リトラクターまたはティッシュフックと枕を取り外します。滅菌生理食塩水で縫合する領域を洗浄し、ナイロン縫合糸を使用して切開部を閉じます。承認された抗炎症剤と鎮痛剤を投与して術後の不快感を緩和した後、動物を加熱パッドのケージに少なくとも1時間置き、回復を監視します。このヒストグラムは、左内頸動脈を介したウイルス注入の7日後のリアルタイムPCRによるHIV検出を示しています。予想通り、ウイルスのレベルは左半球で高くなっています。この免疫蛍光画像は、内頸動脈を介した細胞外小胞注入後のエキソソームマーカーであるGFPタグCD63を描いたマウス脳切片を示しています。緑色で示されている細胞外小胞を発現するCD63は、マウスの脳微小血管と関連しています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば20分で完了します。この技術は、その開発後、神経変性疾患の分野の研究者がマウスの薬物、病原体、およびエクソソームの相互作用を調査する道を開きました。

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出典:Lim, M., et al.がん細胞の内部頸動脈注射による脳転移のモデリング。J. Vis.

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出典: Leda, A. R., et al.内頸動脈を経由する中枢神経系への標的物質送達のためのマウス顕微手術注入技術J. Vis. 経験。(2017年)このビデオでは、内頸動脈 (ICA) を介して脳への試験物質の標的注入を促進するように設計された顕微手術手順を示します。この手順には、血流を一時的に制限し、制御された送達を確保するための正確な縫合と血管操作が含まれます。毛細血管が外頸動脈 (ECA)...

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