CNSへの標的化物質送達のためのマウス顕微注入法経由で内頸動脈
2017年1月31日
現在のプロトコルは、内部頸動脈を介して物質を直接脳に効果的に送達するマウスのマイクロサージェリー注入技術を説明しています。
この外科的技術の全体的な目標は、頭蓋骨を貫通せずに外因性物質をマウスの脳に送達することです。この方法は、脳内の薬物、病原体、エクソソームの作用に関する神経科学の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、動物への外傷を最小限に抑え、ニューロンネットワークの完全性を維持し、脳内の物質の高濃度を達成することです。
まず、酸素と混合したイソフルランを投与して、誘導チャンバーでマウスに麻酔をかけます。麻酔導入後、動物を実体顕微鏡下で手術面に移し、鼻円錐を配置して麻酔の手術面を維持します。呼吸数があえぎ声を出さずに、1秒間に約1〜2回の呼吸であることを確認してください。
さらに、動物がひげの刺激やつま先のつま先つまみに反応しないようにしてください。滅菌綿棒を使用して、乾燥を防ぐために各眼に眼科用潤滑剤を一滴塗布します。手術部位をカミソリで剃った後、70%エタノールとクロルヘキシジンでその部分を準備します。
実体顕微鏡を覗きながら、手術用ハサミと鉗子を使用して、胸骨の上から顎の下まで首に正中線を切開します。鉗子を使用して、脂肪組織と結合組織を慎重に分離し、気管を露出させます。次に、直径約0ポイント5センチの柔らかく丸い物体を首の後ろの下に置いて、首を伸ばし、その領域をさらに露出させます。
次に、フックまたはティッシュリトラクターを使用して気管の周りの組織を分離します。気管の左側で、結合組織を慎重につまんで離し、左総頸動脈(CCA)を露出させます。鉗子を使用して、すべての結合組織を慎重に除去し、外部頸動脈と内部頸動脈の両方の開始部にあるCCA分岐
部を露出させます。ECAとICAが露出したら、鉗子を使用して、1センチメートルのナイロン縫合糸の一部を外部頸動脈の下に配置します。次に、2 つ目の 1 センチメートルのセグメントを配置します。次に、ECAの可能な限り高い位置で恒久的な結び目を結びます。
ECAの可能な限り低い位置、CCA分岐点のすぐ上で、緩くて取り外し可能な結び目を結びます。次に、ベッセルクリップを使用して、可能な限り低いポイントでCCAを閉じ、ICAを閉じます。外頸動脈に小さな切り込みを入れる前に内頸動脈を適切に閉じると、出血を防ぐことができます。
次に、マイクロダイセクションスプリングハサミを使用して、2つの結び目の間にECAに2ミリメートルの切り込みを入れます。大きな切り傷は注入する物質の漏れを引き起こすため、切り傷を小さく保つことが重要です。注入する物質が250マイクロリットル含まれているツベルクリン注射器に6インチの毛細管を取り付けて、輸液システムを組み立てます。
次に、キャピラリーチューブの先端をECAの切開部にそっと挿入します。分岐部とCCAのクリップの中間に達するまで、先端を前進させ続けます。下部のECAノットを結びます。
結び目が毛細管の流動性を可能にするのに十分緩く、漏れを防ぐのに十分なほど締まっていることを確認します。次に、ICAからクリップを取り外します。シリンジピストンに静かに圧力をかけ、毎秒約10マイクロリットルで物質を注入できるようにします。
試験物質を注入した後、クリップをICAに戻します。キャピラリーチューブをそっと取り外します。次に、下部のECAノットを完全に結びます。
ICAとCCAからクリップを取り外します。次に、リトラクターまたはティッシュフックと枕を取り外します。滅菌生理食塩水で縫合する領域を洗浄し、ナイロン縫合糸を使用して切開部を閉じます。
承認された抗炎症剤と鎮痛剤を投与して術後の不快感を緩和した後、動物を加熱パッドのケージに少なくとも1時間置き、回復を監視します。このヒストグラムは、左内頸動脈を介したウイルス注入の7日後のリアルタイムPCRによるHIV検出を示しています。予想通り、ウイルスのレベルは左半球で高くなっています。
この免疫蛍光画像は、内頸動脈を介した細胞外小胞注入後のエキソソームマーカーであるGFPタグCD63を描いたマウス脳切片を示しています。緑色で示されている細胞外小胞を発現するCD63は、マウスの脳微小血管と関連しています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば20分で完了します。
この技術は、その開発後、神経変性疾患の分野の研究者がマウスの薬物、病原体、およびエクソソームの相互作用を調査する道を開きました。
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概要
本プロトコルでは、内頸動脈を介して脳内に物質を直接注入するマウス微小外科注入法について解説します。この手法は、脳内での高い物質濃度を達成しつつ、外傷を最小限に抑え、ニューロンの完全性を維持することが可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 微小外科
- 物質輸送
背景
- 脳内における薬理作用の解明。
- 病原体およびエクソソームの影響の調査。
- 実験中の動物へのトラウマの最小化。
- 神経ネットワークの完全性の維持。
研究目的
- 頭蓋骨を貫通させずに外来物質を届けること。
- 神経科学研究を促進すること。
- 脳内で物質の高濃度を達成すること。
使用方法
- 麻酔のため、酸素に混合したイソフルランを投与する。
- マウスを実体顕微鏡下の手術台へ移動させる。
- 麻酔を維持するためにノーズコーンを装着する。
- 処置中の呼吸数をモニタリングする。
主な結果
- マウス脳への物質の効率的な導入。
- 動物への侵襲の最小化。
- 神経ネットワークの完全性の維持。
- 脳内における物質の高濃度達成。
結論
- この手法は脳機能の研究に有効です。
- 本手法は、従来の方法よりも侵襲性の低い代替手段を提供します。
- 今後の応用例としては、薬剤テストや疾患モデリングなどが考えられます。
よくある質問
業界における重要性
血液脳関門およびオフターゲットへの全身曝露のため、標的を絞った中枢神経系（CNS）への送達は、神経治療薬の探索における重要な課題であり続けています。この顕微外科的注入法により、試験剤をマウス脳へ直接、精密かつ高濃度に送達することが可能となり、メカニズムのデリスキング（リスク低減）とトランスレーショナルモデルの忠実性が向上します。低侵襲であり、神経細胞の完全性を保持できるため、初期段階のターゲットバリデーションおよび前臨床CNS研究において非常に有用です。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 全身性の障壁を回避することで、中枢神経系（CNS）標的に対する直接的な検証が可能になります。
- 脳組織における薬剤、病原体、またはエクソソームの作用に関する機序研究を支援します。
- 混絡要因となる外傷を最小限に抑え、機能的な標的バリデーションを促進します。
- CNS標的ポートフォリオの予測信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ダウンストリームの薬力学試験またはバイオマーカーアッセイに向けた、バリデーション済みのin vivo CNSモデルを調製します。
- 定量的アウトカム測定のため、再現性のある局所投与を確実にします。
- 全身投与経路と比較して、ばらつきを低減します。
- 化合物の脳移行性と効果の信頼性の高い評価を可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルなバイオマーカー研究に適した、疾患関連の中枢神経系（CNS）モデルに適合しています。
- 神経ネットワークを維持することで、創薬から前臨床検証までの連続性を確保します。
- CNS標的候補物質のリスク調整された開発推進をサポートします。
- 神経変性疾患および感染性CNS疾患のメカニズムを研究するためのプラットフォームを提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この注入技術は、初期探索と前臨床の中枢神経系（CNS）研究の接点に位置し、リード最適化の前に、メカニズム研究やターゲットバリデーションのための物質の直接投与を可能にします。
- 探索生物学：中枢神経系（CNS）薬の作用およびパスウェイの関与に関する仮説検証を支援します。
- スクリーニング：アッセイ開発のために、再現性のある定量的なCNS曝露を実現します。
- 分析：脳特異的な分布および分子レベルの影響の測定を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：疾患に関連するCNSモデルおよびバイオマーカーとの整合性を促進します。
- 企業内での再利用：多様な研究開発プログラム向けに、標準化された低侵襲なCNS送達プラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：CNS研究における予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを軽減します。
- 運用的価値：高い再現性と最小限の動物トラウマによる、CNSへの投与の標準化を実現します。
- 戦略的価値：CNS標的アセットのgo/no-go判断を改善し、後半ステージにおける生物学的リスクを低減します。
- ポートフォリオへの影響：強固なin vivoデータに基づいた、CNSプログラムのリスク調整後の優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- 一貫した実施には、顕微外科的な専門知識とトレーニングが必要である。
- 実体顕微鏡および精密な注入器具へのアクセスが必要である。
- 再現性を確保するためには、チーム間での厳格な標準化が求められる。
- 異なる動物モデルや中枢神経系（CNS）領域への適応が必要な場合がある。
- 潜在的な制限として、技術的な習得期間や処置に要する時間が挙げられる。
