梗塞エリアの中央動脈閉塞技術と可視化を使用したマウスにおける虚血性脳卒中および虚血 - 再灌流の誘導
2017年2月2日
私たちは、シリコーンコーティング縫合糸を使用して、中大脳動脈の閉塞によって誘発される脳卒中のマウスモデルを記述します。このプロトコルは、永久的な閉塞または一時的な虚血を誘発し、続いて再灌流を誘発するために適用することができます。
この外科的処置の全体的な目標は、外部大脳動脈を無傷のままにしながら、公式かつ確実に虚血性脳卒中を誘発することです。この方法は、治療が脳卒中の重症度に与える影響など、脳卒中研究の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、脳卒中誘発後、外大脳動脈が患部の半球に直接治療を注入するために利用可能なままであることです。
イソフルランで麻酔したマウスを準備した手術面に置き、酸素と混合したイソフルランを投与するためにノーズコーンを取り付けます。.呼吸数があえぎ声を出さずに、1秒間に約1〜2回の呼吸であることを確認してください。さらに、動物がひげの刺激やペダル反射に反応を示さないようにしてください。
滅菌綿棒を使用して、手術中に眼科用潤滑剤を一滴垂らします。切開部を剃った後、70%エタノールとクロルヘキシジン系溶液を用いて手術部位を徹底的に消毒します。動物を実体顕微鏡下の暖かい手術面に置いてください。
次に、手術用ハサミと鉗子を使用して、胸骨の上から顎の下に向かって首の浅い正中線切開を行います。鉗子を使用して、脂肪組織と結合組織を慎重に分離して気管を露出させます。組織は簡単かつ自然に両側に分離する必要があります。
次に、首の後ろの下に直径約0.5センチの枕などの丸いものを置いて首を伸ばし、手術のためにさらに露出させます。ティッシュリトラクターまたはフックを使用して切開部を開きます。次に、気管の左側で、結合組織を慎重につまんで引き離し、近くの神経や主要な静脈に損傷を与えることなく、左の総頸動脈を露出させます。
次に、湾曲した鉗子をCCAの下に挿入して結合組織を突き刺し、ゆっくりと開いてCCAを放出します。CCAを下にある組織から切り離し、内脳動脈と外脳動脈の上部Y分岐を露出させます。CCAが露出したら、CCAの下にナイロン縫合糸の3つのセグメントを挿入します。
CCAがねじれていないことを確認すると、縫合糸の挿入が大幅に複雑になります。次に、可能な限り低い位置で、永久的な結び目を使用して下部縫合糸を閉じます。取り外し可能なスリップノットを使用して、ICAとECAの分岐のすぐ下に上部縫合糸を結びます。
次に、取り外し可能なスリップノットを使用して中央の縫合糸を結びますが、大きく開いたままにします。次に、マイクロダイセクションスプリングハサミを使用して、底部と中央の縫合糸の間にCCAに0.2ミリメートルを空け、下部縫合糸に近づけます。鉗子を使用して、MCAO縫合糸をCCA切開部に挿入し、上部縫合糸に向かって導きます。
次に、CCAの中央縫合糸のスリップノットをそっと締めて、MCAO縫合糸の周りの血流を制限しますが、MCAO縫合糸が自由に動くのに十分な緩さにします。次に、MCAO縫合糸が滑り落ちないように、上部縫合糸を慎重に元に戻します。MCAO縫合糸をICAに数ミリ挿入し、前と同じようにスリップノットで上部縫合糸を再度閉じます。
次に、MCAO 縫合糸を閉塞領域に誘導し、最初に ECA を経由して ICA にルーティングし、次に縫合糸が翼状口蓋動脈をバイパスして ICA に留まるようにします。CCA切開部からの血液逆流がほとんどなく、銀色の9mmマークがCCA切開部とICAおよびECAの分岐部との間に位置している場合、挿入は成功します。閉塞が成功したら、中央と上部の縫合糸をしっかりと結び、縫合糸を切開部に押し込みます。
リトラクターまたはティッシュフックと枕を取り外した後、綿棒で滅菌生理食塩水を使用して縫合領域を清掃します。次に、ナイロン縫合糸で皮膚を閉じます。マウスを加熱パッドの上にある清潔なケージに入れて、低体温症を防ぎ、水や柔らかくなった食品に自由にアクセスできるようにします。
少なくとも5〜10分間、脳卒中の兆候がないか動物を監視します。虚血再灌流プロトコルにもよりますが、MCAO縫合糸を30分から120分以上そのままにしておきます。以前と同様に動物に麻酔をかけ、創傷閉鎖縫合糸を抜いた後、鉗子と組織分離器を使用して切開部を再度開き、CCAを露出させます。
次に、上部縫合糸を慎重に取り外し、シリコンコーティングされた部分が中央の結び目に位置するまでMCAO縫合糸をそっと引っ張ります。トップノット縫合糸をやり直して、血液がMCAO縫合糸を通過するのを防ぎます。次に、真ん中の結び目を慎重にほどき、MCAO縫合糸を上の結び目を越えて引っ張り、CCAの内側に保ちます。
上部の結び目をしっかりと閉じて、動脈の血流を遮断します。次に、MCAOの縫合糸を完全に引き抜き、真ん中の結び目をしっかりと閉じます。傷口を閉じ、以前と同様に術後ケアを行います。
この回路図は、このビデオで示されている手順の結果として生じるオクルージョン領域を青で示しています。手術部位は図の下部にあり、楕円形で示され、縫合糸の配置は黒い線で示されています。次の図は、脳切片のTTCの立位を示しています。
この画像は、偽挿入後の典型的な染色を表しています。この画像は、60 分間の MCAO とそれに続く 90 分間の再灌流によって引き起こされる組織損傷を表しています。60分間のMCAOの後、24時間の再灌流後により大きな組織損傷が見られます。
ニューロンマーカーMAP2の免疫蛍光染色により、60分間の閉塞とその後の23時間の再灌流によるニューロンの損失を右の画像で明確に視覚化できます。アストログリオーシスは、GFAPによる免疫蛍光染色後に見られます。右の写真では、虚血再灌流脳の組織損傷に隣接する領域に星状膠細胞が集中しているのに対し、恥ずかしい操作コントロールでは拡散した染色のパタパタが見られます。
この手順を試みる際には、動物の健康状態と閉塞時間を監視することが重要です。この手順に続いて、奇数挙動解析や免疫蛍光などの他の手法を実行して、組織の損傷と回復に関する追加の質問に答えることができます。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本記事では、中大脳動脈を閉塞させることにより、マウスモデルに虚血性脳卒中を誘発させる手術手順について説明します。この手法では外頸動脈を温存することができるため、患側半球への治療薬の直接注入が容易になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 脳卒中研究
- 動物モデル
背景
- 虚血性脳卒中は、神経科学における極めて重要な研究領域です。
- 脳卒中の重症度に対する治療の影響を理解することは不可欠です。
- 閉塞中に外頸動脈を維持することは有利に働きます。
- このモデルは、永久閉塞と一時的虚血の両方に使用することが可能です。
研究目的
- マウスにおいて虚血性脳卒中を確実に誘発すること。
- 脳卒中の転帰に対するさまざまな治療法の効果を検討すること。
- 脳卒中のメカニズムおよび治療法の研究のためのモデルを提供すること。
使用した手法
- イソフルランと酸素によるマウスの麻酔。
- 動脈閉塞のためのシリコンコーティング縫合糸の留置。
- 手術中の呼吸数および反射のモニタリング。
- 外頸動脈を介した脳卒中後の治療薬投与。
主な結果
- この手順により、虚血性脳卒中が正常に誘発された。
- 治療薬の注入のため、外頸動脈は温存された。
- 脳卒中治療に関するさらなる研究の可能性がある。
- 本手法の信頼性と再現性が実証された。
結論
- このモデルは脳卒中研究において有用なツールとなります。
- 閉塞後の直接的な治療法の適用が可能です。
- 今後の研究はこの基礎的な技術をベースに展開することができます。
よくある質問
産業界における重要性
マウスの中大脳動脈閉塞（MCAO）モデルは、局所的な虚血性脳卒中を誘発するための信頼性と再現性の高いシステムを提供し、神経保護療法や血栓溶解療法の前臨床評価を可能にします。外頸動脈を温存することで、この手法は局所的な治療薬の投与をサポートし、脳卒中の病理および回復経路に関するメカニズムの理解を深めます。本モデルは遺伝的変異体や標準化された行動解析との適合性が高く、神経科学の創薬パイプラインにおけるターゲットバリデーションやリード化合物同定への有用性を高めています。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
早期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 定義された虚血病変における治療仮説の検証を可能にし、パスウェイの解明および脳卒中標的の生物学的リスク低減を支援します。
- 運用の価値： 研究間での一貫した梗塞誘導を容易にし、ターゲットエンゲージメントおよび機能検証アッセイにおける再現性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：TTC染色および免疫蛍光染色により定量可能な組織損傷指標を算出でき、候補化合物の用量反応解析が可能になります。
- 実用的価値：標準化された再灌流タイミングと縫合糸による閉塞をサポートし、制御された外科的条件下で脳卒中治療薬のスケーラブルなスクリーニングを可能にします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値： 時間的制御を伴う虚血再灌流傷害をモデル化することで、遅延治療の効果の評価や、トランスレーショナルな関連性のためのバイオマーカー（例：MAP2, GFAP）の整合性の検証が可能になります。
- 運用的価値： 保存された外頸動脈を介して閉塞後の治療薬注入が可能であり、臨床的な投与経路を模倣し、前臨床段階の継続性をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
MCAOモデルは、ターゲットバリデーションからリード化合物の同定、さらには前臨床薬効試験に至る創薬の連続的なプロセスに適合しており、特に神経保護剤や再灌流療法の評価において有用です。
- 探索生物学：再現性のある病変トポロジーを持つ局所損傷モデルを用いて、虚血メカニズムおよび経路変調に関する仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：行動学的および組織学的リードアウトと組み合わせることで、梗塞サイズおよび神経学的欠損に対する化合物の効果の定量的な評価を可能にします。
- 分析：治療群間の比較分析のために、梗塞面積（TTC）、ニューロン消失（MAP2）、およびアストログリオーシス（GFAP）を含む測定可能な出力を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：臨床的に関連のある虚血再灌流シーケンスをモデル化し、治療ウィンドウの評価やバイオマーカー駆動型の患者層別化アプローチの検討を可能にします。
- エンタープライズ再利用：脳血管疾患治療薬の開発において、複数の治療法やターゲットクラスに適用可能な標準化された外科的プラットフォームとなります。
運用およびエンタープライズへの影響
- 科学的価値： 治療薬投与のための動脈アクセスを維持したまま局所虚血をモデル化することで、予測の信頼性を高め、脳卒中の病態生理におけるメカニズムの曖昧さを軽減します。
- 運用的価値： 縫合による閉塞と再灌流タイミングの制御を通じて手順の標準化を実現し、研究間の比較可能性を向上させます。
- 戦略的価値： 脳卒中の重症度および回復軌跡に対する治療の影響を早期に評価することを可能にし、go/no-go判断に情報を供します。
- ポートフォリオへの影響： 虚血性損傷と治療反応の信頼性の高いモデル化を通じて、神経科学分野の候補薬剤のリスク調整後の優先順位付けを支援します。
実施上の検討事項
- 血管の分離や実体顕微鏡下での縫合操作を含む、マイクロサージャリー技術の専門知識が必要である。
- 精密なMCAO縫合を行うため、微小解剖用スプリング鋏、ピンセット、縫合糸などの専用器具に依存する。
- 一貫した手術結果を確保するため、標準化された麻酔および生理学的モニタリングプロトコル（例：呼吸数、反射消失の確認）が必要である。
- 閉塞の忠実度と梗塞の再現性を維持するため、マウスの系統や遺伝子モデルに応じた適応上の検討が必要となる。
- 縫合糸の脱落リスクや再灌流効率のばらつきといった実用的制限が含まれており、これらは手技のトレーニングとバリデーションを通じて管理されなければならない。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:05
Title
0:37
Dissection of the Common Carotid Artery and Internal/External Branching
2:53
Preparation of the CCA for the MCAO Suture Insertion
3:51
Middle Cerebral Artery Occlusion
5:59
Reperfusion
7:07
Results: Characteristics of Brain Tissue Following Ischemia-Reperfusion
8:38
Conclusion
