バイオフィルム除去窒素パージすることなく、二酸化炭素エアロゾルを使用します

この実験の全体的な目標は、窒素パージを行わずに二酸化炭素エアロゾルを使用したバイオフィルム除去の有効性を評価することです。二酸化炭素エアロゾルは、運動量移動とエアロゾルに対する界面活性剤の作用を利用してバイオフィルムを除去するために使用できます。これは、バイオフィルムを短時間で除去する効果的で信頼性の高い方法であり、バイオフィルムの気相洗浄技術でもあります。

実験を開始するには、厚さ1ミリメートルの機械的に切断された3つのゼロ4ステンレス鋼チップ(内部10 x 10平方ミリメートル)を使用します。次に、チップをアセトン、メタノール、および脱イオン水またはDI水で順次超音波洗浄します。チップを流すDI水で4秒間すすぎ、窒素ガス流を使用してチップを4秒間乾燥させます。

摂氏80度で保存されたPseudomonas putida KT2440ストックを取り出します。冷凍ストック溶液の最上層がスラッシュに変わるときに、室温で1分間培養物を解凍します。ストック溶液の溶融層にループを沈め、1.5%寒天を含むLuria BrothまたはLBプレートにバクテリアを縞模様にします。

プレートを摂氏30度で一晩インキュベートします。翌日、50mLのコニカルチューブに10ミリリットルのLBを追加します。新しいループを使用して、プレートから単一のコロニーを取り出し、LBに接種します。振とうのあるインキュベーターでブロスをインキュベートします。

準備したチップをピンセットでそれぞれつまみ、70%エタノールに5回、それぞれ1〜2秒間浸して、各チップの表面を滅菌します。次に、各チップをオートクレーブ滅菌した脱イオン水または脱イオン水ですすいでください。次いで、LBで残りのエタノールを順次除去する。

チップを6つのウェル培養プレートに入れ、ウェルあたり5ミリリットルのLBブロスに2つのチップを入れます。次に、LBブロスの濃度がミリリットルあたり8 x 10から8番目の細胞に達するまで、細菌培養物を希釈します。各ウェルに50マイクロリットルの希釈した細菌培養液を接種します。

次に、プレートをインキュベートします。バイオフィルム化されたフォームチップを10ミリモルの酢酸アンモニウム緩衝液に5回浸して、緩く付着した浮遊性細菌を取り除きます。次に、空気が穏やかに流れるバイオセーフティキャビネットでチップを乾燥させます。

乾燥直後に、ジェットの軸に沿って二酸化炭素ノズルから20ミリリットルのローディング場所にチップを置きます。ジェット軸を40度の角度に傾けます。次に、ガス圧力調整器を使用して、二酸化炭素と窒素ガスの停滞圧力を設定します。

エアロゾルジェットをチップの中央部分に塗布します。二酸化炭素の電磁弁を5秒間オンにしてから、手動制御のスイッチを使用して定期的に3秒間オフにします。窒素パージを使用する必要がある場合は、電磁弁をオンにして窒素を連続的に供給します。

セットアップが完了したら、窒素パージの有無にかかわらず、チップを二酸化炭素エアロゾルで処理し、エアロゾル処理時間の異なるチップを比較します。ネガティブコントロールとして処理せずにチップを保持します。コントロールおよびエアロゾル処理チップ上の細菌細胞を染色するために、DI水中に緑色蛍光核酸染色液を1マイクロモル調製します。

チップスと一緒に染色液をウェルに入れ、インキュベートします。インキュベーション後、チップを流すDI水でチップをやさしくすすぎ、余分な蛍光色素を取り除きます。その後、窒素ガスの流れでチップを乾燥させます。

落射蛍光顕微鏡を使用して、各チップの5つのランダムな視野の蛍光顕微鏡画像を撮影します。最後に、計算に移ります。24時間成長したPseudomonas putidaバイオフィルムの蛍光顕微鏡画像を、窒素パージなしでゼロ、16、40、および88秒間二酸化炭素エアロゾルで処理しました。

窒素パージなしのバイオフィルムの蛍光強度に基づいて計算された除去効率は、窒素パージを使用した場合の除去効率よりも高かった。このビデオで見たように、三相洗浄技術は短時間でバイオフィルムを効果的に除去します。さまざまなバイオ汚染表面に適用できます。