Name: カポジ肉腫ヘルペス ウイルスによる細胞変換を勉強するための in Vitroモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 学ぶカポジ肉腫ヘルペスウイルスによる内皮細胞の悪性転化メカニズム。in vitroモデルを用いて遺伝子発現変化を解析し、新規治療標的の同定に貢献する研究手法を習得できます。

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この仕事を受けましたで K12 HD068322 (SCM);R01 CA179921 と P51 OD011092 (AVM);アメリカ心臓協会 (SB) から 14PRE20320014 賞を受賞します。

注: このプロトコルで説明したすべての手順は、BSL 2 の条件下で行わなければならない。
 1。 KSHV 在庫準備 <ol><li>準備 TNE バッファー: ddH 2 O 292.24 mg EDTA を溶解、225 mL にもたらすと pH 8 に調整します。605.7 mg トリス ddH 2 O に溶解、225 mL にもたらす、pH 8 に調整します。EDTA とトリスのソリューションを組み合わせて、4.38 g 塩化ナトリウムを加えて、500 mL に最終的な音量を調整、フィルター、殺菌し、4 ° c . 保存</li>
	<li>文化 KSHV 正、EBV 否定的な一次貯留リンパ腫細胞株 BCBL 1 37 ° C プラス 10% 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS) と約 1 に抗菌剤添加 RPMI で 5% CO 2 加湿のインキュベーターで1.2 mL あたり 6 セルを 10 倍にします</li>。
	KSHV 生産を誘導する <li>新鮮な培地で培養 1:2 の分割 20 ng/mL の最終的な集中にホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) を追加し、5 日間の文化を孵化させなさい。代わりに、ウイルス複製を誘発する 3 日間の酪 (NaB; 0.1 mM) で細胞を治療します</li>。
	<li>ウイルス粒子を収穫する遠心培養セルをペレットし、新鮮なチューブに上清を転送するために室温で 5 分間 300 x g で上清が最初</li>。
	4 10 分 2,500 × g で遠心分離機細胞の残骸の転送を避けるために上清をさらに明確に <li>° C 
	注: として明確化培養上清の濾過滅菌 0.45 μ m のフィルターを実行することができますを介して高速遠心分離に代わる。ろ過装置を使用して抗体価の有意な低下を観察しています。したがって、我々 日常的に 2 回目の遠心分離のステップ代わりに実行します</li>。
	<li>約 30 ml の明確化培養 6 遠心チューブに上清中の TNE バッファーで 25% ショ糖溶液の 5 mL を次に、オーバーレイします</li>。
	<li>遠心バランス チューブ真空下で 4 ° C で 2 時間 75,000 x g で</li>。
	<li>培養上清をデカントし、可能な限り上清およびショ糖ソリューションを削除する各管の縁をしみ、150 μ L の TNE バッファーに表示できない場合がありますウイルス ペレットを再懸濁します</li>。
	<li>プールのすべての再停止ウイルス、よく、混合し、-80 ° c . 25 μ 因数を凍結</li>
</ol> 2。EC E6 と E7 ヒトパピ ローマ ウイルス遺伝子の伝達 注: 私たちは日常的に主な理事会の成長のための標準培養フラスコを使用ただし、EC の不十分な成長が得られた場合、商業文化フラスコ使用見なす必要があります。
EC 培地に <ol><li>文化主なひと皮膚微小血管やリンパ管 EC 37 ° C プラス 5% で加湿のインキュベーターで CO 2 (EGM; EC の基本培地 [EBM] [引受を含む EGM 2 BulletKit で補完が含まれていますヒドロコルチゾン、ひと線維芽細胞成長因子 B、血管 EC 増殖因子、インスリン様成長因子-1、アスコルビン酸、ひと上皮成長因子、抗生物質、およびヘパリン]) 約 50% 合流するコート t75 フラスコ細胞培養用フラスコで</li>。
	<li>の伝達、文化 PA317 LXSN 16E6E7 セルの 37 ° C で加湿のインキュベーターで 24 , 35 プラス 10 %fbs と抗菌剤で DMEM で 5% CO 2T150 細胞培養フラスコまでは約 90% 合流。16 mL の培地で一晩インキュベートし</li>。
	<li>室温で 5 分間 300 × g で遠心分離して PA317 媒体を明確します</li>。
	<li>12 ml の明確化 PA317 培地の EC 文化とオーバーレイ セルから、EGM を削除してインキュベートする 4 h 
	注: は明らかに清 12 mL の慎重にそれに続く除去に邪魔されない小型ペレット 5 分結果の 300 x g で馴化培地の 16 mL を遠心分離。ただし、プライマリ EC 文化への PA317 LXSN 16E6E7 セルの転送 (包装細胞ラインが EC を脱却してすぐに) 重要では場合、転送する前に 0.45 μ m のフィルターを通してエアコン上清の濾過実行できます</li>。
	<li>新鮮な EGM の PA317 媒体の 6 mL を交換し、一晩インキュベートします</li>。
	<li>12 mL で再フィード EC 新鮮な EGM し, さらに 48 h.</li>
	<li>EC は、サブカルチャーに培地を取り除き、12 mL の陽イオン、ない PBS で洗浄しによって (例えば TrypLE) 商業酵素分解溶液 3 mL を追加し、37 ° C で 3 分間インキュベート</li>
	<li>細胞懸濁液を 15 mL の円錐管に転送し、室温で 5 分間 300 × g で遠心。新鮮な EGM の結果細胞ペレットを再懸濁し、3 x T75 フラスコ フラスコあたり 12 mL EGM の最終巻に均等に分割します</li>。
	<li>E6 と E7 で導入した EC の選択、2 つの通路、導入された EC の感染症のためメッキまたは液体窒素で凍結後の 200 μ G/ml の最終的な集中に G418 を追加します</li>。
</ol> 3。KSHV と EC の導入の感染 <ol><li>感染前に日に前述のように商業酵素解離ソリューションを使用して酵素消化によって EC を収穫します。EGM の 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します。トリパン ブルー色素の 1/10 倍の希釈液を準備するのにには、セルの 5 μ L を使用します。診断を使用して生きているセルをカウントし、シード 10/6 ウェル プレートのウェル EGM の 2 mL で 5 生きているセル x 2.5</li>。
	<li>感染の日削除 EGM と好評につき、3 ml の PBS のカルシウムとマグネシウムの細胞を洗浄し、追加 2 mL EBM 。
	注意: それは EGM のヘパリンはウイルス粒子の結合とターゲット理事会の後の感染を抑制する、感染、EGM ではなく、EBM を使用するが重要です</li>
	KSHV、細胞に感染する <li>は各ウェルに 5 に 20 μ L ウイルス ストックを加えてミックスするプレートを旋回します。モック感染細胞は、各ウェルに TNE バッファーの等しいボリュームを追加します</li>。
	<li>室温で 30 分間 400 x g でプレートを遠心し 90 分の 37 ° C でプレートをインキュベーションして</li>
	<li>研究の目標は、同期ウイルス感染、例えば、de novo 感染の初期イベントを必要とする初期のイベントを調査する場合は、この時点で接種ウイルスを削除します。2 mL の細胞を再フィードをすすいで新鮮な EGM。そうでなければ、2 mL EGM を追加し、文化を一晩インキュベートします</li>。
	<li>感染と一日おきに、後日 2 mL EGM で細胞を再フィードします</li>。
	<li>細胞が約 90% の合流、前述のように、市販の酵素分解溶液を用いたタンパク質分解酵素で収穫し、合計通路番号と通路の両方に注意、T75 に 3 つの井戸から細胞のプール感染後</li>。
	モック-KSHV-感染と EC 細胞の実験で使用されるまたは液体窒素で凍結する時に、少なくとも 2 つのより多くの文章の 1:3 分割 <li>を展開します 。
	注: E6 と E7 で導入した EC の分割とモックと KSHV 感染細胞のメンテナンス文化を分割する合流 (~ 85 ~ 90%) に達する前に</li></ol>。
 4。 確認感染抗体法による KSHV 注: KSHV 潜時に関連核抗原 (ラナ-1/ORF73) の検出は、感染症の信頼性の高い定量的測定を提供します。反ラナ抗体が市販。
<ol><li>染色、前日あたりでモックや KSHV-感染 EC 1 x 10 の 5 時 24 ウェル プレートに各セル板 2 井戸 1 mL EGM でよくし、一晩インキュベートします</li>。
	<li>500 で 2 回洗浄セル PBS とカルシウムと magniseum μ L。30 の洗浄ロッキング プラットフォーム上の s.</li>
	<li>Ventillated-外部からの発煙のフードでは、室温で 15 分間 4% パラホルムアルデヒドの 500 μ L でセルを修正します</li>。
	<li>洗浄洗浄バッファー (0.1% トリトン X-100 プラス PBS プラスの陽イオンで 0.02% ヤギ血清) の 500 μ L で 3 回セル</li>。
	<li>室温で 30 分間洗浄バッファーで 2% ヤギ血清 500 μ L で細胞をブロックします</li>。
	<li>洗浄洗浄バッファーの 500 μ L で 3 回セル</li>。
	<li>ラベルのモックや KSHV-感染した一次抗体の 200 μ L で EC 希釈 1:10 1 つの井戸ロッカーの部屋の温度で 30 分間洗浄バッファーの 0。200 μ L の洗浄バッファーのみで残りの 2 つの井戸をインキュベートします</li>。
	<li>洗浄洗浄バッファーの 500 μ L で 3 回セル</li>。
	<li>ロッカーの室温で 30 分間洗浄バッファーで希釈した二次抗体 1: 100 の 200 μ L ですべての 4 つの井戸のラベルします</li>。
	<li>洗浄洗浄バッファーの 500 μ L で 3 回セル</li>。
	<li>も取付中含む DAPI と観察の 20 μ L を適用し、倒立蛍光顕微鏡を用いた染色を評価します</li>。
	<li>は、少なくとも 200 セルのラナ陽性核の数を数えることによって KSHV 感染細胞のパーセント感染を決定します。感染組換え KSHV Bac16 は、GFP の表現のための文化の観察を介しても監視できます</li>。
</ol>

発癌は、生物36内で重要な保護手段を回避するマルチ ステップ プロセスです。KS 病変存在真の肉腫に慢性的な炎症のスペクトルに沿って、KSHV を介した特定の病態生理学的プロセスの解明は変換9をサポートする細胞培養モデルにおけるいくつかの研究を実施することが必要です。接触阻害とアンカレッジ依存性増殖、細胞のがん化を示す表現型の損失を容易に開発しないことに注意してください次のプライマリの EC または EC テロメラーゼの発現によって不死化の感染。したがって、KS 腫瘍微小環境のすべての側面または explanted KS 細胞の挙動を KS ここで説明の生体外モデルは要約しない、一方は、感染による宿主細胞遺伝子発現の変化を研究するため一意に最適です。KSHV KS 腫瘍形成に貢献します。
最初の報告ここ説明培養系を用いた遺伝子発現 KSHV 感染細胞25変換された表現型に貢献として受容体チロシン キナーゼ c キットを識別...

カポジ肉腫 (KS) は、高度な免疫抑制1の設定で最もよく開発する多焦点 angioproliferative 腫瘍皮膚や粘膜、内臓のサイトに影響を与えるです。4 疫学的フォームに記載されている: 古典的な地中海および中東遺産の高齢者に影響を与える通常無痛性フォーム医原性、臓器移植後免疫抑制薬による治療に起因伝染病、エイズの定義の癌の場合。風土性、アフリカの風土性の地域で子供たちに共通する HIV に依存しない形式です。HIV の治療のための効果的な組み合わせ抗レトロ ウイルス薬療法の出現で、流行の KS あまり一般的に発展途上国で診断されます。しかし、臨床的に積極的な風土病や伝染性の形態のまま最も一般多くのアフリカ諸国2,3,4で診断された癌。したがって、KS の治療のための効果的な病因標的薬剤の同定は研究の優先順位です。
組織学的, KS 病変は EC 起源の紡錘形細胞が不連続な血管網5を形作るという広範な異常な血管新生によって特徴付けられます。これらの異常な血管 (「血管スリット") は、病変の特徴的な色を与える赤血球漏出を許可します。また、病変は慢性炎症 (すなわち、リンパ球、マクロファージ、形質細胞) を特徴付ける多くの白血球を含みます。KS 病変の免疫再構築、次の回帰を説明したが、KS ハイパー増殖性病変と、真の腫瘍6,7,8,9の両方の機能があることを示唆しています。
KS ヘルペス ウイルス (KSHV)、カンザスの原因となるエージェントは、1994年10で確認されました。以来、多くの in vitro細胞培養モデルが開発されている病態研究を有効にするには、腫瘍生検材料プライマリから仔細胞を含むまたはテロメラーゼ発現 EC 感染 KSHV体外11,12,13,14,15,16,17,18. 現在利用できるモデルのどれも完全に KS 腫瘍微小環境を繰り返すが、すべては KSHV 感染症の病態を理解するための貴重な知識を貢献しています。異なり、他知られている発癌性ヒトヘルペス ウイルス エプスタインバー ウイルス (EBV)、KSHV 容易に変換されません次のde novo感染19,20,21,培養細胞22ですただし、この制限は、E6 と微小血管やリンパ管の起源を混合のいずれかのプライマリ人間 EC を伝達で克服されているとヒトパピ ローマ ウイルスから E7 遺伝子 KSHV23,24 の感染前に 16 を入力。.これらの外因性の遺伝子の発現は大幅に KSHV生体外の変換の可能性をさらに網膜芽細胞腫タンパク質および p5323,24の抑制を提供することによって増加の一部。この EC トランスダクション法が細胞遺伝子発現 KSHV 感染によって引き起こされるが、KS の細胞の生存・増殖25,26を容易にする表示されるホストでのキーの変更を識別するために複数の研究所を許可します。,27,28,29,30,31,32. 記載プロトコルは簡単で、再現性の高い、および KSHV 感染 EC の年齢と経過一致と一次電池よりはるかに長いために培養することができます、モック感染コントロールの世代になりますKSHV で採用されている発癌性発現機構の解明を可能にします。プロトコルには、プライマリ胸水リンパ腫細胞株 BCBL-1 E6 E7 不死化 EC から KSHV が非常にしやすいも野生型の製造方法が含まれていますが、遺伝子組換えバクミドの感染は KSHV BAC1630を派生します。BAC16 の準備のためのプロトコルは別の場所で説明33,34。

<table><tbody><tr><td>BCBL-1細胞</td><td>NIH AIDS 試薬プログラム</td><td>3233</td><td></td></tr><tr><td>PA317細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2203</td><td></td></tr><tr><td>新生児経皮微小血管内皮細胞</td><td>ロンザ</td><td>CC-2505</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 基礎培地</td><td>ロンザ</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>ロンザ</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>抗 KSHV LANA/ORF 73</td><td>アドバンストバイオテクノロジー</td><td>13-210-100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLETMExpress、フェノールレッドなし</td><td>ThermoFisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS with カルシウムおよびマグネシウム</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

カポジ肉腫ヘルペス ウイルスによる細胞変換を勉強するための in vitroモデル

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

カポジ肉腫 (KS) ですが KSHV、血管内皮細胞 (EC) の感染によって開始され、免疫抑制の設定で最もよく開発する異常な腫瘍増殖の紡錘形細胞から成る。研究の数十年にもかかわらず KS の最適な治療の定義が不十分なままし、臨床転帰、リソース制限の設定に特に有利です。KS 病変、病的血管新生、慢性的な炎症と発癌、によって駆動され、これらのプロセスを研究する様々 な生体外で細胞培養モデルが開発されました。EC 系細胞は紡錘細胞前駆体の最も適切な体外サロゲートを提供するので、KS は内皮由来の KSHV 感染細胞から発生します。ただし、EC体外限られた寿命を持っているので、KSHV で採用されている発癌機構が他の発癌性ウイルスのものより効率が悪い、それされているプライマリの変換のプロセスを評価することは困難またはテロメラーゼ不死化理事会したがって、新規 EC 文化モデルは容易に KSHV 感染、次の変換をサポートする開発されました。ヒトパピ ローマ ウイルス 16 型の E6、E7 遺伝子の異所性発現の年齢と経過一致モックと KSHV-感染 EC 拡張の文化を可能にし本当に変形の開発をサポートしています (つまり、発癌性) 感染細胞培養における表現型.KS のこの扱いやすい再現性の高いモデルは、臨床の現場への翻訳の可能性が高いいくつかの本質的なシグナル伝達経路の発見を促進しています。

主な EC の形態は古典的な「石畳」として記述されて、ヒトパピ ローマ ウイルス E6 および E7 遺伝子 (図 1 a) の式によってこの形態は変わらない。単独での E6、E7 遺伝子の発現を変換された表現型; 誘発しません。したがって、細胞は抑制に連絡を受けやすい、分割文化の合流点に到達すると停止します。しかし細胞は増殖し、trypsinization とモック感染コントロールとして使用するため同年、通路文化の維持を可能にする低密度で replating に合流するために再生します。
KSHV と E6 ・ E7 導入 EC の感染は、KS 病変 (図 1 b) にみられる「紡錘細胞"の表現型を連想させる文化の劇的な形態変化を引き起こします。変換された表現型もあるマニフェスト一部接触阻止の損失によって細胞が培養後合流 (図 1) および足場非依存成長軟寒天培地 (...

カポジ肉腫 (KS)、発癌性ウイルス ヘルペス ウイルス 8/KS ヒトヘルペス ウイルス (HHV-8/KSHV) 感染により誘導される腫瘍であります。ここで説明した内皮細胞培養モデルは KSHV が宿主細胞を変換するメカニズムを研究するため一意に適しています。

カポジ肉腫ヘルペス ウイルスによる細胞変換を勉強するための in Vitroモデル

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

この手順の全体的な目標は、KSHV感染内皮細胞の年齢および継代が一致した模擬試験を準備して、適切な制御の文脈で悪性形質転換を推進する変化を含む宿主細胞遺伝子発現のKSHV関連変化の研究を可能にすることです。この方法は、KSHV関連がんにつながる宿主細胞生物学の主要な病態生理学的変化を定義するのに役立ち、疾患の予防または治療のための新しい治療標的を特定するのに役立ちます。このシステムの主な利点は、KSHV感染後の内皮細胞の悪性形質転換が迅速かつ再現性よく起こり、年齢および継代が一致した制御細胞による発がん過程の初期事象の研究を可能にすることです。このウイルス発がんモデルは、カポジ肉腫の発生に関する洞察を提供するだけでなく、他の種類のがんにも適用できます。カポジ肉腫は血管腫瘍であるため、この細胞培養モデルの意味は、病理学的血管新生によって引き起こされる他の疾患プロセスの理解にまで及びます。まず、テキストプロトコールに記載されているように、滅菌したTNEバッファーを調製し、ろ過します。次に、溶液を摂氏4度で保存します。KSHV陽性EBV陰性原発性滲出液リンパ腫細胞株BCBL-1を、60ミリリットルのRPMI培地で満たされたT150フラスコで培養します。細胞を摂氏37度に維持し、5%二酸化炭素を1ミリリットルあたり10〜6番目の細胞の約1〜1.2倍の懸濁液を得る。適切な密度に達したら、細胞を新しい培地で1〜2分割し、PMAを最終濃度の1ミリリットルあたり20ナノグラムに添加して、KSHV産生を誘導します。その後、培養物を5日間インキュベートします。5日間のインキュベーション後、細胞懸濁液を室温で5分間300倍gで回転させることにより、ウイルス粒子を回収します。次に、上清を新しいチューブに移します。上清を再び2,500倍g、摂氏4度で10分間遠心分離し、細胞の破片を取り除きます。それが明らかになったので、TNE中の5ミリリットルの25%スクロース溶液と約30ミリリットルの上清を6本の超遠心チューブに重ねます。バランスチューブを75, 000倍gで真空下で摂氏4度で2時間遠心分離します。遠心分離が完了したら、上清をデカントし、各チューブの縁を吸い取って、できるだけ多くの液体を取り除きます。次に、ペレット化したウイルスを150マイクロリットルのTNEバッファーに再懸濁し、すべてのサンプルをプールします。プールした懸濁液をよく混ぜ合わせ、25マイクロリットルのアリコートに分けます。ストックウイルスはマイナス80°Cで保管してください。初代ヒト真皮微小血管またはリンパ内皮細胞をT75フラスコ内のEGM培地で培養します。細胞培養液を摂氏37度、二酸化炭素5%に維持し、約50%のコンフルエントに達するまで維持します。内皮細胞形質導入に先立ち、20ミリリットルのDMEMを充填したT150細胞培養フラスコでPA317 LXSN 16E6E7細胞を37°C二酸化炭素で培養します。約90%のコンフルエントが達成されたら、PA317細胞培養液を16ミリリットルの新鮮な培地と交換し、細胞を一晩インキュベートします。一晩インキュベートした後、PA317細胞培養物から培地を回収し、室温で300倍gで5分間遠心分離して清澄化します。50%コンフルエント内皮細胞培養液のEGM培地を、清澄化されたPA317培地12ミリリットルと交換します。細胞を4時間インキュベートします。次に、6ミリリットルのPA317培地を6ミリリットルの新鮮なEGM培地と交換し、細胞を一晩インキュベートします。その後、内皮細胞培養物から培地を取り出し、12ミリリットルの新鮮なEGMを細胞に供給します。さらに48時間、細胞をインキュベートし続けます。内皮細胞を継代培養するには、培地を取り出し、12ミリリットルのカチオンフリーPBSで細胞を洗浄します。次に、市販の酵素解離溶液3ミリリットルを加え、細胞を摂氏37度で3分間インキュベートします。細胞懸濁液を15ミリリットルのコニカルチューブに移し、細胞を300倍gで室温で5分間遠心分離します。ペレット化したら、細胞を新鮮なEGM培地に再懸濁し、懸濁液を3つのT75フラスコに均等に分割します。培養物の量をフラスコあたり12ミリリットルのEGMに調整します。次に、G418のミリリットルあたり200マイクログラムを追加して、形質導入された内皮細胞を選択します。前述したように、形質導入された内皮細胞を酵素消化により回収します。内皮細胞ペレットを1ミリリットルのEGM培地に再懸濁します。.次に、5マイクロリットルの細胞懸濁液と45マイクロリットルのトリパンブルー溶液を混合し、血球計算盤を使用して生存細胞をカウントします。6ウェルプレートのウェルあたり2ミリリットルのEGM培地中に10〜5番目の生細胞の2.5倍を播種する。翌日、EGM培地を取り出し、カルシウムとマグネシウムを含む3ミリリットルのPBSで各ウェルの細胞を洗浄します。次に、各ウェルに2ミリリットルのEBM培地を追加します。細胞にKSHVを感染させるには、各ウェルに5〜20マイクロリットルのウイルスストックを加え、プレートを渦巻いて懸濁液を混合します。模擬感染細胞を含む各ウェルに等量のTNEバッファーを追加します。プレートを室温で400倍gで30分間遠心分離した後、37°Cで90分間インキュベートします。次に、各ウェルに2ミリリットルのEGM培地を加え、培養物を一晩インキュベートします。インキュベーション後、各ウェルからEGM培地を取り出し、2ミリリットルの新鮮なEGMと交換します。細胞が約90%のコンフルエントに達したら、前に示したように酵素消化によって細胞を回収します。3つのウェルからの細胞を、感染後の継代の合計通過回数でラベル付けされたT75フラスコにプールします。試験または凍結する前に、模擬細胞培養およびKSHV感染内皮細胞培養を1つから3つに分割して、少なくとも2つの追加の継代で増殖させます。ここに示されているのは、古典的な丸石の外観を明らかにする、コンフルエントな模擬感染内皮細胞の顕微鏡画像です。これらの細胞の細胞分裂は、培養物がコンフルエントに達するときに接触すると阻害されます。KSHV感染した内皮細胞は、カポジ肉腫紡錘細胞を彷彿とさせる細長い紡錘体様の形態を発達させます。模擬感染細胞とは異なり、KSHV感染内皮細胞は、コンフルエントに達しても増殖し続け、多層細胞病巣の発生につながります。基質との接触を失うと、模擬感染した内皮細胞はアポトーシス細胞死、アノイキスを起こし、さらに柔らかい寒天でコロニーを形成しません。それどころか、KSHVに感染した細胞は、柔らかい寒天で培養すると、アノイキスや成長するコロニーに耐性があります。KSHV感染内皮細胞における紡錘形形態の発達は、ウイルス潜伏タンパク質ORF73の発現を伴い、程度は低いがウイルス処理能力因子ORF59の発現を伴います。緑色蛍光タンパク質でタグ付けされたKSHV BAC16に感染すると、内皮細胞は紡錘形の形態を発達させ、GFP発現を示し、観察された表現型におけるKSHV感染との偶然の関係を確認します。その開発後、この細胞培養モデルは、研究者が宿主細胞のmRNAとKSHV感染によって誘発されるタンパク質発現の変化を評価するための道を開きました。その結果、有望な治療標的であるKSHVを介した発がんの根底にある主要な病原性メカニズムが特定されました。KSHVはBSL-2エージェントであり、適切なバイオセーフティ封じ込め手順と実践で取り扱われるべきであることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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表現型の野生型アストロサイトと神経幹細胞は、floxed、条件付き発癌性対立遺伝子で操作され、ウイルスCre媒介組換えを介して形質転換されたマウスから採取され、同系で免疫能力のある同腹仔の脳に形質転換細胞を同所性注射することにより、in vitroおよびin...

モデル星細胞腫発症機序体外とインビボ皮質アストロサイトまたは条件付き、遺伝子改変マウスから神経幹細胞を使用した

我々は、その場ハイブリダイゼーション(FISH)における蛍光を利用して、凍結感染したヒト細胞内の複数のヘルペスウイルスRNAを懸濁または付着性のいずれかで可視化するプロトコルについて説明する。このプロトコルは、核細胞質比を産生する蛍光の定量を含み、免疫蛍光(IF)を有する宿主およびウイルスタンパク質の同時可視化のために拡張することができる。...

KSHV感染細胞における特定遺伝子産物の高量蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)と免疫蛍光(IF)における定量蛍光

このプロトコルは、二重生物発光イメージングによって腫瘍の進行および血管新生をリアルタイムで監視する腫瘍担持マウスモデルの確立について説明する。...

腫瘍進行と血管新生の二重生物発光イメージング

このプロトコルは、ヒト乳腺細胞の形質転換を評価するための実験的なインビトロツールを提供する。細胞増殖率、アンカレッジ非依存性増殖能、基基膜マトリックスを用いた3D培養における細胞系統の分布をフォローアップするための詳細なステップについて説明する。...

ヒト乳腺上皮細胞における発癌性転換のインビトロ評価

このプロトコルは、BAC16由来のビリオンを使用して、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスのde novo溶解感染をモデル化するin...

無細胞カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスによる De Novo 溶解性感染の確立と定量化

学ぶカポジ肉腫ヘルペスウイルスによる内皮細胞の悪性転化メカニズム。in vitroモデルを用いて遺伝子発現変化を解析し、新規治療標的の同定に貢献する研究手法を習得できます。

カポジ肉腫ヘルペスウイルスによる細胞変換を勉強するための in Vitroモデル

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カポジ肉腫ヘルペス ウイルスによる細胞変換を勉強するための in Vitroモデル

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