カポジ肉腫ヘルペス ウイルスによる細胞変換を勉強するための in Vitroモデル

この手順の全体的な目標は、KSHV感染内皮細胞の年齢および継代が一致した模擬試験を準備して、適切な制御の文脈で悪性形質転換を推進する変化を含む宿主細胞遺伝子発現のKSHV関連変化の研究を可能にすることです。この方法は、KSHV関連がんにつながる宿主細胞生物学の主要な病態生理学的変化を定義するのに役立ち、疾患の予防または治療のための新しい治療標的を特定するのに役立ちます。このシステムの主な利点は、KSHV感染後の内皮細胞の悪性形質転換が迅速かつ再現性よく起こり、年齢および継代が一致した制御細胞による発がん過程の初期事象の研究を可能にすることです。

このウイルス発がんモデルは、カポジ肉腫の発生に関する洞察を提供するだけでなく、他の種類のがんにも適用できます。カポジ肉腫は血管腫瘍であるため、この細胞培養モデルの意味は、病理学的血管新生によって引き起こされる他の疾患プロセスの理解にまで及びます。まず、テキストプロトコールに記載されているように、滅菌したTNEバッファーを調製し、ろ過します。

次に、溶液を摂氏4度で保存します。KSHV陽性EBV陰性原発性滲出液リンパ腫細胞株BCBL-1を、60ミリリットルのRPMI培地で満たされたT150フラスコで培養します。細胞を摂氏37度に維持し、5%二酸化炭素を1ミリリットルあたり10〜6番目の細胞の約1〜1.2倍の懸濁液を得る。

適切な密度に達したら、細胞を新しい培地で1〜2分割し、PMAを最終濃度の1ミリリットルあたり20ナノグラムに添加して、KSHV産生を誘導します。その後、培養物を5日間インキュベートします。5日間のインキュベーション後、細胞懸濁液を室温で5分間300倍gで回転させることにより、ウイルス粒子を回収します。

次に、上清を新しいチューブに移します。上清を再び2,500倍g、摂氏4度で10分間遠心分離し、細胞の破片を取り除きます。それが明らかになったので、TNE中の5ミリリットルの25%スクロース溶液と約30ミリリットルの上清を6本の超遠心チューブに重ねます。

バランスチューブを75, 000倍gで真空下で摂氏4度で2時間遠心分離します。遠心分離が完了したら、上清をデカントし、各チューブの縁を吸い取って、できるだけ多くの液体を取り除きます。次に、ペレット化したウイルスを150マイクロリットルのTNEバッファーに再懸濁し、すべてのサンプルをプールします。

プールした懸濁液をよく混ぜ合わせ、25マイクロリットルのアリコートに分けます。ストックウイルスはマイナス80°Cで保管してください。初代ヒト真皮微小血管またはリンパ内皮細胞をT75フラスコ内のEGM培地で培養します。

細胞培養液を摂氏37度、二酸化炭素5%に維持し、約50%のコンフルエントに達するまで維持します。内皮細胞形質導入に先立ち、20ミリリットルのDMEMを充填したT150細胞培養フラスコでPA317 LXSN 16E6E7細胞を37°C二酸化炭素で培養します。約90%のコンフルエントが達成されたら、PA317細胞培養液を16ミリリットルの新鮮な培地と交換し、細胞を一晩インキュベートします。

一晩インキュベートした後、PA317細胞培養物から培地を回収し、室温で300倍gで5分間遠心分離して清澄化します。50%コンフルエント内皮細胞培養液のEGM培地を、清澄化されたPA317培地12ミリリットルと交換します。細胞を4時間インキュベートします。

次に、6ミリリットルのPA317培地を6ミリリットルの新鮮なEGM培地と交換し、細胞を一晩インキュベートします。その後、内皮細胞培養物から培地を取り出し、12ミリリットルの新鮮なEGMを細胞に供給します。さらに48時間、細胞をインキュベートし続けます。

内皮細胞を継代培養するには、培地を取り出し、12ミリリットルのカチオンフリーPBSで細胞を洗浄します。次に、市販の酵素解離溶液3ミリリットルを加え、細胞を摂氏37度で3分間インキュベートします。細胞懸濁液を15ミリリットルのコニカルチューブに移し、細胞を300倍gで室温で5分間遠心分離します。

ペレット化したら、細胞を新鮮なEGM培地に再懸濁し、懸濁液を3つのT75フラスコに均等に分割します。培養物の量をフラスコあたり12ミリリットルのEGMに調整します。次に、G418のミリリットルあたり200マイクログラムを追加して、形質導入された内皮細胞を選択します。

前述したように、形質導入された内皮細胞を酵素消化により回収します。内皮細胞ペレットを1ミリリットルのEGM培地に再懸濁します。.次に、5マイクロリットルの細胞懸濁液と45マイクロリットルのトリパンブルー溶液を混合し、血球計算盤を使用して生存細胞をカウントします。

6ウェルプレートのウェルあたり2ミリリットルのEGM培地中に10〜5番目の生細胞の2.5倍を播種する。翌日、EGM培地を取り出し、カルシウムとマグネシウムを含む3ミリリットルのPBSで各ウェルの細胞を洗浄します。次に、各ウェルに2ミリリットルのEBM培地を追加します。

細胞にKSHVを感染させるには、各ウェルに5〜20マイクロリットルのウイルスストックを加え、プレートを渦巻いて懸濁液を混合します。模擬感染細胞を含む各ウェルに等量のTNEバッファーを追加します。プレートを室温で400倍gで30分間遠心分離した後、37°Cで90分間インキュベートします。

次に、各ウェルに2ミリリットルのEGM培地を加え、培養物を一晩インキュベートします。インキュベーション後、各ウェルからEGM培地を取り出し、2ミリリットルの新鮮なEGMと交換します。細胞が約90%のコンフルエントに達したら、前に示したように酵素消化によって細胞を回収します。

3つのウェルからの細胞を、感染後の継代の合計通過回数でラベル付けされたT75フラスコにプールします。試験または凍結する前に、模擬細胞培養およびKSHV感染内皮細胞培養を1つから3つに分割して、少なくとも2つの追加の継代で増殖させます。ここに示されているのは、古典的な丸石の外観を明らかにする、コンフルエントな模擬感染内皮細胞の顕微鏡画像です。

これらの細胞の細胞分裂は、培養物がコンフルエントに達するときに接触すると阻害されます。KSHV感染した内皮細胞は、カポジ肉腫紡錘細胞を彷彿とさせる細長い紡錘体様の形態を発達させます。模擬感染細胞とは異なり、KSHV感染内皮細胞は、コンフルエントに達しても増殖し続け、多層細胞病巣の発生につながります。

基質との接触を失うと、模擬感染した内皮細胞はアポトーシス細胞死、アノイキスを起こし、さらに柔らかい寒天でコロニーを形成しません。それどころか、KSHVに感染した細胞は、柔らかい寒天で培養すると、アノイキスや成長するコロニーに耐性があります。KSHV感染内皮細胞における紡錘形形態の発達は、ウイルス潜伏タンパク質ORF73の発現を伴い、程度は低いがウイルス処理能力因子ORF59の発現を伴います。

緑色蛍光タンパク質でタグ付けされたKSHV BAC16に感染すると、内皮細胞は紡錘形の形態を発達させ、GFP発現を示し、観察された表現型におけるKSHV感染との偶然の関係を確認します。その開発後、この細胞培養モデルは、研究者が宿主細胞のmRNAとKSHV感染によって誘発されるタンパク質発現の変化を評価するための道を開きました。その結果、有望な治療標的であるKSHVを介した発がんの根底にある主要な病原性メカニズムが特定されました。

KSHVはBSL-2エージェントであり、適切なバイオセーフティ封じ込め手順と実践で取り扱われるべきであることを忘れないでください。