複製サイクルの初期段階を監視するためにB型肝炎ウイルスのレポーターシステムの開発

この組換えHBVレポーターシステムの全体的な目標は、抗B型肝炎ウイルスまたはHBV剤の大量スクリーニングを容易に実施できるようにすることです。この方法は、抗HBV薬剤のスクリーニングやHBV因子の同定など、HBV分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、HBV レポーター システムが HBV レプリケーション サイクルの初期段階を監視できることです。

細胞培養液を調製した後、トランスベッシングの前日に、培地中のHepG2細胞6個に対して10の4倍を、10cmのコラーゲンコーティング皿の上に置きます。加湿した5%CO2インキュベーターで細胞を37°Cでインキュベートします。製造元の指示に従ってトランスベクショナリーを使用して、5 mcgのpUC1 2HBV デルタイプシロンと5 mcgのpUC1 2HBV/NLを細胞にトランスベクターします。

翌日、培地を取り出し、新鮮な培地10mLを加えます。次に、トランスベクションの1週間後、組換えHBVを含む培地を50 mLチューブに移します。次に、トランスベクション細胞を含むプレートに10 mLの新鮮な培地を加えます。

次に、2,300 x gで5分間培養培地を収集して遠心分離し、組換えHBVを含む細胞破片を除去します。上清を45 mcmのメンブレンフィルターに通します。次に、濾液に等量の25%PEG、1.5モルのNaClを加え、穏やかに混合します。

サンプルを4°Cで一晩インキュベートし、翌日、溶液を2,300 x gおよび4°Cで20分間回転させます。上清を捨て、ペレットを5mLのTNEバッファーに溶解します。次に、サンプルを再度遠心分離して細胞の破片を除去し、TNE含有組換えHBVの5 mLをTNE中の20%スクロースの8 mLにロードします。

2つを100、000 x g、摂氏15度で3時間遠心分離します。上清をできるだけ多く捨て、開始培養物40 mLあたり1 mLの無血清DMEMを使用して、ペレットを再懸濁します。懸濁液を摂氏4度で一晩インキュベートします。

翌朝、45 mcmフィルターで懸濁液をろ過します。次に、5 mLのアリコートを準備し、チューブを摂氏マイナス80度で保存します。HBV感染しやすいタウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド(NTCP)を安定して発現するHepG2細胞をプレート化し、摂氏37度、CO25%でインキュベートします。

感染の1日前に、10〜4番目のHepG2 NTCP細胞を約5回、10〜4番目のHepG2 NTCP細胞を96ウェルコラーゲンコーティングプレートのウェルに1mLの培養培地でプレートします。組換えHBVを摂氏37度の水浴で、バイアルに少量の氷が残るまで解凍します。78 mcLの新鮮培地、2 mcLのDMSO、10 mcLの40%PEG 8000を1x PBSに、および10 mcLの組換えHPVを組み合わせて、感染用の培地を調製します。

100 mcLの組換えHBV溶液を96ウェルプレートの各ウェルに添加します。感染の1日後、PBS300 mcLを使用して細胞を3回洗浄し、ウイルス画分から汚染されたレポータータンパク質を除去します。2%DMSOを含む200 mcLの培地を感染細胞に加え、1週間以内にインキュベートします。

HBV感染の解析を行うには、感染後1週間でPBSを使用して感染細胞を3回洗浄します。50 mcLのLysis Bufferを感染細胞に加えます。培養プレートを5分間揺さぶり、次に2, 000 x gで5分間遠心分離します。

レポーター基質50 mcLをルミノメータープレートに加えます。次に、20 mcLの細胞溶解物をプレートに加え、短時間振とうして混合します。最後に、プレートをルミノメーターに置き、読み取りを開始します。

このゲルは、構築したpUC1 2HBVNLレポータープラスミドと、HindIIおよびEcoRIによるpUC1 2HBVデルタヘルパープラスミドの消化を示しています。どちらのサンプルも、想定されるバンド サイズを生成します。このウェスタンブロットでは、HepG2細胞、または組換えmycタグ付きNTCPを発現し、組換えHBVに感染したHepG2細胞由来のライセートを、34 kDaの非グリコシル化タンパク質と65 kDaのグリコゾル化組換えタンパク質を認識する抗myc抗体でプローブしました。

ここに示すグラフは、レポーター遺伝子の動態を示しています。組換えHBV感染HepG2、NTCP、myc-clone 22、またはヒト初代肝細胞のRNAおよびDNAレベル。レポーター活性中のHBV RNAのレベルは、感染細胞と初代肝細胞の両方で、感染後3日目に上昇しました。

対照的に、組換えHBVは、細胞内DNA複製経路で重要な役割を果たす機能コアとポールが不足しているため、感染後9日でDNAレベルに変化はありませんでした。この図では、B型肝炎免疫グロブリン、またはHBIG、ヘパリン、およびIFNベータによる組換えHBVの阻害が示されています。HBIGとヘパリンは、レポーター活性をそれぞれ75 U/mLと150 U/mLで10%未満に強く抑制しました。

一方、IFN-βは、1000 U/mLでレポーター活性を50%未満に抑制しました。この手法を習得すると、組換えHBVの調製には1週間、感染組換えHBVの調製には6日で、要するに、レポータータンパク質の測定には、適切に実施されれば、その手段を実行することができます。この手順を試行する際には、バイアス画分から汚染されたレポータータンパク質を除去する洗浄ステップを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、組換えHBVが最初に陽性結果をもたらさなかったという追加の質問に答えるために、広範なHBVによる感染のような他の結果を実行することができます。その開発後、この技術は、HBVの分野の研究者が細胞培養モデルで抗HBV剤の開発を探求する道を開きました。このビデオを見れば、組換えHBVで細胞を精製し、感染させる方法についてよく理解できるはずです。

組換えHBVでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは常に手袋の着用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。