定量的3Dインシリコモデリング（q3DISM）

この定量的3Dインシリコモデリング(q3DISM技術)の全体的な目標は、アルツハイマー病のげっ歯類モデルの脳内の単核食細胞によるアミロイドベータの取り込みを定量化することです。この方法は、アルツハイマー病患者の脳に沈着して老人斑を形成するアミロイドベータのクリアランスを定量化するためのアルツハイマー病研究の分野における差し迫ったニーズに対応します。この技術は初めて、in vivo でのマクロファージによるアミロイドベータの真の 3-D 再構築と定量を可能にします 私たちは、in vivo でマイクロファージの食作用を視覚化および定量化するための堅牢なツールが必要だったため、アミロイドベータ沈着の研究に cued 3-Dism を使用し始めました。

この手法は、実験的なアルツハイマー病治療薬の試験において、どの薬剤がマクロファージを刺激してアミロイドβを効率的に除去するかを評価するのに役立つ可能性があります。組織サンプルを免疫染色する準備ができたら、疎水性バリアペンで囲まれた組織領域にブロッキングバッファーを充填し、加湿チャンバー内で室温で1時間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、ブロッキングバッファーを目的の最初の一次抗体と交換し、加湿チャンバー内で摂氏4度で一晩

翌朝、室温で5分間のPBS浴3回でサンプルを軽く攪拌しながら洗浄します。3回目の洗浄後、スライドを適切な蛍光二次抗体と室温で光から保護してインキュベートします。1時間後、光から保護されたPBSで切片をさらに3回洗います。

次に、示したように、次の2〜4日間で、目的の他の組織に適した一次抗体および二次抗体で細胞を標識します。細胞および超細胞のコンパートメントとアミロイドβ沈着物を効率的に染色するには、一度に1つの一次抗体のみで標識し、その後に対応する二次抗体で標識することが重要です。時間はかかりますが、結果を最適化するプロセスです。

二次抗体染色の最後の洗浄後、切片を室温の暗所で一晩完全に乾燥させます。次に、乾燥した試料を、DAPIを含む蛍光封入剤で密封したカバースリップで覆います。共焦点顕微鏡でサンプルをイメージングするには、60倍顕微鏡対物レンズを選択し、レンズに液浸油を加えます。

サンプルを顕微鏡ステージスライドホルダーに置き、オイルがスライドに接触するまで対物レンズを持ち上げます。エピ蛍光照明を使用して、焦点面を調整し、海馬または大脳皮質のアミロイド斑を特定します。次に、海馬または皮質のアミロイド沈着物を囲む活性化された単核食細胞の共焦点画像を取得します。

定性的な3Dインシリコモデリングでは、まず、すべてのZ平面で同時に染色された活性化マクロファージマーカーの空間的近接性について、分析ソフトウェアの共局在モジュールで科学的な3D画像処理を使用して共焦点データセットを分析します。活性化された単核食細胞内のファゴリソソーム染色に対応する共局在チャネルを作成します。[Mode Check] ウィンドウで [Channel A] に [TRITC] を選択し、[Channel B.In FITC] を選択し、[Threshold] を選択します。

コローカライゼーションの強度については、[ソース チャネル] を選択します。[編集] をクリックして、コローカライゼーションの色を選択します。次に、各チャンネルのしきい値を個別に調整して、特定の染色を含め、バックグラウンド信号と非特異的信号を除外します。

共局在化したボクセルは、選択した共局在色ですべての Z スタックに同時に表示されます。次に、[Build Colocalization Channel] をクリックします。作成されたコローカライザトンチャネルがDisplay Adjustmentウィンドウに表示されます。

コローカライゼーション チャネルをクリックして、チャネル統計を開きます。共局在する閾値を超える体積材料Aの割合は、ファゴリソソームが占める単球体積を表す。共局在化モジュールを使用して、アミロイドβシグナルとの空間的近接性について共局在チャネルを解析し、ファゴリソソーム内にカプセル化されたアミロイドβを定量化します。

チャネル A の共ローカライゼーション データ セットとチャネル B の Cy5 を選択し、先ほど示したように共ローカライゼーション チャネルを構築します。コローカライゼーションチャネルをクリックして、チャネル統計を再度開きます。共局在する閾値を超える体積物質Aの割合は、アミロイドβが占める食作用ソソーム体積を表す。

Surpassモジュールを使用して、共焦点画像スタックを再構築し、単球ファゴリソソーム内にカプセル化されたアミロイドベータの3Dモデルを生成します。Display Adjustment(ディスプレイ調整)ウィンドウで、マクロファージ染色のみを表示するためにTRITCを選択し、ボリュームプロパティで「add new surface」をクリックします。[設定] で、5 つまたは 1 つまでのステップ 1 である [アルゴリズム] で [サーフェス] を選択します。

[色] で、対象の色の種類を選択し、必要に応じて透明度を調整します。次に、関心領域の選択ボックスをオンにして、[次へ]をクリックします。ステップ 2/5 の [関心領域] で、X、Y、Z 座標を調整して関心セルの周囲にウィンドウを描画し、[次へ] をクリックします。

ステップ 3/5 のソース チャンネルで、TRITC ソース チャンネルを選択し、[スムーズ] ボックスをオンにします。表面積の詳細レベルを 0.4 ミクロンに設定し、[次へ] をクリックします。ステップ4/5のしきい値で、作成されたボリュームがTRITCチャネル信号と完全に重なるようにしきい値を調整し、[次へ]をクリックします。

最後に、5 つのうちの 5 つのステップで、サーフェスの分類を行い、[Filter Types] セクションで、作成するボリュームに含めるオブジェクトまたはボリュームから除外するオブジェクトのサイズに応じてオブジェクトを選択します。同じ手順を繰り返して、FITCチャネルを持つファゴリソソームとCy5チャネルを持つアミロイドベータの3Dサーフェスを作成します。定性的な3-D in silicoモデリングの後、先ほど示したように、トランスジェニックマウスとラットの脳内の単球ファゴリソソームへのアミロイドベータの取り込みを解析できます。

興味深いことに、CD68陽性ファゴリソソームが占める体積は、マウスとラットの両方で、プラークから離れた場所と比較して、Iba1陽性単核食細胞で有意に増加しており、プラークから離れた細胞と比較して、プラークの近くの単核食細胞が食作用の態勢を整えていることを示しています。また、プラーク関連単核食細胞は、プラークから離れた細胞と比較して、トランスジェニックマウスではアミロイドベータの取り込みが増加しているのに対し、トランスジェニックラットでは、アミロイドベータ線維の非常に緩やかな取り込みが全体的に観察され、プラークからの距離の関数としてのアミロイドベータ線維の食作用に明らかな変化が見られないことも注目に値します。この手順を試行する際は、共焦点画像の品質が重要であり、共局在解析中にすべてのチャンネルに同様のしきい値を適用する必要があることを覚えておくことが重要です。

その開発以来、この技術は、神経炎症の分野の研究者がアルツハイマー病のげっ歯類モデルの脳内の食作用イベントを探求する道を開いてきました。このビデオを見れば、単核食細胞、ファゴリソソーム、アミロイドベータのげっ歯類の脳切片を標識する方法をよく理解できるはずです。in vivo での 3-D における脳アミロイドベータの食作用を定量化すること。