Name: タンパク質機能を調べるための誘導LAP-タグ付けされた安定な細胞株、時空間局在とタンパク質相互作用ネットワーク (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: 学ぶ LAPタグ付き誘導安定細胞株の作製法とタンデムアフィニティ精製によるタンパク質複合体の分離技術。HEK293細胞を用いてタンパク質の時空間局在と相互作用ネットワークを高スループットで解析する方法です。

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この研究は、全米科学財団の助成金NSF-MCB1243645（JZT）によって支援されました。この資料で表明された意見、調査結果、結論または勧告は著者のものであり、必ずしも全米科学財団の見解を反映しているわけではありません。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に関与していませんでした。

注：目的の任意のタンパク質のための誘導可能なLAPタグ安定な細胞株の生成の概要を図1に示され、LAPタグ化タンパク質の発現、精製及び質量プロテオミクスのための準備の概要を、図3に示されている分析します。 1. LAPタグベクターに目的の遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）のクローニング<ol><li>シャトルベクターに目的の遺伝子のORFのクローニング。 <ol><li> N末端融合またはC末端融合のいずれかのためのプライマー内の適切にattB1およびattB2部位と関心のあるORFを増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用します。 PCR条件のためのプライマー配列および表2は、 表1を参照してください。 </li><li>ゲルは、1％アガロースゲル上で、それらを解決することにより、PCR産物を精製します。ゲルから正しいサイズである増幅バンドを切除し、DNAグラムを使用して、ゲルスライスから抽出製造元の指示に従って、エル抽出キット。 </li><li>シャトルベクターを含むattP部位とPCR産物は、製造業者の指示に従ってベクターに再結合することを可能にするリコンビナーゼでPCR産物を含む精製するattBをインキュベート（Mのaterialsの表を参照してください）。 注：空のシャトルベクターとLAP-タグ付けベクトルは（ 材料表を参照） のccd B遺伝子が含まれているとCCD B耐性細菌細胞内で増殖しなければなりません。 ORFは、これらのベクターに挿入されたときしかし、ccdB遺伝子は、クローニングされたORFでベクターを増殖させる場合、したがって、標準的なDH5α 大腸菌細胞を使用して再結合されます。 </li><li>反応生成物の1μlのDH5α 大腸菌細胞を形質転換および50mg / mlのカナマイシン13をルリアブロス（LB）寒天プレート上で形質転換細胞をプレート。 </li><li>カナマイシン耐性コロニーを選択します。 </li><li> LB私の中で選択したコロニーを育てます50 mg / mlでカナマイシンをDIAは、DNAミニプレップを行い、 表3に記載の配列決定プライマーを用いてDNA配列決定によって遺伝子の組込みを確認します。 </li></ol></li><li> LAP-タグVectorにシャトルベクターから目的の遺伝子を転送します。 <ol><li> LAP-タグベクター（N末端融合のためのpGLAP1）とに従ってLAP-タグベクターにシャトルベクターから目的の遺伝子の転送を媒介するリコンビナーゼで関心のORFの配列を検証遺伝子を含むシャトルベクターをインキュベート製造業者の説明書（材料を参照されたいです）。 注記：所望のプロモーター、エピトープタグに基づいて使用することができるLAP / TAPベクターシリーズ、NまたはC末端タグを表4に見出すことができます。 </li><li>反応生成物の1μlのDH5α 大腸菌細胞を形質転換および100mg / mlアンピシリン13をLB寒天プレート上に形質転換された細胞をプレート。 </li><li>アンピシリン耐性結腸を選択NIES。 </li><li> 100mg / mlのアンピシリンを含むLB培地中で選択したコロニーの成長、DNAミニプレップを行い、 表5に記載されている配列決定プライマーを用いてDNA配列決定によって遺伝子の統合を確認します。 </li></ol></li></ol>関心のLAP-タグ付けされた遺伝子を発現誘導する安定な細胞株の2世代<ol><li>興味のあるプロジェクトに最も適した細胞株を選択します。あるいは、構成のTetRを発現し、（材料を参照）関心のLAPタグ遺伝子が安定的にゲノムに組み込まれることを可能にするFRT部位を含む任意の既存の細胞株からの宿主細胞株を作成します。 注：このプロトコルのTetRとFRT部位を含むHEK293細胞株を使用して、[テトラサイクリン（-tet）を欠いている、10％ウシ胎児血清（FBS）で作ら] -tet DMEM / F12培地中で成長させた4 。 </li><li> 1〜2おしっこ内の宿主細胞株を殺すために必要なハイグロマイシンの最小濃度を決定薬剤添加後のKS。濃度は、大部分は、100μg/ mlの800μgの/ mlの間の範囲で、宿主細胞株の間で変化することができます。 注：37℃、5％CO 2が 1〜2週間以内に死亡するで100μg/ mlのハイグロマイシンで-tet DMEM / F12培地中で増殖させたHEK293細胞。 </li><li>製造元の指示に従ってトランスフェクション試薬を用いてHEK293細胞にLAPタグ付きベクターで（細胞のゲノム内のFRT部位への関心のLAP-タグ付けされた遺伝子の組込みを媒介）フリッパーゼリコンビナーゼを発現するベクターを同時トランスフェクト。 LAPベクトル14にリコンビナーゼベクトルの1：4の比率を使用してください。 注：最適な比率は、トランスフェクションの宿主細胞株および方法に依存し、滴定を必要とするかもしれません。 4：1の比率は、ほとんどの細胞株に適しています。ネガティブコントロールとしてモックトランスフェクションプレートが含まれます。 </li><li>ある日、トランスフェクション後、新鮮な培地で-tet DMEM / F12培地を交換してください。 </li><li>二日後transfectiで、25％コンフルエンスに細胞を分割します。 〜5時間、細胞がステップ2.2で所定の濃度でハイグロマイシン含有-tet DMEM / F12培地を追加し、添付することができます。 HEK293ために、細胞を、100μg/ mlのハイグロマイシンを使用します。 注：HEK293細胞株を含むFRTはまた、ブラストサイジン耐性と関連付けられているのTetRを含有するので、5μg/ mlのブラストサイジンをのTetRを選択し、漏出性発現を最小限にするために、安定な細胞株の選択プロセス中に使用されます。 </li><li>必要に応じて、異なる細胞巣はそれが透明板に対して不透明なスポットに似て表示されるまでハイグロマイシン含有-tet DMEM / F12培地を交換してください。 </li><li>各セルの巣の上にトリプシンの20μlを添加して、200μlのピペットチップでダウン2回をピペットと。 24ウェルプレートに入れ細胞およびハイグロマイシン含有-tet DMEM / F12培地中で継続的な成長によって細胞を拡大。 </li><li>固定細胞または生細胞蛍光顕微鏡によって誘導LAPタグ化タンパク質の発現のための画面細胞及び/又はLAP-タグ15内の GFPタグのウェスタンブロッティング。 </li></ol> LAP-タグ付けされたタンパク質複合体の3精製注：次のLAP-タグ付きタンパク質精製プロトコルは、以前の経験に基づいて、典型的なLAP-タグ付きタンパク質精製のために用いられる条件とボリューム上の推奨事項を詳しく説明します。しかし、注意が経験的な最適化は、任意のタンパク質複合体と最良の結果を提供するために、関心対象のタンパク質の発現レベルについて行われることを確実にするために行使されるべきです。 <ol><li>細胞増殖および細胞収穫。 <ol><li>継続的に37℃、5％CO 2で-tet DMEM / F12培地中でより大きなプレートおよび/またはローラーボトルの中にすべてのHEK293細胞を継代することにより、タンパク質複合体のTAP分離のための検証LAP-タグ付けされた細胞株を展開します。 </li><li>テト/ Doxの誘導性の細胞株について、harvestin前に、0.2 / mlのテト/ Doxの細胞が到達〜70％の密集度の濃度で10〜15時間誘導G細胞。 注：濃度と誘導時間は、各タンパク質について決定されるべきである、10〜15時間、0.1〜1 / mlのテト/のDoxの滴定を推奨します。 </li><li> 5-10分間、875×gで攪拌またはトリプシン処理し、細胞をペレット化することにより細胞を回収します。 </li></ol></li><li>プロテインAビーズを抗GFP抗体を結合<ol><li> 0.5ミリリットルの細胞ペレット、充填細胞容積（PCV）から調製した溶解物から免疫沈降に抗体40μgのを使用してください。 注：必要な抗体の量は、他の要因の中でも特に、LAP-タグ付けされたタンパク質の量に依存し、最適化が必要になります。 10-40μgのの滴定を推奨します。 </li><li> 1.5mlチューブにPBST（PBS + 0.1％のTween-20）中に160μlのパックされた体積（PV）プロテインAビーズを平衡化。 PBST 1mlで3回洗浄します。 注：本明細書中のすべての洗浄は、10秒間5,000×gで、ビーズを遠心分離することによって行われます。 </li><li>再懸濁ビーズを500μlのPBST中との親和性の80μgのを追加します。160μlのビーズを各チューブに-purifiedウサギ抗GFP抗体。室温（RT）で1時間混合します。 </li><li> PBST 1mlでビーズを2回洗浄します。その後、0.2 Mホウ酸ナトリウム、pHが9（20 mlの0.2 Mホウ酸ナトリウム+ 15 mlの0.2 Mホウ酸）の1mlでビーズを2回洗浄します。最終洗浄後、1ミリリットルに最終容量をもたらすために、0.2Mホウ酸ナトリウム900μlの、pHが9を追加します。 </li><li>最終濃度20mMに220ミリモルのジメチルピ（DMP）の100μLを加えます。室温で30分間穏やかにチューブを回転させます。 220 mMのDMPは、0.2 Mホウ酸ナトリウム、pHが9の877μlの1 50mgのボトルの内容物を再懸濁し、ビーズ懸濁液にすぐに追加します。 </li><li> DMPとのインキュベーションの後、残留架橋剤を不活性化するために、0.2Mエタノールアミン、0.2 MのNaCl pH8.5の1mlでビーズを1時間を洗います。同じ緩衝液1ml中に再懸濁ビーズ、室温で1時間回転させます。ペレットビーズおよび0.2 Mエタノールアミン、0.2 MのNaCl pH8.5の500μlの中に再懸濁ビーズ。ビーズはSeveraのために安定しています4℃でリットルヶ月。 </li></ol></li><li>細胞溶解および複雑な精製のための緩衝液の調製<ol><li> pH7.4の溶液を製造することにより、（タンパク質を溶出する前に洗濯ビーズのための最もビーズの洗浄のための細胞溶解のための300ミリメートル、200ミリメートル、100ミリメートル×は、所望の塩濃度であるLAPバッファの[のKCl]）LAPXバッファを準備します50mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、XのKCl、1mMのエチレングリコール四酢酸（EGTA）、1mMのMgCl 2、及び10％グリセロールを含みます。 注：このバッファの構成要素は、生細胞環境を近似するために使用されます。 HEPESは、7.2から8.2のpH怒りのバッファとして使用されています。 KClを緩衝液のイオン強度を維持するために使用される塩です。 EGTAは、マグネシウムに比べてカルシウムのレベルを減少させるためにカルシウムイオンを結合するキレート剤です。グリセロールおよびMgCl 2は、タンパク質の安定性を改善するために使用されます。 </li><li> 0.05％ノニルphenoxypolを追加することによってLAPX Nバッファを準備LAPXバッファへyethoxylethanol。 注：ノニルphenoxypolyethoxylethanolは、タンパク質を可溶化、中性洗剤であるが、より高い濃度が、抽出プロセス中に使用されるタンパク質 - タンパク質相互作用を維持し、それが次に、結合及び洗浄の工程の間に低下します。 </li></ol></li><li>細胞溶解物の調製<ol><li> 0.5 mMのジチオスレイトール（DTT）およびプロテアーゼ阻害剤とLAP300の2.5ミリリットルにPCVを500μlを再懸濁します。 10％のノニルphenoxypolyethoxylethanol（最終0.3％）の90μlを添加して、反転により混合します。 </li><li> 10分間氷上に置きます。 10分間、21,000×gで遠心分離します。この低速上清（LSS）を収集します。ゲル分析のためのLSSの10μlのサンプルを取ります。 </li><li> 4℃で1時間、100,000×gでTLA100.3管とスピンにLSSを転送します。チューブに、この高速上清（HSS）を収集し、氷上に置きます。ゲル分析のためにHSSの10μlのサンプルを取ります。 注：一番上の脂質層ANを服用しないでくださいDボトムほとんどの細胞破片層。脂質層は、HSSを収集する前に、真空吸引によって除去されるべきです。 </li></ol></li><li>第1の親和性キャプチャ：抗GFPビーズへの結合<ol><li>プレ溶出抗体結合されたビーズは、非結合を取り除くために、溶出緩衝液[20 mMトリス、pHが7.4と3.5 MのMgCl 2]の1ミリリットルでそれらを3回洗浄することにより（0.5ミリリットル細胞ペレット（PCV）あたりのビーズの160μlのを使用します）抗体とは、バックグラウンドを低減します。迅速に行います。長時間の高塩中のビーズを放置しないでください。 </li><li> LAP200 N 1mlでビーズを3回洗浄。 HSSは、4℃で1時間、抗体ビーズを用いて抽出し混合します。 10分間、21,000×gで遠心分離します。上清の10μlのサンプルを取る（ すなわち 、（FT）を流れる）ゲル分析のために。 </li><li> 0.5 mMのDTTおよびプロテアーゼ阻害剤とLAP200 N 1mlでビーズを3回洗浄。 0.5 mMのDTTおよびプロテアーゼ阻害剤とLAP200 N 1mlでビーズを2回（各5分）洗浄します。すぐに2トンを洗いますタバコエッチウイルス（TEV）プロテアーゼを加える前に0.5 mMのDTTなしプロテアーゼ阻害剤とLAP200 Nの1ミリリットルでのIME。 </li></ol></li><li> TEV切断<ol><li> LAP200 Nの1ミリリットル中に10μgのTEVプロテアーゼを希釈し、4℃で一晩チューブを回転させます。 注：このステップは、LAP-タグ付けされたタンパク質複合体の維持を助けることができるTEVプロテアーゼの濃度を調整することにより、数時間で完了すべきLAPタグタンパク質のために最適化することができます。 </li><li>新しいチューブへのペレット、ビーズおよび転送上清。任意の残留タンパク質を除去するために、160μlの0.5 mMのDTTおよびプロテアーゼ阻害剤とのLAP200 N（トリプル濃度）で2回ビーズを洗浄します。ゲル分析のために上清の10μlのサンプルを取ります。 </li></ol></li><li>第二に親和性のキャプチャ：Sプロテインアガロースへの結合<ol><li> 80μlのSタンパク質アガローススラリーの1チューブ（40μlを充填した樹脂）LAP200 Nの1ミリリットルで3回洗浄します。 注：S PROTEINがアクティブのRNaseを再構成しますS-タグに結合し、代替第二のエピトープタグは、RNAを含むタンパク質複合体のために考慮されるべきです。 </li><li> TEVを追加Sタンパク質アガロースビーズと4℃で3時間、岩に上清を溶出しました。ペレット、ビーズおよび0.5mM DTTおよびプロテアーゼ阻害剤とLAP200 N 1mlで3回洗浄します。 LAP100 1mlでビーズを2回洗浄します。 </li></ol></li><li>タンパク質溶出<ol><li> 10分間97℃で4×Laemmliサンプル緩衝液と熱の50μLを添加することによって、アガロースSタンパク質をタンパク質をオフ溶出。 注記：タンパク質は、溶出緩衝液（20mMのTris、pH7.4で3.5 MのMgCl 2）を用いてビーズから溶出することができます。 </li></ol></li></ol> 4.質量分析によって相互作用するタンパク質を同定<ol><li>参照（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）、銀染色ゲルにより収集されたサンプルを分析することによって、精製の品質をテストします<stronグラム&gt;材料表）および溶出液を免疫ブロット法およびLAPタグ付き精製が16を働いたことを確認するために、抗GFP抗体でプロービングすることにより、 図4を参照してください。 </li><li>化学量論的および準化学量論的同時精製の種を同定するために、最終的な溶出サンプルを採取し、SDS-PAGEによってそれを分けます。質量分析互換性のタンパク質染色でゲルを染色。最も顕著なバンドやゲルからそれらの間にスペースを切除し、質量分析別途16による分析のためにそれらを処理します。 注：最終精製の溶出液を分離し、質量分析5のためにそれらを調製するための多くのアプローチがあります。例えば、LAP精製複合体は、高塩（3.5 MのMgCl 2）を使用して、Sタンパク質のビーズから溶出することができ、ひとまとめ全タンパク質集団は、質量分析17によって分析することができます。あるいは、最後の溶出液を1 SDS-PAGEによるミリおよびeできる単一の1ミリバンドのために分離することができますxcisedと分析しました。これは、分析を妨害する任意のビーズまたは粒子状物質の複雑な混合物をクリアします。 </li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

概説プロトコルは、LAP-タギングベクターに目的の遺伝子のクローニングを記載し、誘導性LAP-タグ付けされた安定な細胞株の生成、およびプロテオーム解析のためのLAP-タグ付けされたタンパク質複合体の精製。他のLAP / TAP-タギングアプローチに関して、このプロトコルは、任意の細胞経路内のタンパク質の局在化およびタンパク質 - タンパク質相互作用をマッピングするための高スループットアプローチに適合するように合理化されています。このアプローチは、広くいくつか例を挙げると、細胞周期進行、有糸分裂紡錘体アセンブリ、紡錘体極の恒常性、およびciliogenesisための重要なタンパク質の機能的特徴に適用されており、これらのタンパク質の誤調節は、ヒトの疾患15に導くことができる方法の理解を助けています16,19,20。たとえば、私たちのグループは最近定義するには、スピンドル・アセンブリ15,21にSTARD9の有糸分裂キネシン（候補癌ターゲット）の機能と規制を定義するには、このシステムを利用しますTctex1d2ダイニン軽鎖間の新たな分子リンク そして、ショートリブ多指症症候群（SRPS）19、およびMID2ユビキチンリガーゼの突然変異は、X連鎖知的障害者16につながることができますどのように理解するための新たな分子リンクを定義します。他の研究室では、正常なTctn1、マウスヘッジホッグシグナリングのレギュレータは、組織に依存した方法22,23で規制繊毛膜組成とciliogenesisこと繊毛病関連タンパク質複合体の一部であると判断したものを含め、この方法を適用しています。したがって、このプロトコルは、広く任意の細胞経路の切開に適用することができます。 このプロトコルにおける重要なステップは、ハイグロマイシン耐性であるLAPタグ安定な細胞株の選択です。特別なケアは、コントロールプレート内のすべてのセルが増幅するための実験プレートに焦点を選択する前に死んでいることを確実にするために注意すべきです。ハイグロマイシンもADDEすることができますLAP-タグ付けされた安定な細胞株のルーチン細胞培養中のdはさらに、すべての細胞がFRT部位での関心のLAP-タグ付けされた遺伝子を維持することを確実にします。我々は、すべてLAPタグタンパク質は機能的で、タンパク質の機能をテストするために使用することができる場所でアッセイを有することが重要であるということだろうと警告します。タンパク質の機能をテストするために使用されるアッセイの例は、siRNA誘導性の表現型のインビトロ活性アッセイで救助を含みます。大LAP-タグを付加した任意の潜在的な問題に対処するために、我々は以前に、目的のタンパク質の機能および局在化を阻害する可能性が低いFLAGのような小さいタグを含むこのシステムと互換性TAP-タグベクトルを生成しています4。また、LAP-タギングベクターは、C末端LAPタグタンパク質またはLAP / TAPタグがNで許容されていない場合に使用することができ、このシステムと互換性のあるC末端TAPタグ化タンパク質を生成するために存在しますタンパク質の末端。また、第精製バッファー（LAPX N）の電子塩と洗剤濃度が増加またはnoneまたはあまりにも多くの相互作用が認められた場合に精製ジェンシーが低下するように改変することができます。同様に、タンデムアフィニティー精製法は、単一の精製手順と弱い相互作用が少ない又は全く相互作用が同定されている場合、単一の精製スキームを使用することができ、したがって、失われる可能性がより厳しいです。 タンパク質の局在化および精製研究24,25のためのタグ付け、大規模なGFPタンパク質を可能にする他のGFPのエピトープ標識のアプローチが存在することに留意することが重要です。これらはすべて、調節要素、模倣内因性遺伝子発現24が含まれ、それらの天然の環境から関心のGFPタグ遺伝子を発現する細菌人工染色体を利用BAC TransgenOmicsアプローチが含まれます。さらに最近では、CAS9 /シングルガイド付きRNA（sgRNA）リボ核タンパク質複合体（RNPを）が終了するために使用されてきましたogenouslyそれらの内因性のゲノム遺伝子座25からGFPタグ遺伝子の発現を可能にするスプリットGFPシステムと目的の遺伝子にタグを付けます。これらのアプローチの両方は、LAP-タギングプロトコルと比較して、内因性の条件の下でタグ付けされたタンパク質の発現を可能にするが、彼らは関心のタグ付けされた遺伝子の誘導および調節可能な発現を可能にしない、ここで説明します。さらに、それらは、TAPのためのタンデムエピトープタグに適用されるには至っていません。他のタグ付けシステムはまた、誘導性エピトープタグ安定な細胞株を生成するために、ここで説明したシステムと互換になるように修正することができることに留意することも重要です。例えば、近接依存ビオチン識別（BioID）が原因で相互作用するタンパク質26の間の空間的および時間的関係を定義する能力にかなりの注目を集めています。この技術は、大腸菌ビオチンリガーゼBirAをの無差別歪み、ビオチン化タンパク質融合を利用します酵素の〜10nmの半径内の任意のタンパク質は、S。ビオチン化タンパク質は、次いで、親和性は、ビオチンアフィニティー捕捉を用いて精製し、質量分析により組成を分析します。 BirAを、複雑な27の中に弱い相互作用パートナーを検出するために特に適していますこれは、あっても一時的に、近接して任意のタンパク質をビオチン化されます。さらに、精製スキームは、内因性のタンパク質 - タンパク質相互作用が無傷のままであり、従って、偽陽性の割合を減少させる、変性条件下で行うことができることを必要としません。私たちの現在のプロトコルの中で、あるBirA-タギングベクターによるpGLAP1ベクトルの置換は、近接性に基づいてそれらを検出するとの親和性に基づいてタンパク質 - タンパク質相互作用を同定するから、このシステムを変換することができます。多くの酵素 - 基質相互作用の間及び時空間のタンパク質 - タンパク質INTEをマッピングする場合のように、このようなシステムは、一過性タンパク質相互作用を検出するために非常に有利であろう中心体と繊毛26,28のために行われているように定義される構造内ractions。

特徴付けられていないタンパク質の細胞機能を調査するためには、そのin vivo時空間的な細胞内局在と相互作用するタンパク質パートナーを決定することが重要です。従来、目的のタンパク質のN末端またはC末端に融合したシングルエピトープタグおよびタンデムエピトープタグは、タンパク質の局在化およびタンパク質相互作用の研究を促進するために使用されてきました。例えば、タンデムアフィニティー精製(TAP)技術により、酵母細胞株と哺乳類細胞株の両方において、存在量が少ないものであっても、天然のタンパク質複合体を単離することが可能になりました1,2。ローカリゼーションおよびアフィニティー精製(LAP)技術は、エピトープタグ3の1つとして緑色蛍光タンパク質(GFP)を導入することにより、TAP手順を変更してローカリゼーション成分を含むようにする、より最近の開発である。このアプローチにより、研究者は生細胞におけるタンパク質の細胞内局在をより深く理解すると同時に、TAP複合体の精製を行ってタンパク質間相互作用ネットワークをマッピングする能力も保持できるようになりました。
しかし、TAP/LAP技術の使用には多くの問題があり、それが哺乳類細胞での広範な使用を妨げています。例えば、目的のTAP/LAPタグ付きタンパク質を発現する安定な細胞株を生成するのに必要な時間の長さ。これは通常、目的の遺伝子をウイルスベクターにクローニングし、目的の発現レベルを持つシングルセル安定インテグラントを選択することに依存しています。さらに、多くの細胞経路は構成的タンパク質の過剰発現に敏感であり(低レベルであっても)、時間の経過とともに細胞を停止させたり、細胞死を引き起こしたりして、TAP/LAP安定細胞株の生成を不可能にする可能性があります。このような制約により、LAP/TAP法がタンパク質の局在化やタンパク質複合体の解明のためのハイスループットシステムになることが妨げられています。そのため、クローニングおよび細胞株技術の現在の革新を活用した、哺乳類細胞用の誘導性ハイスループットLAPタグシステムの開発にかなりの関心が寄せられています。
ここでは、クローニングと哺乳類の細胞株技術の両方の進歩を適用する、目的のドキシサイクリン/テトラサイクリン(Dox/Tet)誘導性LAPタグ付きタンパク質を使用して安定した細胞株を生成するためのプロトコルを紹介します。このアプローチは、LAPタグ付きタンパク質の細胞内局在、タンパク質複合体の精製、および相互作用するタンパク質の同定に関するデータの取得を効率化します4。アフィニティープロテオミクスは、タンパク質複合体の解明に幅広い技術を利用していますが5、私たちのアプローチは、これらの複合体とそのネイティブ相互作用ネットワークの同定を促進するために有益であり、多数のタンパク質成分を含む複雑な生物学的経路を調査するために必要なハイスループットタンパク質タグ付けに適しています。このアプローチの鍵となるのは、in vitro、細菌やバキュロウイルスなどのさまざまな生物、および哺乳類細胞における遺伝子発現のための標的遺伝子の配列への高忠実度かつ迅速なクローニングを可能にするクローニング戦略の進歩です6,7。さらに、ORFeomeコラボレーションは、これらのクローニングの進歩を組み込んだベクターで、数千の配列検証済みのオープンリーディングフレームをクローニングしており、科学コミュニティ8-11で利用可能です。当社のシステムでは、pGLAP1 LAPタギングベクターにより、多数のクローンの同時クローニングが可能になり、ハイスループットのLAPタギングが容易になります。この迅速なクローニング手順は、事前に決定された単一のゲノム遺伝子座にLAPタグ付き目的の遺伝子を挿入した細胞株を作製するための合理化されたアプローチと組み合わされています。これは、ゲノム内に単一のflippase recognition target(FRT)部位を含む細胞株を利用します。これは、LAPタグ付き遺伝子の統合部位です。これらの細胞株は、LAPタグ付き遺伝子の上流にあるTetオペレーター(TetO2)に結合し、Dox/Tetの非存在下でそれらの発現をサイレンシングするテトラサイクリンリプレッサー(TetR)も発現します。これにより、LAPタグ付きタンパク質のDox/Tet誘導性発現がいつでも可能になります。なぜなら、多くの細胞経路は、その経路を支配する重要なタンパク質のレベルに敏感であり、これらのタンパク質が低レベルであっても構成的に過剰発現すると細胞増殖を停止したり、細胞死を引き起こしたりする可能性があるため、誘導性LAPタグ付き安定細胞株の作製が不可能になる12。

<table><tbody><tr><td>Flp-In T-REx Core Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K6500-01</td><td>Kit for generating cell lines that contains an FRT site and TrtR expression</td></tr><tr><td>PETG, 5x</td><td>Nunc, Inc.&nbsp;</td><td>73520-734</td><td>成長細胞用ローラーボトル</td></tr><tr><td>PETG, 2.5x</td><td>Nunc, Inc.&nbsp;</td><td>73520-420</td><td>成長細胞用ローラーボトル</td></tr><tr><td>セルスタッカー</td><td>Corning CellSTACK</td><td>3271</td><td>成長細胞用セルスタッカー</td></tr><tr><td>500 ml 円錐形遠心分離管</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td>細胞を採取するための431123チューブ</td></tr><tr><td>抗GFP抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td>ウサギ 抗GFP抗体</td></tr><tr><td>Affiprep Protein Aビーズ</td><td>Biorad</td><td>156-0006</td><td>抗GFP抗体を標識するためのマトリックスとして使用</td></tr><tr><td>ジメチルピメリミデート(DMP)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21667</td><td>抗GFP抗体をプロテインAビーズ</td></tr><tr><td>TLA100.3チューブ</td>に結合するために使用<td>Beckman</td><td>349622</td><td>透明化ステップ中にタンパク質ライセートを遠心分離するためのチューブ</td></tr><tr><td>TEVプロテアーゼ</td><td>Invitrogen</td><td>12575-015</td><td>N末端LAPタグ付きタンパク質のGFPタグ切断に使用</td></tr><tr><td>歳差運動プロテアーゼ</td><td>GE Healthcare</td><td>27-0843-01</td><td>C末端LAPタグ付きタンパク質のGFPタグ切断に使用</td></tr><tr><td>Sタンパク質アガロース</td><td>Novagen</td><td>69704</td><td>LAPタグ付きタンパク質複合体の精製中に第2のアフィニティーマトリックスとして使用</td></tr><tr><td>QIAquick DNAゲル抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>28704/28706</td><td>アガロースゲルBP</td></tr>クローナーゼIIからのPCR産物の精製に使用 <tr><td>BP</td><td>クローナーゼII</td><td>Invitrogen</td> 11789020 <td>ORF PCR産物をpDONR221シャトル</td></tr><tr><td>ベクターLRクローナーゼII</td><td>に</td>クローニングするために使用されます <td>11791020</td><td>目的遺伝子のORFをpGLAP1 LAP標識ベクターにクローニングするために使用</td></tr><tr><td>ccdB Survival 2 T1R E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>A10460</td><td>シャトルベクターおよびpGLAPエンプティベクターのプロパゲーションに使用</td></tr><tr><td>Fugene 6</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td>ヒト細胞へのベクタートランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>テトラサイクリン</td><td>Invitrogen</td><td>Q100-19</td><td>Dox/Tet誘導性タンパク質発現誘導薬&nbsp;</td></tr><tr><td>ドキシサイクリン</td><td>Clontech</td><td>631311</td><td>Dox/Tet誘導性タンパク質発現誘導薬&nbsp;</td></tr><tr><td>ハイグロマイシンB</td><td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td>安定LAPタグ付きインテグラントを選択するための薬剤</td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>コーニング</td><td>61-176-RG</td><td>カナマイシン耐性細菌コロニーを選択するための薬剤</td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>フィッシャー</td><td>BP1760-5</td><td>アンピシリン耐性細菌コロニーを選択するための薬剤</td></tr><tr><td>4-20% トリスグリシン SDS-PAGEゲル</td><td>バイオラッド</td><td>4561094</td><td>タンパク質サンプルの分離と最終的なLAPタグ精製液の溶出液</td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>Biorad</td><td>1610449</td><td>LAPタグ付き溶液の溶出液と精製プロセス全体で収集されたサンプルの銀染色に使用されます&nbsp;</td></tr><tr><td>Coomassie Blue stain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>SDS-PAGEゲルの染色に使用 LAPタグ付き精製の可視化やタンパク質バンドの切り出し、質量分析に対応</td></tr><tr><td>シャトルベクター pDONR221</td><td>Invitrogen</td><td>12536017</td><td>目的の遺伝子のORFをクローニングするためのシャトルベクター</td></tr><tr><td>Flippase発現ベクター pOG44</td><td>Invitrogen</td><td>V600520</td><td>細胞株を含むFRT部位のゲノムにLAPタグ付き遺伝子を組み込むためのFlippaseリコンビナーゼを発現するベクター</td></tr><tr><td>プラチナTaq DNAポリメラーゼ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10966018</td><td>目的遺伝子のORFのPCR増幅に使用</td></tr><tr><td>4x Laemmli サンプルバッファー</td><td>Biorad</td><td>1610747</td> ビーズマトリックスLuria broth(LB)培地<td>から精製されたLAPタグ付きタンパク質複合体を溶出するためのサンプルバッファー</td></tr><tr><td></td><td>フィ</td><td>ッシャーBP9723-2</td><td>DH5&α;細菌</td></tr><tr><td>DNAミニプレップキット</td><td>プロメガ</td><td>A1222</td><td>DNAプラスミドミニプレップ</td></tr><tr><td>DMEM/F12培地</td><td>Hyclone</td><td>SH30023.01</td><td>Hek293ヒト細胞の増殖に使用</td></tr><tr><td>FBSはテット</td><td>アルタンタバイオロジカルズ</td><td>S10350</td>を欠いています 誘導<td>性LAPタグ付き安定細胞株の生成と成長のための-Tet DMEM/F12培地の製造に使用</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>ハイクロン</td><td>SH30042.01</td><td>Hek293細胞病巣をプレートから持ち上げるため</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤錠剤</td><td>ロシュ</td><td>11836170001</td><td>プロトコルバッファー、EDTAフリー</td></tr>の<tr><td>10%ノニルフェノキシポリエトキシレタノール&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>11332473001</td><td>プロトコル緩衝材の製造に使用</td></tr><tr><td>PBS</td><td>コーニング</td><td>21-040-CM</td><td>プロトコル緩衝材の製造に使用</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>フィッシャー</td><td>BP337-500</td><td>プロトコル緩衝液の製造に使用</td></tr><tr><td>ホウ酸ナトリウム</td><td>フィッシャー</td><td>S249-500</td><td>プロトコル緩衝液の製造に使用</td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>フィッシャーA78-500</td><td></td><td>プロトコル緩衝液の製造に使用</td></tr><tr><td>エタノールアミン</td><td>Calbiochem</td><td>34115</td><td>プロトコル緩衝液NaCl</td></tr>フィ<tr><td></td><td>ッシャーP217-3</td><td>を作るために使用される プロトコル緩衝材</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP358-10</td><td>を作るために使用される プロトコル緩衝液を作るために使用される</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール(DTT)</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP172-25</td><td>プロトコル緩衝液</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisherを作るために使用される</td><td>M33-500</td><td>プロトコルバッファーの作成に使用</td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>フィッシャー</td><td>BP152-5</td><td>プロトコルバッファーの作成に使用</td></tr></tbody></table>

タンパク質機能を調べるための誘導lap-タグ付けされた安定な細胞株、時空間局在とタンパク質相互作用ネットワーク

Inducible LAP-tagged Stable Cell Lines for Investigating Protein Function, Spatiotemporal Localization and Protein Interaction Networks

複数のタンパク質複合体は、単独で作用する単一のタンパク質ではなく、細胞の恒常性を調節する分子経路をしばしば支配しています。この原理に基づき、これらの経路の機能に必要な重要なタンパク質とその天然の相互作用パートナーの精製により、これらの経路のタンパク質成分のマッピングが可能になっただけでなく、これらのタンパク質がどのように調整されてこれらの経路を制御するかについてのより深い理解も得られました。このような状況下では、タンパク質の時空間的な局在とタンパク質間相互作用ネットワークを理解することは、経路内でのその役割や、その誤った調節が疾患の病因にどのようにつながるかを定義するのに役立ちます。このニーズに対応するため、タンデムアフィニティー精製(TAP)やローカリゼーション&アフィニティー精製(LAP)など、タンパク質精製のためのいくつかのアプローチが設計され、成功裏に使用されています。しかし、これらのアプローチをパスウェイスケールのプロテオミクス解析に適用するためには、クローニングや哺乳類の安定細胞株作製における最新の技術開発を取り入れて、これらの戦略を補完する必要があります。ここでは、タンパク質の細胞内局在およびタンパク質間相互作用ネットワークを調査するために、LAPタグ付きヒト誘導性安定細胞株を作製する方法について述べます。このアプローチは、細胞分裂を含む複数の細胞経路の解剖にうまく適用されており、ハイスループットプロテオミクス解析に適合しています。

このシステムの有用性を強調するために、タウの微小管結合タンパク質のオープンリーディングフレーム（ORF）を有するPCR産物にattB1およびattB2部位を含むプライマーを用いてタウORFを増幅した （ 表1）とインキュベートすることによって、シャトルベクターにクローニングしました。シャトルベクター、シャトルベクターへのPCR産物の挿入を媒介するリコンビナーゼ。反応生成物は、タウの挿入を確実にするために配列決定されたカナマイシン耐性コロニーからDH5α細菌13とプラスミドDNAを形質転換しました。シャトルタウのベクトルを検証シーケンスは、その後pGLAP1ベクターでシャトルタウベクトルをインキュベートすることにより、LAP（EGFP-TEV-S-タンパク質）タグとインフレームでタウを融合しpGLAP1ベクターにタウORFを転送するために使用されましたそして、pGLAP1へのシャトルベクターからORFの伝達を仲介するリコンビナーゼ。反応生成物をDH5α細菌を形質転換するために使用しました。アンピシリン耐性コロニーから13プラスミドDNAは、LAP-タウ融合がフレームにあったことを確認するために配列決定しました。 pGLAP1-LAP-タウ検証シーケンスは、その後、LAP-タグ付けされた遺伝子のための組込み部位であるそのゲノム内に単一フリッパーゼ認識ターゲット（FRT）部位を含むHEK293細胞にフリッパーゼの組換え酵素を発現するベクターで同時トランスフェクトしました。 14。この細胞株はまた、LAP-タグ付けされた遺伝子の上流のTetオペレーターに結合し、テト/ドックスの非存在下でのそれらの発現をサイレンシングのTetRを表明しました。安定な組込みは、5日間、100μg/ mlのハイグロマイシンと-tet DMEM / F12培地で選択しました。個々のハイグロマイシン耐性細胞の増殖巣は、トップと上下にピペッティング2倍にトリプシン20μlのを追加することにより回収しました。細胞を24ウェルプレートに入れ、-tet DMEM / F12培地中で継続的な成長により増殖させました。 ハイグロマイシン耐性細胞かどうかを確認するにはsはLAP-タウを発現することができた、HEK293 LAP-タウ細胞は15時間、そしてタンパク質抽出物については0.1μg/ mlのdoxで誘導したが誘導非およびDoxを誘発された細胞から調製しました。これらの抽出物は、SDS-PAGEによって分離し、PVDF膜に転写し、ローディングコントロールとしてGFPおよびチューブリンについて免疫ブロットしました。 図4Aに見られるように、（抗GFP抗体で可視化）、LAP-タウのみのDoxの存在下で発現させました。以前内因性タウ18のために示されていたとしてLAP-タウが正しく、有糸分裂の間有糸分裂微小管スピンドルに局在していたことを検証するために、HEK293 LAP-タウの細胞は、15時間を0.1μg/ mlのdoxで誘導し、細胞を4％パラホルムアルデヒドと共染色DNA（ヘキスト33342）と微小管（抗チューブリン抗体）のために。一貫して、LAP-タウは、有糸分裂の中期（ 図4B）の間、紡錘体に局在していました。そのLAP-タウとその相互作用するタンパク質を確認するには、このSYSで精製することができましたTEM、HEK293 LAP-タウ細胞は、攪拌によって回収し、15時間は0.1μg/ mlのドキシサイクリンで誘導し、ローラーボトルへ〜70％コンフルエントに増殖させLAP300緩衝液で溶解し、そしてLAP-tauが上記のプロトコルを使用して精製しました。 LAP-タウの精製からの溶出液をSDS-PAGEにより分離し、ゲルを銀染色しました。 図4Cは、アスタリスクでマークされたLAP-タウの精製は、LAP-タウとタウ相互作用するタンパク質の指標を見ることができるいくつかの他のバンドであることを示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54870/54870fig1.jpg"> 図1： 関心の任意のタンパク質のためのLAP-タグ付けされた誘導安定細胞株の生成の概要。目的の遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）のにattB1およびattB2部位をそれぞれ5 'および3'末端配列を、隣接して増幅される（プライマー配列は、で与えられます 表1）にクローン化しシャトルベクター。目的の遺伝子との配列確認シャトルベクターは、次いでpGLAP1ベクターに目的の遺伝子を転送するために使用されます。配列は、目的の遺伝子とpGLAP1ベクターは、その後LAPのための組込み部位であり、そのゲノム内の単一フリッパーゼ認識標的（FRT）部位を含む所望の細胞株にフリッパーゼリコンビナーゼを含有するベクターで同時トランスフェクトされた検証しましたタグ付きの遺伝子。これらの細胞株はまた、LAPタグ遺伝子の上流のTetオペレーター（のtetO 2）に結合し、テト/のDoxの非存在下でのそれらの発現をサイレンシングTetリプレッサー（のTetR）を発現します。関心のLAP-タグ付けされた遺伝子は、次にFRT部位に組み換えされ、安定した組込みをハイグロマイシンで選択されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 2 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 54870 / 54870fig2.jpg "/&gt; 図2：LAP- タグ付けされた安定な細胞株のためのアプリケーションの概要。 LAPタグ誘導安定細胞株は、Doxの添加によって関心のLAPタグ化タンパク質を発現するように誘導され、細胞周期の様々な段階で同期することができ、または任意の所望のシグナル伝達経路を活性化する化学物質またはリガンドで刺激することができます。関心のLAPタグ化タンパク質の細胞内局在は、生細胞または固定細胞イメージングにより分析することができます。 LAPタグ付きタンパク質はまた、タンデムアフィニティー精製及びそれらの相互作用するタンパク質を液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS / MS）によって同定することができることができます。最後に、Cytoscapeは、ベイトタンパク質のタンパク質 - タンパク質相互作用のネットワークを生成するために使用することができます。 DOXは、ドキシサイクリンを示し、IPは免疫沈降を示し、EGFPは強化緑色蛍光タンパク質を示し、TEVは、TEVプロテアーゼ切断部位を示し、Sは、Sタグを示しています。http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 "&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54870/54870fig3.jpg"> 図3： 質量分析のためのLAPタグ付きタンパク質の発現、精製および準備の概要。 LAP-タグ付きタンパク質発現の1）成長と誘導溶解物、2）細胞の回収および溶解、3）の準備、の4）抗GFPビーズに溶解物の結合、5）TEVプロテアーゼ切断：プロトコルは9段階になっていGFP-タグは、6）S-タンパク質ビーズに溶解物の結合、7）ベイトタンパク質と相互作用するタンパク質、および8-9）質量分析ベースのプロテオミクス分析のためのサンプルの準備の溶出。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54870/54870fig4.jpg"> 図4：LAP- タウ式の検証。非誘導のタンパク質サンプルの（A）ウエスタンブロット（WB）分析とのDox誘導されたLAP-タウHEK293細胞を、それぞれ、LAPタグタウタンパク質およびチューブリン負荷対照を検出するために、抗GFPおよび抗チューブリン抗体でプローブしました。細胞をDoxを用いて誘導されるときLAP-タウのみ発現していることに注意してください。 LAP-タウを発現している（B）有糸分裂細胞を固定し、共染色抗チューブリン抗体およびLAP-タウの細胞内局在を有するDNA（ヘキスト33342）およびチューブリン（タブ）のために、蛍光縮小コピーによって分析しました。そのLAP-タウが有糸分裂時に紡錘体および紡錘体極に局在注意してください。 LAP-タウ精製の（C）銀染色ゲル。 MWは分子量を表し、CLはクリアされた溶解物を示し、EインドATE最終溶出液。サンプルは、4~20％SDS-PAGE上で泳動したゲルを銀は、精製されたタンパク質を可視化するために染色しました。 LAP-タウに対応するバンドが同時精製タンパク質が見られるために、対応するアスタリスクといくつかの他のバンドでマークされていることに注意してください。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> N末端融合 </td><td></td></tr><tr><td>フォワード</td><td> 5'- GGGGACAAGT TTGTACAAAAAAGCAGGCT TCATG - （&gt; 18gsn）-3 ' </td></tr><tr><td>逆</td><td> 5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT T TTATCA - （&gt; 18gsn）-3 ' </td></tr><tr><td> C末端融合 </td><td></td></tr><tr><td>フォワード</td><td> 5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC - （&gt; 18gsn）-3 ' </td></tr><tr><td>逆</td><td> 5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT G - （&gt; 18gsn）-3 ' </td></tr></tbody></table> 表1：シャトルベクターに挿入するためのORFまたは対象を増幅するためのフォワードおよびリバースプライマー。 attB部位は、太字で強調表示され、GSNは、18以上の遺伝子特異的ヌクレオチドがプライマーに付加されていることを意味します。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> ステップ </td><td> 温度 </td><td> 時間 </td></tr><tr><td colspan="2">最初の変性</td><td> 94°C </td><td> 2分</td></tr><tr><td rowspan="3"> PCR増幅サイクル（35） </td><td>変性</td><td> 94°C </td><td> 30秒</td></tr><tr><td>焼きなまし</td><td> 55℃（プライマーのTmに応じて） </td><td> 30秒</td></tr><tr><td>延長する</td><td> 72°C </td><td> 1分/キロバイト</td></tr><tr><td colspan="2">ホールド</td><td> 4°C </td><td>無期限に</td></tr></tbody></table> 表2：利息のORFの増幅のためのPCR条件。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> ベクター </td><td> フォワードシークエンシングプライマー </td><td> リバースシークエンシングプライマー </td></tr><tr><td>シャトルベクター</td><td> 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ' </td><td> 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3 ' </td></tr></tbody></table> 表3：シャトルベクターのためのフォワードおよびリバース配列決定プライマー。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> ID </td><td> 構造 </td><td> 親の </td><td> プロモーター </td><td> バクRES </td><td> ママRES </td><td> テトREG？ </td></tr><tr><td> pGLAP1 </td><td> N-用語EGFP-TEV-Sペプチド</td><td> pcDNA5 / FRT / TO </td><td> CMV </td><td>アンプ</td><td> HYG </td><td>はい</td></tr><tr><td> pGLAP2 </td><td> N末端フラッグ-TEV-Sペプチド</td><td> pcDNA5 / FRT / TO </td><td> CMV </td><td>アンプ</td><td> HYG </td><td>はい</td></tr><tr><td> pGLAP3 </td><td> N-用語EGFP-TEV-Sペプチド; C-用語V5 </td><td> pEF5 / FRT-V5 </td><td> EF1A </td><td>アンプ</td><td> HYG </td><td>いいえ</td></tr><tr><td> pGLAP4 </td><td> N末端フラッグ-TEV-Sペプチド。 ; C-用語V5 </td><td> pEF5 / FRT-V5 </td><td> EF1A </td><td></td><td> HYG </td><td>いいえ</td></tr><tr><td> pGLAP5 </td><td> C-用語SペプチドPreProt×2-EGFP </td><td> pEF5 / FRT-V5 </td><td> EF1A </td><td>アンプ</td><td> HYG </td><td>いいえ</td></tr></tbody></table> 表4：変数のプロモーター、エピトープタグ、およびNまたはC末端タンパク質タグ付けのためのDox誘導性発現の機能と利用できるLAP / TAPベクターのリスト。ベクターは、市販されています。 BAC RESは、細菌耐性マーカーを示し、ママRESは、哺乳動物細胞の耐性マーカー、テトREGを示しますか？式はテト/ドックス調節可能であるかどうかを示します。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> ベクター </td><td> フォワードシークエンシングプライマー </td><td> リバースシークエンシングプライマー </td></tr><tr><td> pGLAP1 </td><td> 5'-ATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG-3 ' </td><td> 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 ' </td></tr><tr><td> pGLAP2 </td><td> 5'-CGAACGCCAGCACATGGACAGGG-3 ' </td><td> 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 ' </td></tr><tr><td> pGLAP3 </td><td> 5'-AGAAACCGCTGCTGCTAA-3 ' </td><td> 5 'TAGAAGGCACAGTCGAGG 3' </td></tr><tr><td> pGLAP4 </td><td> 5'-AGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGC-3 ' </td><td> 5 'TAGAAGGCACAGTCGAGG 3' </td></tr><tr><td> pGLAP5 </td><td> 5'-CGTAATACGACTCACTATAG-3 ' </td><td> 5'-TCCAGGGTCAAGGAAGGCACGG-3 ' </td></tr></tbody></table> 表5：pGLAPベクトルのためのフォワードおよびリバース配列決定プライマー。

タンパク質機能、時空間的な細胞内局在、タンパク質-タンパク質相互作用ネットワークを調査するための、局在化および親和性精製(LAP)タグ付き誘導性安定細胞株の生成方法について説明します。

タンパク質機能を調べるための誘導LAP-タグ付けされた安定な細胞株、時空間局在とタンパク質相互作用ネットワーク

Multi-protein complexes, rather than single proteins acting in isolation, often govern molecular pathways regulating cellular homeostasis. Based on this ...

この手順の全体的な目標は、タンパク質機能、時空間局在、およびタンパク質相互作用ネットワークを調査するための誘導性ローカリゼーションおよびアフィニティー精製、またはLAPタグ付き安定細胞株を作製することです。この方法は、タンパク質機能、タンパク質細胞周期のサブゼロ局在、およびタンパク質相互作用に関連する分子生物学および細胞生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の主な利点は、タンパク質群のハイスループット分析に適しており、生物学的経路のタンパク質成分の解剖に使用できることです。この手順を開始するには、目的の遺伝子のオープンリーディングフレームをLAPタグ付きベクターにクローニングし、テキストプロトコルに記載されているようにHEK293細胞にトランスフェクションします。トランスフェクション後1日で、マイナスのTet DMEM/F12培地を新しい培地と交換します。トランスフェクションの2日後、細胞を25%コンフルエンスに分割します。セルが付着するまで約5時間待ちます。次に、ハイグロマイシン含有マイナスTet DMEM/F12培地を所定の濃度で添加します。HEK293細胞には、1ミリリットルあたり100マイクログラムのハイグロマイシンを使用します。必要に応じて培地を交換し、透明プレートに対して不透明な斑点に似た明確な細胞病巣が現れるまで交換します。各細胞病巣の上に20マイクロリットルのトリプシンを追加し、200マイクロリットルのピペットチップで上下に2回パイプでつなぎます。細胞を24ウェルプレートに移し、ハイグロマイシン含有マイナスTet DMEM/F12培地で連続的に増殖させることにより、細胞を増殖させます。バリデーション済みのLAPタグ付き細胞株を増殖させ、タンデムアフィニティー精製(TAP)によるタンパク質複合体の単離を行います。これを行うには、すべてのHEK293細胞を大きなプレートやローラーボトルに連続的に継代し、摂氏37度と二酸化炭素5%のTet DMEM/F12培地を差し引いて使用します。Tet/Dox誘導性細胞株の場合、細胞が約70%のコンフルエント度に達したときに、Tet/Dox1ミリリットルあたり0.2マイクログラムの濃度を添加して、細胞を10〜15時間誘導します。攪拌またはトリプシン化によって細胞を収穫します。その後、875倍のgで5〜10分間ペレット化します。抗GFP抗体をプロテインAビーズに結合するには、1.5ミリリットルのチューブ内で160マイクロリットルのパック容量のプロテインAビーズをPBSTと平衡化します。ビーズを1ミリリットルのPBSTで3回洗います。この手順の各洗浄ステップに続いて、ビーズを5000倍gで10秒間遠心分離し、上清を除去します。ビーズを500マイクロリットルのPBSTに再懸濁した後、160マイクロリットルのビーズを含む80マイクログラムのアフィニティー精製迅速抗GFP抗体を各チューブに加えます。室温で1時間混合します。PBSTの1ミリリットルでビーズを2回洗浄し、次に0.2モルホウ酸ナトリウムの1ミリリットルでビーズを2回洗浄し、pH最終洗浄後、ホウ酸ナトリウム緩衝液の900マイクロリットルを追加して、最終容量を1ミリリットルにします。次に、ビーズ懸濁液に100マイクロリットルの220モルDMPを添加し、最終濃度を20ミリモルにします。チューブを室温で30分間静かに回転させます。DMPとインキュベートした後、ビーズを1ミリリットルの0.2モルエタノールアミン(0.2モル塩化ナトリウムpH 8.5)で1回洗浄し、残留架橋剤を不活性化します。その後、ビーズを同じバッファーの1ミリリットルに再懸濁し、室温で1時間回転させます。ビーズをペレット化した後、さらに500マイクロリットルのバッファーにビーズを再懸濁します。調製されたビーズは、摂氏4度で数ヶ月間安定です。細胞溶解物を調製するには、0.5ミリモルのDTTおよびプロテアーゼ阻害剤を使用して、500マイクロリットルの充填細胞を2.5ミリリットルのLAP 300に再懸濁します。90マイクロリットルの10%ノニルフェノキシポリエトキシレタノールを加え、反転させて混合します。混合物を氷の上に10分間置きます。21, 000倍gで10分間遠心分離します。遠心分離後、この低速上清を回収し、ゲル分析用に10マイクロリットルのサンプルを取っておきます。低速上清をTLA 100.3チューブに移した後、摂氏4度で1時間、gの100,000倍で回転させます。この高速上清をチューブに集めて氷上に置い、ゲル分析用に10マイクロリットルのサンプルを確保します。抗GFPビーズへの結合による最初のアフィニティーキャプチャーでは、抗体結合ビーズを1 mLの溶出バッファーで3回洗浄して事前に溶出させ、非結合抗体を除去してバックグラウンドを低減します。これを迅速に実行します。ビーズを高塩分に長時間放置しないでください。その後、LAP 200 N1ミリリットルでビーズを3回洗浄し、次に高速上清液と抗体ビーズを4°Cで1時間混合します。抽出物を21, 000倍gで10分間遠心分離した後、ゲル分析のために上清の10マイクロリットルのサンプルを予約します。0.5ミリモルのDTTとプロテアーゼ阻害剤を含む1ミリリットルのLAP 200 Nでビーズを3回すばやく洗浄します。同じバッファーを使用してビーズをさらに2回洗浄し、各洗浄に5分間のインキュベーション時間を設けます。次に、0.5ミリモルのDTTを含み、プロテアーゼ阻害剤を含まない1ミリリットルのLAP 200 Nでビーズをさらに2回すばやく洗浄してから、タバコエッチングウイルス(TEV)プロテアーゼを添加します。1ミリリットルのLAP 200 Nに10 μgのTEVプロテアーゼをビーズに加え、チューブを摂氏4度で一晩回転させます。翌日、ビーズをペレット化し、上清を新しいチューブに移します。0.5ミリモルのDTTとプロテアーゼ阻害剤を含む160マイクロリットルのLAP 200 Nでビーズを2回すすぎ、残留タンパク質を除去します。S-タンパク質アガロースへの結合による第2のアフィニティーキャプチャのために、80マイクロリットルのSタンパク質アガローススラリーの1本のチューブを1ミリリットルのLAP 200 N.で3回洗浄し、TEV溶出上清をSタンパク質ビーズに加え、摂氏4度で3時間振とうします。ビーズをペレット化した後、0.5ミリモルのDTTとプロテアーゼ阻害剤を含む1ミリリットルのLAP 200 Nで3回洗浄します。その後、ビーズを1ミリリットルのLAP 100で2回洗います。S-タンパク質アガロースからタンパク質を溶出するには、50マイクロリットルの4x Laemmliサンプルバッファーを添加し、摂氏97度で10分間加熱します。質量分析により相互作用するタンパク質を同定するには、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により採取したサンプルを分析し、精製の品質を試験します。得られたゲルを銀で染色します。また、溶出液をイムノブロットし、抗GFP抗体でプローブして、LAPタグによる精製が機能することを確認します。化学量論的および従量化学的な共精製分子種を同定するには、最終的な溶出サンプルを採取し、SDS-PAGEで分離します。質量分析適合タンパク質染色液でゲルを染色します。ゲル内の最も顕著なバンドとそれらの間のスペースを切り取り、質量分析による分析のためにバンドを別々に処理します。ここに示されているのは、非誘導およびDox誘導LAP-Tau HEK293細胞からのタンパク質サンプルの代表的なウェスタンブロット分析です。細胞を抗チューブリン抗体でプローブしてチューブリンローディングコントロールを検出し、抗GFPでプローブしてLAPタグ付きタウタンパク質を検出します。LAP-Tauは、細胞がDoxで誘導された場合にのみ発現することに注意してください。LAP-Tauを発現するマイトーシス細胞を固定し、DNAとチューブリンを抗チューブリン抗体で共染色し、LAP-Tauの細胞内局在を蛍光顕微鏡で解析しました。LAP-Tauは、有糸分裂中に有糸分裂紡錘体と紡錘体極に局在することに注意してください。ここに示されているのは、LAP-Tau精製の代表的な銀染色ゲルです。レーンは、分子量、透明化されたライセート、および最終的な溶出液を表します。サンプルを4-20%SDS-PAGEゲル上で分析し、ゲルを銀染色して精製タンパク質を可視化しました。なお、LAP-Tauに対応するバンドにはアスタリスクが付いており、他にも共精製タンパク質に対応するバンドがいくつか見られます。このビデオを見れば、誘導可能なLAPタグ付き安定細胞株の作製方法や、プロテオミクス解析やタンパク質相互作用ネットワークの同定のためのLAPタグ付きタンパク質の生化学的精製の方法について十分に理解できるはずです。

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