タンパク質機能を調べるための誘導LAP-タグ付けされた安定な細胞株、時空間局在とタンパク質相互作用ネットワーク

この手順の全体的な目標は、タンパク質機能、時空間局在、およびタンパク質相互作用ネットワークを調査するための誘導性ローカリゼーションおよびアフィニティー精製、またはLAPタグ付き安定細胞株を作製することです。この方法は、タンパク質機能、タンパク質細胞周期のサブゼロ局在、およびタンパク質相互作用に関連する分子生物学および細胞生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の主な利点は、タンパク質群のハイスループット分析に適しており、生物学的経路のタンパク質成分の解剖に使用できることです。

この手順を開始するには、目的の遺伝子のオープンリーディングフレームをLAPタグ付きベクターにクローニングし、テキストプロトコルに記載されているようにHEK293細胞にトランスフェクションします。トランスフェクション後1日で、マイナスのTet DMEM/F12培地を新しい培地と交換します。トランスフェクションの2日後、細胞を25%コンフルエンスに分割します。

セルが付着するまで約5時間待ちます。次に、ハイグロマイシン含有マイナスTet DMEM/F12培地を所定の濃度で添加します。HEK293細胞には、1ミリリットルあたり100マイクログラムのハイグロマイシンを使用します。

必要に応じて培地を交換し、透明プレートに対して不透明な斑点に似た明確な細胞病巣が現れるまで交換します。各細胞病巣の上に20マイクロリットルのトリプシンを追加し、200マイクロリットルのピペットチップで上下に2回パイプでつなぎます。細胞を24ウェルプレートに移し、ハイグロマイシン含有マイナスTet DMEM/F12培地で連続的に増殖させることにより、細胞を増殖させます。

バリデーション済みのLAPタグ付き細胞株を増殖させ、タンデムアフィニティー精製(TAP)によるタンパク質複合体の単離を行います。これを行うには、すべてのHEK293細胞を大きなプレートやローラーボトルに連続的に継代し、摂氏37度と二酸化炭素5%のTet DMEM/F12培地を差し引いて使用します。Tet/Dox誘導性細胞株の場合、細胞が約70%のコンフルエント度に達したときに、Tet/Dox1ミリリットルあたり0.2マイクログラムの濃度を添加して、細胞を10〜15時間

攪拌またはトリプシン化によって細胞を収穫します。その後、875倍のgで5〜10分間ペレット化します。抗GFP抗体をプロテインAビーズに結合するには、1.5ミリリットルのチューブ内で160マイクロリットルのパック容量のプロテインAビーズをPBSTと平衡化します。

ビーズを1ミリリットルのPBSTで3回洗います。この手順の各洗浄ステップに続いて、ビーズを5000倍gで10秒間遠心分離し、上清を除去します。ビーズを500マイクロリットルのPBSTに再懸濁した後、160マイクロリットルのビーズを含む80マイクログラムのアフィニティー精製迅速抗GFP抗体を各チューブに加えます。

室温で1時間混合します。PBSTの1ミリリットルでビーズを2回洗浄し、次に0.2モルホウ酸ナトリウムの1ミリリットルでビーズを2回洗浄し、pH最終洗浄後、ホウ酸ナトリウム緩衝液の900マイクロリットルを追加して、最終容量を1ミリリットルにします。次に、ビーズ懸濁液に100マイクロリットルの220モルDMPを添加し、最終濃度を20ミリモルにします。

チューブを室温で30分間静かに回転させます。DMPとインキュベートした後、ビーズを1ミリリットルの0.2モルエタノールアミン(0.2モル塩化ナトリウムpH 8.5)で1回洗浄し、残留架橋剤を不活性化します。その後、ビーズを同じバッファーの1ミリリットルに再懸濁し、室温で1時間回転させます。

ビーズをペレット化した後、さらに500マイクロリットルのバッファーにビーズを再懸濁します。調製されたビーズは、摂氏4度で数ヶ月間安定です。細胞溶解物を調製するには、0.5ミリモルのDTTおよびプロテアーゼ阻害剤を使用して、500マイクロリットルの充填細胞を2.5ミリリットルのLAP 300に再懸濁します。

90マイクロリットルの10%ノニルフェノキシポリエトキシレタノールを加え、反転させて混合します。混合物を氷の上に10分間置きます。21, 000倍gで10分間遠心分離します。

遠心分離後、この低速上清を回収し、ゲル分析用に10マイクロリットルのサンプルを取っておきます。低速上清をTLA 100.3チューブに移した後、摂氏4度で1時間、gの100,000倍で回転させます。この高速上清をチューブに集めて氷上に置い、ゲル分析用に10マイクロリットルのサンプルを確保します。

抗GFPビーズへの結合による最初のアフィニティーキャプチャーでは、抗体結合ビーズを1 mLの溶出バッファーで3回洗浄して事前に溶出させ、非結合抗体を除去してバックグラウンドを低減します。これを迅速に実行します。ビーズを高塩分に長時間放置しないでください。

その後、LAP 200 N1ミリリットルでビーズを3回洗浄し、次に高速上清液と抗体ビーズを4°Cで1時間混合します。抽出物を21, 000倍gで10分間遠心分離した後、ゲル分析のために上清の10マイクロリットルのサンプルを予約します。0.5ミリモルのDTTとプロテアーゼ阻害剤を含む1ミリリットルのLAP 200 Nでビーズを3回すばやく洗浄します。

同じバッファーを使用してビーズをさらに2回洗浄し、各洗浄に5分間のインキュベーション時間を設けます。次に、0.5ミリモルのDTTを含み、プロテアーゼ阻害剤を含まない1ミリリットルのLAP 200 Nでビーズをさらに2回すばやく洗浄してから、タバコエッチングウイルス(TEV)プロテアーゼを添加します。1ミリリットルのLAP 200 Nに10 μgのTEVプロテアーゼをビーズに加え、チューブを摂氏4度で一晩回転させます。

翌日、ビーズをペレット化し、上清を新しいチューブに移します。0.5ミリモルのDTTとプロテアーゼ阻害剤を含む160マイクロリットルのLAP 200 Nでビーズを2回すすぎ、残留タンパク質を除去します。S-タンパク質アガロースへの結合による第2のアフィニティーキャプチャのために、80マイクロリットルのSタンパク質アガローススラリーの1本のチューブを1ミリリットルのLAP 200 N.で3回洗浄し、TEV溶出上清をSタンパク質ビーズに加え、摂氏4度で3時間振とうします。

ビーズをペレット化した後、0.5ミリモルのDTTとプロテアーゼ阻害剤を含む1ミリリットルのLAP 200 Nで3回洗浄します。その後、ビーズを1ミリリットルのLAP 100で2回洗います。S-タンパク質アガロースからタンパク質を溶出するには、50マイクロリットルの4x Laemmliサンプルバッファーを添加し、摂氏97度で10分間加熱します。

質量分析により相互作用するタンパク質を同定するには、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により採取したサンプルを分析し、精製の品質を試験します。得られたゲルを銀で染色します。また、溶出液をイムノブロットし、抗GFP抗体でプローブして、LAPタグによる精製が機能することを確認します。

化学量論的および従量化学的な共精製分子種を同定するには、最終的な溶出サンプルを採取し、SDS-PAGEで分離します。質量分析適合タンパク質染色液でゲルを染色します。ゲル内の最も顕著なバンドとそれらの間のスペースを切り取り、質量分析による分析のためにバンドを別々に処理します。

ここに示されているのは、非誘導およびDox誘導LAP-Tau HEK293細胞からのタンパク質サンプルの代表的なウェスタンブロット分析です。細胞を抗チューブリン抗体でプローブしてチューブリンローディングコントロールを検出し、抗GFPでプローブしてLAPタグ付きタウタンパク質を検出します。LAP-Tauは、細胞がDoxで誘導された場合にのみ発現することに注意してください。

LAP-Tauを発現するマイトーシス細胞を固定し、DNAとチューブリンを抗チューブリン抗体で共染色し、LAP-Tauの細胞内局在を蛍光顕微鏡で解析しました。LAP-Tauは、有糸分裂中に有糸分裂紡錘体と紡錘体極に局在することに注意してください。ここに示されているのは、LAP-Tau精製の代表的な銀染色ゲルです。

レーンは、分子量、透明化されたライセート、および最終的な溶出液を表します。サンプルを4-20%SDS-PAGEゲル上で分析し、ゲルを銀染色して精製タンパク質を可視化しました。なお、LAP-Tauに対応するバンドにはアスタリスクが付いており、他にも共精製タンパク質に対応するバンドがいくつか見られます。

このビデオを見れば、誘導可能なLAPタグ付き安定細胞株の作製方法や、プロテオミクス解析やタンパク質相互作用ネットワークの同定のためのLAPタグ付きタンパク質の生化学的精製の方法について十分に理解できるはずです。