Name: ラットにおける慢性心筋梗塞の組織学的定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学ぼう、ラット心筋梗塞モデルにおける組織学的定量法。系統的サンプリングと画像解析を用いて梗塞サイズと左室リモデリングを正確に評価し、再生医療の効果測定や新規治療戦略の開発に貢献する方法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、スイス国立財団[SNF 310030-149986 to MNG]、フリブール大学、およびフリブール病院の支援を受けました。

すべての動物は動物ケアに関する欧州条約に準拠した人道的なケアを受けました。外科的手順は、フリブール、スイス連邦獣医局、スイスで承認され、国家獣医局の許可を得た後、スイスの動物保護法に従って行われました。 1.ハート収穫注：すべての外科的介入は、イソフルラン麻酔下で実施しました。努力が動物の苦痛を軽減するために行われました。具体的には、全ての動物は、0.1ミリグラム/ kgのブプレノルフィン予め麻酔の皮下注射を受けました。心筋梗塞入校するための外科的プロトコルは、以前に他の場所13に記載されています。 <ol><li>麻酔下myocardially梗塞動物（挿管動物、2.5％イソフルラン、足のピンチ反射により確認し、適切な麻酔）に胸骨切開を行います。 <ol><li>皮膚を切断することにより、動物を開き、筋肉手術用ハサミで。左右のリブをカットしてから、胸を削除します。 </li><li>以前の手術（LAD結紮）の後に、残りの癒着を削除します。大動脈をカットし、心を取り除きます。 （PBS中）1 MのKClに組織を入れ、その後、PBSで洗ってください。 </li></ol></li></ol> 2.組織標本<ol><li>アクリルラット心臓マトリックス中に縦方向に梗塞心を置きます。 1時間-20℃で保管してください。 </li><li>横方向とカミソリの刃を使用して、マトリックスに直接心をカット。各スライスは2ミリメートルの厚さであることを確認してください。 ;（改造レベルに基づいて）各心臓のための7のスライド - 約5をカットこれは、体系的なサンプリングと呼ばれています。 </li><li>このステップでは、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド（TTC）染色を行うこと（心臓スライスのベース - 頂点の向きを保つ）は任意です。 <ol><li> 37℃で50分間、PBS中の1％TTCでインキュベートします。 1時間20分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）でそれをインキュベートします。 betweeセクションを入れてnは2 mmのスペーサーを有する2枚のガラス板とは15X倍率でカメラに接続された立体顕微鏡で写真を撮ります。 注意！パラホルムアルデヒドは有毒です。 </li></ol></li><li>スライド凍結（1 番目のオプション） <ol><li> （金型の底に下り区間の頂点指向側を配置）方向を維持、cryotomy用培地（最適切断温度、10月）を取り付けたプラスチック金型（10×10×5ミリメートル）で、各スライドを置きます。 15分 - 10用の液体窒素冷却下、2-メチルブタン蒸気でブロックをフリーズします。最後に、-80℃で組織を保存します。 </li></ol></li><li>パラフィン除去（2 番目のオプション） <ol><li> 24時間、4％PFAで各カセットを埋め込んでスライド（ダウンカセットの底の部分の頂点指向側を配置することによって方向を維持）とを配置します。ティッシュプロセッサマシンで一晩でそれを置きます。 <ol><li> 2時間エタノール70％でそれをインキュベートします。イーサンでそれをインキュベート2時間95％をオール。 3時間エタノール100％でそれをインキュベートします。 4時間キシロールでそれをインキュベートします。 5時間（オーブンで60℃で溶融）パラフィンでそれをインキュベートします。最後に、パラフィンの各心臓スライドを埋め込むことにより、ブロックを作ります。 </li></ol></li></ol></li></ol> 3.マッソン - ゴールドナートリクローム染色<ol><li> （：厚さ5μm）または-18℃に設定したクライオスタットと10月のブロックから（厚さ：7μm）のマニュアルミクロトームでパラフィンブロックから組織切片を作成します。 </li><li>マッソン-ゴールドナートリクローム染色で- （スライドあたり4横断セクション3）（ 附属書を参照 ）、各ラットについて各心部からのスライドを染色します。 注：パラフィン切片について、このステップから開始します。 <ol><li>オーブンで60℃でスライドを溶かします。ヒュームフードの下で、10分間ずつ二回キシロールでそれらを脱パラフィン。 3分ごとに100％エタノール、95％エタノール、70％エタノール、蒸留水に再水和します。 注：凍結切片に対して、この手順から開始します秒。 </li><li>ブアン液に一晩でそれらを修正しました。 15分 - そして、10のために水道水でそれらを洗い流してください。蒸留水でそれらを洗い流してください。 3分間マイヤーのヘマトキシリンでそれらをインキュベートします。 </li><li>スライドを削除し、5分間蒸留水にそれらを残します。その後、5分間酸フクシン、ポンソーでそれらをインキュベートします。 1分間1％酢酸でそれらを洗い流します。 </li><li>次に、1分間リンモリブデン酸オレンジGでそれらをインキュベートします。 、1分間1％酢酸でそれらを洗い流し10分間ライトグリーン色素でそれらをインキュベートし、1分間1％酢酸でそれらをすすぎます。 </li><li> 70％エタノール（30秒）、95％エタノール（30秒）、及び100％エタノール（5分）でそれらを脱水します。 、組織切片上の樹脂封入剤の1滴を入れてカバースリップでそれらをカバーし、それらを乾燥させてください。 </li></ol></li></ol> 4.梗塞サイズ分析<ol><li>カメラに結合された実体顕微鏡（15X倍率）上の各スライドから1つの画像を取得します。同じ設定で定規を撮影秒。 </li><li> 、梗塞の中間に隔壁厚さ、左心室（LV）腔面積、梗塞領域、およびLVの組織領域を使用して瘢痕の厚さを測定するために画像解析ソフトウェアを使用します。 <ol><li>定規の画像（ 図1A）とのスケールを設定します。 <ol><li> セット変換係数を選択し測定をクリックします。キャリブレーションバー上に線を描画します。右の写真をクリックすると、エンド・キャリブレーションをクリックしてください。バー値をメモして、[OK]をクリックします。 </li></ol></li><li>染色されたハートの絵（ 図1B）からLVを選択します。 複数のセグメントのツールを使用します。 LVポイントバイポイントを選択し、右クリック コピー/どこにでも貼り付けます。 </li><li> 単一セグメントの測定ツールを使用して傷や隔壁の厚さを測定する（ 図1C </st栄&gt;）。 </li><li>自動LV腔、梗塞を検出し、LV領域はRGBモード（ 図1D）における自動面積測定ツールを使用して。 <ol><li>ツールをクリックします。アクティブにのみ罫線と RGBモードでの連続 。最後に、それを検出するために、関心領域内をクリックします。必要に応じて、精密なツールを使用しています。 </li></ol></li></ol></li><li> LV面積に対する梗塞面積の割合としての梗塞サイズを計算します。 </li><li>次のように拡張インデックスを計算します[LV腔面積/全LV面積] / [梗塞厚さ/隔壁厚さ]、LV空洞とLVの組織領域の両方を含む全LVエリアと。 </li><li>次のように最後に、それぞれの心のための「平均」を算出：[梗塞スライドから拡張インデックスの平均] * [梗塞スライド/スライドの総数の数]。 </li></ol>

<ol><li>Amsterdam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AHA%2FACC+Guideline+for+the+Management+of+Patients+with+Non-ST-Elevation+Acute+Coronary+Syndromes%3A+a+report+of+the+American+College+of+Cardiology%2FAmerican+Heart+Association+Task+Force+on+Practice+Guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">AHA/ACC Guideline for the Management of Patients with Non-ST-Elevation Acute Coronary Syndromes: a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines.</a> J Am Coll Cardiol. 64, e139-e228 (2014).</li>
<li>Konstam, M. A., Kramer, D. G., Patel, A. R., Maron, M. S., Udelson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+ventricular+remodeling+in+heart+failure%3A+current+concepts+in+clinical+significance+and+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Cardiovasc+Imaging%22%5BJournal%5D)">Left ventricular remodeling in heart failure: current concepts in clinical significance and assessment.</a> JACC Cardiovasc Imaging. 4, 98-108 (2011).</li>
<li>Frobert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+Value+of+Troponin+I+for+Infarct+Size+to+Improve+Preclinical+Myocardial+Infarction+Small+Animal+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prognostic Value of Troponin I for Infarct Size to Improve Preclinical Myocardial Infarction Small Animal Models.</a> Front Physiol. 6, 353(2015).</li>
<li>Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarct+size+and+area+at+risk+assessment+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Clin+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice.</a> Exp Clin Cardiol. 17, 268-272 (2012).</li>
<li>Guex, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-functionalized+electrospun+matrix+for+biograft+development+and+cardiac+function+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Plasma-functionalized electrospun matrix for biograft development and cardiac function stabilization.</a> Acta Biomater. 10, 2996-3006 (2014).</li>
<li>Landa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+injectable+alginate+implant+on+cardiac+remodeling+and+function+after+recent+and+old+infarcts+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Effect of injectable alginate implant on cardiac remodeling and function after recent and old infarcts in rat.</a> Circulation. 117, 1388-1396 (2008).</li>
<li>Valente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+heart+sampling+and+systematic+evaluation+of+cardiac+therapies+inmouse+models+of+ischemic+injury%3A+Assessment+of+cardiacremodeling+and+semi-automated+quantification+of+myocardial+infarctsize%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mouse+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimized heart sampling and systematic evaluation of cardiac therapies inmouse models of ischemic injury: Assessment of cardiacremodeling and semi-automated quantification of myocardial infarctsize.</a> Curr. Protoc. Mouse Biol. 5, 359-391 (2015).</li>
<li>Csonka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+myocardial+infarct+size+in+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Measurement of myocardial infarct size in preclinical studies.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 163-170 (2010).</li>
<li>Zornoff, L. A., Paiva, S. A., Minicucci, M. F., Spadaro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+myocardium+infarction+in+rats%3A+Analysis+of+the+model%5BTitle%5D)+AND+%22Arq.+Bras+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Experimental myocardium infarction in rats: Analysis of the model.</a> Arq. Bras Cardiol. 93, 434-440 (2009).</li>
<li>Lichtenauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarct+size+measurement+using+geometric+angle+calculation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarct size measurement using geometric angle calculation.</a> Eur J Clin Invest. 44, 160-167 (2014).</li>
<li>Lutgens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+myocardial+infarction+in+the+mouse%3A+cardiac+structural+and+functional+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Chronic myocardial infarction in the mouse: cardiac structural and functional changes.</a> Cardiovasc Res. 41, 586-593 (1999).</li>
<li>Frobert, A., Valentin, J., Cook, S., Lopes-Vicente, L., Giraud, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapy+for+heart+failure+in+rat%3A+double+thoracotomy+for+myocardial+infarction+and+epicardial+implantation+of+cells+and+biomatrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapy for heart failure in rat: double thoracotomy for myocardial infarction and epicardial implantation of cells and biomatrix.</a> J Vis Exp. , e51390(2014).</li>
<li>Takagawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarct+size+measurement+in+the+mouse+chronic+infarction+model%3A+comparison+of+area-+and+length-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches.</a> J Appl Physiol (1985). 102, 2104-2111 (2007).</li>
<li>Fishbein, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+phase+acute+myocardial+infarct+size+quantification%3A+validation+of+the+triphenyl+tetrazolium+chloride+tissue+enzyme+staining+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Early phase acute myocardial infarct size quantification: validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique.</a> Am Heart J. 101, 593-600 (1981).</li>
<li>Weisman, H. F., Bush, D. E., Mannisi, J. A., Weisfeldt, M. L., Healy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+myocardial+infarct+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of myocardial infarct expansion.</a> Circulation. 78, 186-201 (1988).</li>
<li>Mannisi, J. A., Weisman, H. F., Bush, D. E., Dudeck, P., Healy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+administration+after+myocardial+infarction+promotes+early+infarct+expansion.+A+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Steroid administration after myocardial infarction promotes early infarct expansion. A study in the rat.</a> J Clin Invest. 79, 1431-1439 (1987).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

プロトコル内の重要なステップ 線維性組織は正確に採取し、心臓や画像の系統的なサンプリングを使用して、慢性MIラットモデルで評価することができる頂点にベースから得た三色染色した組織切片の分析。 2つのステップが成功したプロトコル実装のために特に重要です。まず、心臓の収穫のためのKClを使用することは、心臓の筋肉が弛緩した状態に維持することができます。このステップは、異なる心臓から梗塞寸法の比較のために重要です。第二に、ブアン液中のセクションの一晩の固定は明るいトリクローム染色を得るために重要です。 修正およびトラブルシューティング 染色の不在は、このような減少インキュベーション時間として、ブアン液中のセクションの固定中に問題が原因であるか、ブアンソリューションを満了してもよいです。 TTC染色はオプションとcoulです急速が、非定量的な方法で、梗塞の大きさを可視化するために使用されるDはTTCは前10月...

心筋梗塞（MI）は、世界中の死亡および障害の主要な原因です。冠状動脈性心臓病は、主な原因です。 MIは、閉塞などの冠動脈イベントの連続虚血に起因します。再灌流の最初の6時間以内に行われていない場合、虚血は、不可逆的心筋壊死を誘発します。患者では、MIの特徴付けは、臨床徴候、心電図、バイオマーカー、心エコー検査、MRIイメージングの血漿レベルの評価を含む様々な診断ツールに依存し、そして組織1を解析します 。急性および慢性MIは、冠動脈閉塞の時間に対する心筋壊死のタイミングに応じてけがの二つの異なる相として分類されています。最初の7日の間に起こる急性期は、心筋細胞の損失、大規模な炎症、および線維芽細胞の動員と関連しています。心臓組織の治癒および瘢痕の形成を特徴と亜急性期、発生し、1〜4から6週間。梗塞の拡大、心室壁の菲薄化、および心室の拡張は、慢性期を特徴づけます。左心室の大規模な改造が次第に重症心不全2になります。 永久左前下行枝（LAD）結紮によって誘導される心筋梗塞、慢性心筋梗塞の標準的なげっ歯類モデルを表します。冠動脈結紮を冠動脈閉塞を模倣します。梗塞の大きさは、合字のサイトに依存します。げっ歯類モデルにおける心筋虚血損傷の特徴付けは、古典的に、このようなトロポニンIおよびT 3、心エコー検査、MRI、および組織学4,5などのバイオマーカーの血漿レベルを用いて行われます。バイオマーカーのレベルは、心筋細胞死の程度と相関しています。心エコー検査は、局所壁運動異常に起因する左心室機能障害を評価します。例えばMRIや高解像度などの他に、非侵襲的イメージング技術、心エコー検査、壁運動の減少、減少した灌流および生存心筋と瘢痕領域の容量、および減肉の評価を可能にします。 LV寸法は梗塞サイズの正確な評価を可能にします。最後に、生存可能であり、死んだ心筋の定量化は、収穫の心の組織切片の特定の汚れを使用して、死後を行い、梗塞サイズ（IS）の検証を可能にすることができます。別の重要な特徴は、梗塞拡大指数（EI）6の評価です。 EIは、最初の3日以内に貫梗塞と開始と関連しています。 EIは、壁の厚さの漸進的な減少、LV腔サイズの増大、およびLV形状の結果として変化することを特徴とします。 新規の治療の治療効果を評価するために - 特に、再生戦略細胞、マトリックスに基づいて、および齧歯類におけるMIの遺伝子送達の正確な評価は極めて重要です。乳頭筋のレベルで得られた単一の断面で測定した場合、ISサイズは、LAD結紮後により梗塞発達に存在する大きな変動にバイアスされてもよいです。頂点梗塞は、その後、掩蔽されることがあります。重要なことは、決定MIサイズに、より正確な方法は、マウス7-9またはラット10について記載されています。それにもかかわらず、IS正確LVリモデリングやリモデリングの治療誘発される減少（または予防策）を定量化するには不十分です。実際、一般的に心臓の断面で評価総LV容積のパーセンテージとして表されています。この方法は、急性心筋梗塞のために有効ですが、改造中に発生したLV壁の菲薄化は、11,12評価の下で、残っています。梗塞サイズ、構造的な変更の完全な形態学的定量は、心内膜および心外膜の長さや直径、ならびに梗塞や健康分野などのいくつかのパラメータを、定量化する必要があります。私たちは、方法論的APPRを記述します正確慢性ラットモデルにおいてMIおよびリモデリングを評価するoach。

<table><tbody><tr><td>アクリルラット心臓マトリックス2ミリメートル</td><td>72-5015</td>ハーバー<td>ドAppartus</td><td></td></tr><tr><td>Inspira高度なボリューム制御人工呼吸器</td><td>ハーバード装置</td><td>557058</td><td></td></tr><tr><td>カテーテルInsyte14 G</td><td>BD</td><td>381267</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T</td><td>BDHA361603E</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>TTC</td><td>T8877-10G</td><td>シグマアルドリッチ</td><td></td></tr><tr><td>メイヤーヘマトキシリン</td><td>MHS32-1L</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td></td></tr><tr><td>アシッド フクシン CI 42685</td><td>F8129-50G</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td></td></tr><tr><td>ポンソー キシリディン CI 16150</td><td>P2395-25G</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td></td></tr><tr><td>オレンジ G CI 16230</td><td>O3756-100G</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td></td></tr><tr><td>ライト グリーン CI 42095</td><td>L5382-25G</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>P9333-500G</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td></td></tr><tr><td>キシロール</td><td>10315083</td><td>ハネウェル</td><td></td></tr><tr><td>エタノール アブソリュート</td><td>10303990</td><td>ハネウェル</td><td></td></tr><tr><td>2-メチルブタン</td><td>M32631-1L</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td></td></tr><tr><td>立体顕微鏡</td><td>SM2800</td><td>ニコン</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>99340</td><td>Reactolab</td><td></td></tr><tr><td>埋め込みカセット</td><td>K113.1</td><td>Carl Roth</td><td></td></tr><tr><td>Bersoft 画像測定ソフトウェア</td><td></td><td>Bersoft.com</td><td>ライセンスソフトウェア</td></tr></tbody></table>

ラットにおける慢性心筋梗塞の組織学的定量

Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats

心筋梗塞は、長期にわたる虚血による心筋細胞の死亡と定義され、虚血性損傷の後に炎症反応と瘢痕形成(線維化)が起こります。初期の急性期に続いて、左心室(LV)の慢性的なリモデリングにより、心臓の構造と機能が変化します。小動物における永久冠状動脈結紮術は、心筋梗塞の慢性モデルの参照モデルとして広く使用されています。梗塞サイズの組織学的評価が一般的に行われます。それにもかかわらず、定量化の方法の標準化は欠落しています。実際、分析されたセクションの数やサンプリングおよび定量方法などの重要な方法論的側面は通常説明されていないため、調査間での比較が妨げられます。多くの場合、定量化は乳頭筋のレベルで得られた単一の切片に対して行われます。梗塞の拡大とリモデリングを抑えることを目的とした新しい戦略が研究されているため、正確な心臓サンプリングプロトコルの標準化が重要視されています。採取したラット心臓の体系的なサンプリングと、基部から頂点まで得られた三色染色組織切片の画像分析を使用して、梗塞のサイズを定量化する正確な方法について説明します。また、拡張指数(EI)の計算により、リモデリング全体の左心室の変化を考慮に入れた梗塞サイズ評価が可能になったという証拠も提供します。

6週間後のLAD結紮、心臓をLewisラットから採取しました。 2mmの組織切片は、頂部から基部に得られました。 TTC染色手順は、白で表示され、梗塞面積、および赤で表示され、健康な心筋（ 図2）を可視化するために行きました。 LADの結紮の部位に応じて、梗塞サイズが異なります。大MIについて、貫梗塞は、ベース（ 図2A）に頂点から観察されました。小さい梗塞、心臓（ 図2B）の中央部分に頂点から見える白い梗塞組織を提示しました。小さな非貫梗塞の場合は、線維性組織は、頂点（ 図2C）からの1つまたは2つのセクションで観察されました。 各心臓スライスから薄い5μmの切片を切り出し、マッソン - ゴールドナートリクロームで染色しました。心の全体の断面の写真でした実体顕微鏡下で取得（ 図3）。</strong...

げっ歯類の心筋梗塞(MI)の死後評価は、染色された心臓切片の梗塞の定量化に基づいています。本稿では、採取したラットの心臓の基部から頂点までの系統的サンプリングと、三色染色された組織切片の画像解析を用いて、梗塞の大きさを定量化する正確な方法を説明します。

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ...

この組織学的手順の全体的な目的は、心筋梗塞ラットモデルを用いて梗塞拡大指数および心臓の構造パラメータの形態計測的定量化を行い、梗塞サイズと左室リモデリングを評価することです。本手法は、心筋梗塞後の再生療法の効果や、梗塞拡大の抑制を目的とした新しい戦略など、心臓領域における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、採取したラット心臓の系統的サンプリングを用いることで、梗塞サイズを正確に評価し、リモデリングに伴う左室の変化を考慮できる点にあります。この手法を用いることで、心筋梗塞の慢性ラットモデルにおける梗塞サイズの知見を得ることができます。また、マウスや、急性心筋梗塞、虚血再灌流などの他の虚血モデルにも適用可能です。この手順を開始するには、麻酔下で心筋梗塞を起こした動物に正中切開を施します。外科用鋏を用いて、胸骨に沿って皮膚と筋肉を切開します。次に、左右の肋骨を切断して胸壁を取り除きます。その後、LAD結紮後に残っている癒着を除去します。大動脈を切断して心臓を取り出し、組織を1 Mの塩化カリウムを含むPBSに1分未満浸した後、PBSで洗浄します。組織を保存するため、心室内のPBSを慎重に取り除いてください。その後、梗塞した心臓をアクリル製ラット心臓マトリックスに移し、縦方向に配置します。その後、-20 °Cで1時間保持します。1時間後に系統的サンプリングを行うため、カミソリを使用してマトリックス内で心臓を直接切断します。各セクションが2 mmの厚さになるようにしてください。次に、切片を1%TTCで37 °Cで15分間インキュベートしてTTC染色を行い、続いて4%PFAで室温で20〜60分間インキュベートします。その後、切片を2 mmのスペーサーを挟んだ2枚のガラスプレート間に配置し、カメラを装着した実体顕微鏡を用いて15倍の倍率で撮影します。TTC染色手順により、白く表示される梗塞領域と、赤く表示される健全な心筋を可視化しました。広範囲の心筋梗塞では、心尖部から心基部にかけて貫壁性梗塞が観察されました。より小規模な梗塞では、心尖部から心臓の中間部にかけて白い梗塞組織が認められました。小規模で非貫壁性の梗塞については、心尖部からの1〜2つの切片のみに線維性組織が観察されました。切片を凍結させるには、各切片を凍結切片用包埋剤を入れたプラスチック製モールドに配置し、頂点が下を向くようにセットします。液体窒素で冷却しながら、2-Methylbutane蒸気を用いて10〜15分間ブロックを凍結させます。その後、組織を-80 °Cで保存します。パラフィン包埋のため、各切片を尖端を下に向けた状態で包埋カセットに入れ、4%PFAに24時間浸漬させます。その後、組織処理装置で一晩処理します。処理が完了したら、各心臓切片をパラフィンで包埋し、ブロックを作成します。本手順では、手動ミクロトームを用いて、パラフィンブロックから厚さ5 µmの組織切片を作製します。次に、各ラットの心臓切片から1枚のスライドを抽出し、Masson-Goldner三色染色を行います。パラフィン切片については、オーブン内で60 °Cで組織を融解させてください。ドラフトチャンバー内で、キシロルを用いて10分間ずつ2回脱パラフィン処理を行います。次に、100% ethanol、95% ethanol、70% ethanol、そして蒸留水の順に、それぞれ3分間ずつ浸漬して親水化させます。脱パラフィン処理済みの切片および凍結切片を、Bouin液で一晩固定します。翌朝、流し水で10〜15分間すすぎ、その後、蒸留水で再度すすぎます。良好なGoldner染色を実現するためには、Bouin液による固定が最も重要な工程です。それらをMayer'sヘマトキシリン液に3分間浸漬させます。3分後、スライドを取り出し、蒸留水に5分間浸します。続いて、ポンソー酸フクシンで5分間染色し、1%酢酸で1分間洗浄します。次に、切片をホスホモリブデン酸オレンジGで1分間染色し、1%酢酸で1分間洗浄します。ライトグリーン染料で10分間インキュベートし、その後1%酢酸で1分間洗浄します。最後に、切片を70%エタノールで30秒間、95%エタノールで30秒間、100%エタノールで5分間、順次脱水します。組織切片に樹脂性封入剤を1滴滴下し、カバーガラスで覆い、乾燥させます。このステップでは、カメラを搭載した実体顕微鏡を用いて、各スライドから15倍の倍率で画像を1枚ずつ取得します。同じ設定で定規を撮影してください。各心臓スライスから5 µmの薄切片を作成し、Masson-Goldnerトリクローム染色を施しました。正常組織は赤色に、結合組織は緑色に表示されました。次に、画像解析ソフトを用いて、梗塞中央部の瘢痕厚、中隔厚、左心室腔面積、梗塞面積、およびLV組織面積を測定します。その際、定規の画像を用いてスケールを設定してください。「measurements」をクリックし、「set conversion factor」を選択します。キャリブレーションバー上に線を引きます。画像の上で右クリックし、「end calibration」をクリックします。バーの値をメモし、OKをクリックします。マルチセグメントツールを使用してLVを一点ずつ選択し、右クリックで任意の場所にコピー＆ペーストします。その後、シングルセグメント測定ツールを使用して、梗塞部と中隔の厚さを測定します。次に、RGBモードの自動領域測定ツールを使用して、LV腔、梗塞領域、およびLV領域を自動的に検出します。RGBモードで、「borders」と「contiguous」のみを有効にします。最後に、関心領域の中をクリックして検出します。その後、梗塞領域とLV領域の比として梗塞サイズを算出します。次に、この公式を用いて拡張指数を算出します。最後に、示された公式を使用して、各心臓の平均値を算出します。Goldner染色から算出された拡張指数は、梗塞の進展を評価するための優れた指標となります。図に示されているように、これは左心室に対する割合として表される梗塞サイズおよび心エコー図検査で測定された駆出率と相関しています。グラフには線形回帰と95%信頼区間が示されています。梗塞拡大指数は、ここの式に記載されている通りに算出されました。LV領域全体を、LV腔とLV組織領域の合計として測定しました。梗塞率は、示された方法で算出しました。機能評価は、LAD結紮の6週間後に高解像度心エコー図を用いて行いました。このビデオを視聴することで、心臓の系統的サンプリングの実施方法と、染色切片の画像解析に基づいた梗塞サイズの評価方法について十分に理解することができます。

histological-quantification-of-chronic-myocardial-infarct-in-rats

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

多数の遺伝子操作及び/または遺伝子、タンパク質、細胞、および/または生体物質の心筋内注射は、急性虚血/再灌流傷害およびマウスにおける慢性的リモデリングの研究に時間の次元に重ね合わされている。このビデオでは、虚血/再灌流、恒久的な冠動脈結紮、および心筋内注入の研究のための顕微手順を示しています。...

心筋梗塞のマウスモデルにおける冠動脈結紮および心筋内注入

このプロトコルは、再灌流に続く左前下行冠動脈（LAD）の90分の非開胸冠動脈バルーン閉塞を使用して、ブタ心筋梗塞（MI）モデルについて説明します。さらに、このような心機能、血行動態、微小血管抵抗、および梗塞サイズなどのいくつかの転帰パラメータのためのプロトコルもまた提示される。...

豚における心筋梗塞および機能的結果の評価

最小限の侵襲操作によるマウスの心筋梗塞の再現性の高いモデルが記述されています。モデル化が容易に行えるため、高い再現性と生存率を実現しています。したがって、記載されているモデルは、3Rの原則(Replacement(置換)、Refinement(改良)、Reduction(リペアメント)、Refinement(リファインメント)、Reduction(リダクション)の要求に応じて、必要な動物の数を減らします。...

マウスにおける心筋梗塞を誘発する低侵襲手術手順

この方法は、実験的に誘発された心筋虚血のマウスにおいて、心臓の形態、機能、灌流、代謝、および生存率を評価するための量子マイクロコンピュータ断層撮影法(MicroCT)の使用を概説しています。この技術は、ヒト心臓病のさまざまな動物モデルの非破壊ハイスループット縦断的in...

心筋の構造、機能の in vivo定量的評価では 、灌流および生存率は、心臓マイクロコンピュータ断層撮影法を使用しました

信頼できる正確なアウトカム評価は、臨床治療への臨床前治療の翻訳のための鍵です。現在の用紙は、ブタ急性心筋梗塞モデルにおける心機能および損傷の3つの臨床的に関連する主要な結果パラメータを評価する方法を説明します。...

急性心筋梗塞の豚モデルにおける主要アウトカム評価

ここに示すの並進価値が心筋虚血/再灌流障害の病態生理の理解を高めるために急性心筋梗塞の確立されたブタモデルのサンプリング手順を標準化するためのプロトコル新規薬剤の候補者をテストします。...

組織と血液サンプリング手順の標準化による閉胸ブタ心筋梗塞モデルの改善

本明細書では、マウスにおける左前皮下冠動脈の永久的なライゲーションを達成する方法を示す外科的処置について説明する。このモデルは、心筋梗塞の病態生理学とそれに付着した生物学的プロセスを調べるために高い関連性がある。...

左前皮下冠動脈の永久的なライゲーションを用いたマウス心筋梗塞モデル

適切な麻酔下で、マウスの心臓を肋間腔から外在化し、ほとんどの検査室で容易に入手できる材料を使用して左前下行動脈(LAD)を結紮することにより、心筋梗塞の誘発に成功しました。...

マウスにおける心筋梗塞の誘導のための改良簡便法

現在の2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム塩化物(TTC)アッセイは、心筋損傷を顕微鏡的解像度で解析できる洗練されたTTC染色プロトコルを導入し、細胞レベルでの梗塞サイズと心筋細胞の生存率を正確かつ信頼性の高い評価を可能にする高品質な画像を生成します。...

心筋損傷の正確かつ信頼性の高い分析のための顕微鏡2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム塩化物アッセイ

急性心筋梗塞（AMI）のラットモデルでは、心臓の病態生理学的および生理学的機能に関するMIの結果を研究するのに便利です。...

ラットにおける急性心筋梗塞

学ぼう、ラット心筋梗塞モデルにおける組織学的定量法。系統的サンプリングと画像解析を用いて梗塞サイズと左室リモデリングを正確に評価し、再生医療の効果測定や新規治療戦略の開発に貢献する方法です。

ラットにおける慢性心筋梗塞の組織学的定量

さらに動画を探す