Name: 大動脈弁移植 - 教則ビデオのマウスモデルでスリーブを用いた (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学ぶマウスにおけるスリーブ法を用いた大動脈移植術。迅速な吻合技術により血管疾患の研究モデルを確立し、移植後のグラフト開存性と組織学的評価方法を習得できます。

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その優秀な技術支援の Uli Heuter レオン デッカーとの優秀な編集協力、ピーター Kurdybacha ローマ ヴィツォレクに感謝したいと思います。

動物を対象とする手順がアーヘン工科大学、アリゾナ州 84 02.04.2012.A234 で承認された機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC).
 注: CD1 の背景を持つ成人男性野生型マウスを使用して、手順を説明します。食品、動物用の特殊なコントロールや治療への適切なアクセスを確保し、手術前後の専門研究所単位でマウスを飼うため。動物を購入した場合の手術を行う前に、1 週間を順化外。
 1 ドナーの準備 <ol><li>感染症を避けるために手術中に滅菌状態を維持するために滅菌材料・機器を使用します。</li>。
	<li>は、ボリューム イソフルランとフェイス マスクを通して酸素を 100% 1.5% の混合物に各マウスを麻酔します。仰臥位とテープでプラットフォーム オペレーティング テーブルにすべての足でマウスを置きます。その反射を確認するには、マウスを十分に麻酔、確かに後部のフィートをつまんでします。プロシージャの間に乾燥を防ぐために目の上眼軟膏を置きます</li>。
	<li>脱毛ジェルを使用して腹部からすべての髪を削除または髭剃りを使用します。無菌条件下で操作を実行します。クロルヘキシジンと滅菌水のスクラブを交互に腹部を消毒します</li>。
	<li>ハサミやメスで正中線腹部切開を介してドナー大動脈を削除します。右に手動で腸を撤回します。手動で軽くパウダー フリー手袋を使用する側に上腸を反映します。
	<ol><li>それを湿った保つため生理食塩水で湿らしたガーゼの部分に腸を配置します</li>。
		<li>離れて非常に慎重にピンセットで鈍的切離を使用して周囲の組織から腹部大動脈を解剖します</li>。
		<li>ピンセットで腎動脈と上大静脈からの分岐の間に大動脈のセグメントを区切ります</li>。
		<li>このセグメントを非常に慎重に 11-0 モノフィラメント縫合を使用のすべての小さな枝を確保します</li>。
		<li>大動脈を削除する前に下大静脈にヘパリンの 50 U を含む生理食塩水の溶液 0.5 ミリリットル (mL) を挿入します</li>。
		<li>大動脈のセグメントが削除された後の exsanguinate ドナー動物ができます</li>。
		<li>生理食塩水を完全にグラフトをすすいで氷冷生理食塩水の容器にすぐに転送します</li>。
	</ol></li></ol> 2。受信者の準備 <ol><li>ボリューム イソフルランとフェイス マスクを通して酸素を 100% 1.5% の混合物を持つ受信者の動物の麻酔を髪を削除し、(セクション 1) を駆除します。メスと骨盤に、剣から中間線切開を行い、腹部の壁を撤回します。プロシージャの間に乾燥を防ぐために目の上眼軟膏を置きます</li>。
	<li>ラップ食塩水内腸ガーゼを湿らせたし、動物に非常にゆっくり転置 &#39; s 右</li>。
	<li>Dissect 高齢者大動脈腎動脈の間無料の近位と遠位のピンセット分岐します</li>。
	<li>このセグメントを非常に慎重に 11-0 モノフィラメント縫合を使用のすべての小さな枝を確保します</li>。
	<li>6-0 シングル絹縫合糸で大動脈の近位および遠位部分をクランプします</li>。
	<li>クランプ間の中間に大動脈を分割し、ルーメン オープンをフラッシュするヘパリン生理食塩水で切口を灌漑します</li>。
	<li>は世話を正しく合わせてドナーと受信者 (大動脈の任意のねじれを避けるために 11-0 のモノフィラメントで縫合に続いて受信容器に挿入餌容器端と同所性同種の位置にグラフトを配置します。 図 1) 10.</li> <li>吻合部の検査を実施した後、合字を慎重に取り外します。まず遠位クランプをリリースします。この方が低気圧が近位部の高圧側を解放する前に、一緒に壁を保持します</li>。
	<li>はすぐに移植を灌流し、パルスが見えるを確認してください。絹の残党を慎重に取り外します。ドナーと受信者の大動脈の間最適なラップの長さは 1-2 mm.</li>
	<li>腹部の内容を腹腔内に戻り、全体を閉じる実行中 3-0 ポリグ リコール酸縫合糸で巻き</li>。
	<li>マウス ブプレノルフィンを与える (0.05 mg/kg 体重の皮下 (SC)) 麻酔を終了する前にします</li>。
	<li>放置しないでください動物それが完全に意識するまで。疼痛管理 buprenophine 0.05 mg/kg 体重で療法が SC 術後後 3 日間一日に三回管理機関監督機関による承認</li>。
	<li>組織採取、麻酔として受信者のマウスの上記の説明し、4% ホルムアルデヒド/PBS、続いてリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で血管のフラッシュ (pH 7.4 を =) 心臓穿刺によって。グラフトをそっと取り外します。4% ホルムアルデヒド/PBS で一晩固定後プロセス標本はさらに、パラフィンに埋め込む</li>。
</ol>

<ol><li>Rowinska, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-+invasive+in+vivo+analysis+of+a+murine+aortic+graft+using+high+resolution+ultrasound+microimaging%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Radiol%22%5BJournal%5D)">Non- invasive in vivo analysis of a murine aortic graft using high resolution ultrasound microimaging.</a> Eur J Radiol. 81 (2), 244-249 (2012).</li>
<li>Daugherty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Mouse models of atherosclerosis.</a> Am J Med Sci. 323 (1), 3-10 (2002).</li>
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<li>Engelbrecht, G., Kahn, D., Duminy, F., Hickman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+rapid+technique+for+renal+transplantation+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">New rapid technique for renal transplantation in the rat.</a> Microsurgery. 13 (6), 340-344 (1992).</li>
<li>Baxter, K., Hao, P. M., Howden, B. O., Saunder, A., Jablonski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+technique+of+abdominal+heart+transplantation+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Modified technique of abdominal heart transplantation in the rat.</a> J Heart Lung Transplant. 17 (11), 1057-1064 (1998).</li>
<li>Dambrin, C., Calise, D., Pieraggi, M. T., Thiers, J. C., Thomsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+aortic+transplantation+in+mice%3A+a+new+model+of+allograft+arteriosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Orthotopic aortic transplantation in mice: a new model of allograft arteriosclerosis.</a> J Heart Lung Transplant. 18 (10), 946-951 (1999).</li>
<li>Siemionow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+of+microarterial+anastomoses%3A+end-to-end+versus+end-in-end+%28sleeve%29+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hand+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">Histopathology of microarterial anastomoses: end-to-end versus end-in-end (sleeve) technique.</a> J Hand Surg Am. 15, 619-625 (1990).</li>
<li>Charo, I. F., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+roles+of+chemokines+and+chemokine+receptors+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation.</a> N Engl J Med. 354 (6), 610-621 (2006).</li>
<li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+surgical+technique+for+the+establishment+of+a+murine+model+of+aortic+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Improved surgical technique for the establishment of a murine model of aortic transplantation.</a> Microsurgery. 18 (6), 368-371 (1998).</li>
<li>Guo, L., Agarwal, A., George, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+aortic+transplantation+in+mice+for+the+study+of+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Orthotopic aortic transplantation in mice for the study of vascular disease.</a> J Vis Exp. (69), e4338(2012).</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

この研究の前にマウスでの他の各種の移植モデルは徹底的に分析3,6,7,10,13,14.私たちの条件にマッチした従来のエンド-エンド縫合方法と比較してスリーブ吻合部の高い信頼性を示したと Dambrinらによって変更とスリーブを用いた大動脈移植モデルが選択されました。1,10。
この手法は、クロス クランプ時間かなり短縮術中大動脈へのダメージを最小限に抑えることと多くの点で有利です。血栓症の発生率が低いは、容器口径ドナーと受信者の間の潜在的な不一致を避けることに加えられなかった。上記の観察はこの手法をマウスの大動脈移植における血管疾患を調査するため非常に作る。
超音波が移植後 8 週間が実行されたフォロー アップ研究で有意な変化は認められなかった.これは手術中に大動脈への損傷が最小限1だろうと仮定を確認しました。
この記事で紹介した移植術は障害血管整合性とその機能の両方を保証します。したがって、この実験的移植モデルが退行性血管疾患遺伝子改変マウスでの将来の分子および薬理学的調査のための貴重なツールとして可能性があります判断できます。
ビデオのガイドすることができますこの単純な動静脈動脈モデルの使用を示す教材として機能することと、血管病態の多くの重要な問題についてさらに実り多い議論に貢献することと考えています。この非常に急速な吻合法は、遺伝子組み換えマウスで血管疾患を勉強するに使えます。移植併用動脈瘤モデルでの変更としても使えます。
プロシージャの間に重要なポイントがあります。縫合自体を配置することは、最も重要なステップです。外科医は、ドナーとレシピエントの適切な配置による大動脈の任意のねじれを避けるために世話をするが。クランプは、吻合部の検査後慎重に削除されます。遠位クランプは、まず近位部の高圧側のリリース前に壁を保持している低圧の結果常に解放する必要があります。正しく次のリリースのシーケンスの結果を出血でしょう。

移植自体によって引き起こされる特定の血管反応と arteriogenic 環境に接続されている特定の全身的要因の識別をできるマウス大動脈移植モデルに細心の注意を支払われている先行研究で指摘したよう1,2,3。 ここで重要な役割を果たしている主要な要因は、ノックアウト、トランスジェニック マウスの可用性です。このようなモデルに関与識別および退行性血管疾患、動脈硬化や動脈瘤形成4,などの開発に関連付けられている新しい病態生理学的経路を決定する可能性を提供しています5。
それは、本質的な虚血/再灌流を移植中に移植用血管への損傷が表示されますは注目に値するです。したがって、移植の整合性や術後の期間中に予期しない炎症性反応に関する特定の問題の発生がおそらく血管の変性疾患3 の病態生理学的変化を除外除外できません。、4,5,6,7。スリーブ吻合は直径 1 ミリ以下の血管の動脈吻合のため代替エンドで方法で、大動脈に続いて合わせられたラットの腎・心臓移植で正常に適用されています。Dambrinらによるマウスの移植8,9,10,11。
スリーブの移植技術を用いた大動脈損傷は非常に技術的な失敗率が低く、平均でわずか 20 分を持続的な原因を最小限に抑えます。以前の研究結果は、スリーブ法1を用いた移植後体内の isograft の構造と機能性を実証しています。Dambrinら説明短い学習曲線の成功率は 78% を終わった後10。血栓症などの合併症はまれですが、たとえば Engelbrechtらがラット8腎移植でスリーブを用いた血栓症を観察しなかったです。
スリーブ吻合とマウス大動脈移植モデルは、iso/同種移植血管反応を研究する迅速かつ簡単なツールです。このビデオは、当研究室で実施する大動脈移植手順を示しています。この移植モデル血管変性疾患の根本的な病理メカニズムを定義する際に役に立つかもしれませんし、分子および薬理学的介入の12のそれ以上の評価に貢献するかもしれない。

<table><tbody><tr><td>Halseyニードルホルダー</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>12001-13</td><td></td></tr>デュ<tr><td>モン#5鉗子-</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>レクサーベビーはさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14079-10</td><td></td></tr>カ<tr><td>ストロビエホマイクロニードルホルダー</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>12060-01</td><td></td></tr>ヴァン<tr><td>ナスシザー</td><td>スAesculap、ドイツ</td><td>Typ OC498R</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo縫合鉗子</td><td>Geuder、ドイツ</td><td>19015</td><td></td></tr><tr><td>6-0シルクブラック(シルク)</td><td>Deknatel、Research Triangle Park NC、USA</td><td>18020-60- FST</td><td></td></tr><tr><td>11-0モノフィラメント(エチロン)</td><td>エチコン、ノルダーシュテット、ドイツ</td><td>EH7438G</td><td></td></tr><tr><td>3-0ポリグリコール酸縫合糸(セラフィット)</td><td>Serag-Wiessner、Naila、ドイツ</td><td>60203214</td><td></td></tr><tr><td>イソフルオラン</td><td>任意のジェネリコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>任意のジェネリコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.9% 生理食塩水</td><td>任意のジェネリコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブプレノルフィン</td><td>任意のジェネリコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベパンテン 目と鼻のクリーム</td><td>バイエル、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>オプミ MDO/S5</td><td></td></tr><tr><td>気化器</td><td>アイケマイヤー</td><td>TEC3</td><td></td></tr><tr><td>超音波Vevo</td><td>、カナダ</td><td>770,2100</td><td></td></tr></tbody></table>

大動脈弁移植 - 教則ビデオのマウスモデルでスリーブを用いた

Using the Sleeve Technique in a Mouse Model of Aortic Transplantation - An Instructional Video

スリーブを用いた同所性同種大動脈弁移植は、唯一の 10-20% の故障率で大動脈への損傷を低減します。スリーブ メソッドを使用してマウスの大動脈を吻合するために時間は短くて簡単な平均 20 分、iso/同種移植の研究を許可します。次の資料では、私たちの研究室で使用される大動脈移植手順について説明します。マウスは、1.5% ボリューム イソフルランとフェイス マスクを通して 100% の酸素の混合物で麻酔をかけられました。この時点で、大動脈腎動脈とその分岐間のセグメントは、上大静脈、自由に準備と clampedat から分離された単一の絹糸と近位および遠位のセグメント。大動脈の削除する前に、ヘパリンを含む食塩は下大静脈に注入されました。大動脈クランプの間カットされたし、生理食塩水ヘパリン溶液を用いて内腔をフラッシュします。モノフィラメント縫合糸で袖のテクニックは、同所性同種位置で腹部大動脈を移植するために使用されました。

血栓症の高いリスクがあったが、マウスがない観測の身体障害を持つ 15-30 分以内麻酔から回復しました。超音波解析が行われた術後フォロー。野生型マウスの研究で使用されるは、内腔の寸法変化を起こしません。したがって、狭窄も動脈瘤の形成が観察されました。移植動物は血管壁 (図 2) のプラーク開発を展示できませんでした。
プラーク, 平滑筋細胞とマクロファージの集積を決定する immunohistology など従来の汚損プロシージャを使用できます。本研究では組織学的免疫組織化学染色をグラフトの整合性をテストする接ぎ木後 6 週間行った。組織染色 (ヘマトキシリンとエオシン (HE) および免疫組織化学染色 (平滑筋アクチン (SMA) とマクロファージ (MAC2)) (図 3) を見せてくれた平滑筋細胞、内皮細胞のライニング、および no の分布パターンをそのまま内膜の細胞の蓄積。グラフト血管 (図 3) で検出された重要な病変や細胞の活性化がないことが示唆されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54915/54915fig1.jpg"> 
図 1: 袖の手法。腹部大動脈は、袖のテクニックを使用して移植されました。この手順ではドナーの大動脈は浅刺さ餌容器内に存在と同所性同種の位置に置かれました。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54915/54915fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54915/54915fig2.jpg"> 
図 2: 術中超音波画像と。移植移植 (A)、(B) 三次元超音波および B モード表示 (C) 後 6 週間の術中 (剖検) ビューの例です。術後のフォロー アップは、超音波を用いて行った。写真は、ルーメンの次元で変化なしでグラフトの開存を表示.また、狭窄や動脈瘤の形成は認められなかった。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54915/54915fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54915/54915fig3.jpg"> 
図 3: 組織学的および免疫組織化学画像。移植後 6 週間で移植した動物の組織学的および免疫組織化学の代表的なイメージ。組織によって移植された大動脈に大きな病変認められなかった (ヘマトキシリンとエオシン、彼は、100 倍の倍率、スケールバー = 50 μ m)、免疫組織染色 (平滑筋アクチン SMA (赤)、またはマクロファージ MAC2 (緑) 200 X 倍率、スケール バー =25 μ m)。核カウンターで染色 DAPI (青).<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54915/54915fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

マウスでスリーブを用いた同所性同種大動脈移植モデルを提案します。それは非常に急速な吻合法のことで、血管疾患の研究に用いることができます。

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the ...

この手順では、ドナーの大動脈を視能整列位に置き、表在性咬傷を栄養血管で採取します。フェイスマスクを介して、1.5体積パーセントのイソフルランと100%酸素の混合物でマウスを麻酔します。マウスを仰臥位のプラットフォームに置き、すべての脚を手術台にテープで固定します。手術中の乾燥を防ぐために、眼科用軟膏を目に置きます。.反射神経をチェックし、後足をつまんでマウスに十分な麻酔がかけられていることを確認します。腹部からすべての髪を取り除きます。脱毛クリームを塗るか、シェーバーを使用してください。無菌条件下で操作を行います。腹部を消毒します。ドナー大動脈を切除するには、腹部の正中線切開を行い、腸を手動で右に引っ込めます。パウダーフリーの手袋を使用して、腸を横にそっと手動で反射させます。生理食塩水で濡らしたガーゼの上に腸を置き、湿らせます。ピンセットによる鈍的解剖を使用して、腹部大動脈を周囲の組織から非常に慎重に解剖します。ピンセットを使用して、腎動脈と大静脈からの分岐部との間の大動脈のセグメントを解剖します。このセグメントのすべての小さな枝を11-0モノフィラメントシングル縫合糸を使用して固定します。大動脈を切除する前に、50単位のヘパリンを含む0.5ミリリットルの生理食塩水を下大静脈に注入します。大動脈の部分が除去される前に、ドナー動物に放血させてください。移植片を生理食塩水で完全にすすぎ、その後すぐに氷のように冷たい生理食塩水の容器に入れます。レシピエントの準備は、フェイスマスクを通して動物に麻酔をかけ、毛を取り除き、上記のように消毒し、剣状突起から骨盤への正中線切開をメスで行います。リトラクターで腹壁を引っ込めます。腸を生理食塩水で湿らせたガーゼで包み、動物の右側に非常に穏やかに移動します。腎動脈の近位と遠位の分岐部の間の腎下大動脈をピンセットで解剖します。このセグメントのすべての小さな枝を11-0モノフィラメントシングル縫合糸を使用して固定します。大動脈の近位部と遠位部を6-0シングルシルク縫合糸でクランプします。クランプの間の中央で大動脈を分割し、切り口の端をヘパリン化生理食塩水で洗浄して、内腔を洗い流します。移植片を整形外科の位置に置きます。11-0モノフィラメントを使用した縫合糸によるスリーブ技術を使用して吻合を行います。この方法では、供給容器の端部が受容器内に置かれます。腎下レシピエント大動脈の端をドナー大動脈の近位端に配置します。同様に遠位吻合を行います。ドナー大動脈の遠位端をレシピエント大動脈の遠位端内に配置します。ドナーとレシピエントの大動脈の完全な位置合わせを確保することにより、大動脈のねじれを避けるように注意してください。クランプが解放される瞬間は、手順の非常に重要なステップであり、非常に慎重に実行する必要があります。吻合が正常であることを確認した後、クランプを解放します。最初に遠位クランプを静かに解放し、次に近位クランプを離します。このようにして、高圧側が解放される前に壁を一緒に保持するための低圧があります。移植片はすぐに灌流され、脈拍が見えます。絹の残りをそっと取り除きます。腹部の内容物を腹腔に戻し、ランニング3-0ポリグリコール酸縫合糸を使用して創傷を閉じます。麻酔を終了する前に、ブプレノルフィン0.05ミリグラム/キログラムをマウスに投与します。.移植後6週間の移植片の剖検写真と、その超音波3次元およびBモードビューの例を紹介します。写真はグラフトの開存性を示しています。グラフトによって示されるルーメン寸法に変化はありません。また、狭窄や動脈瘤の形成は認められていません。移植された大動脈には、組織学的染色および免疫組織化学的染色による有意な病変は認められなかった。核はDAPIによって対比染色されました。結論として、この非常に迅速な吻合法は、遺伝子操作マウスの血管疾患の研究に使用できる可能性があります。

using-sleeve-technique-mouse-model-aortic-transplantation-an

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

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血管カフを用いたマウスヘテロトピック頸部心臓移植

学ぶマウスにおけるスリーブ法を用いた大動脈移植術。迅速な吻合技術により血管疾患の研究モデルを確立し、移植後のグラフト開存性と組織学的評価方法を習得できます。

大動脈弁移植 - 教則ビデオのマウスモデルでスリーブを用いた

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