Name: 腫瘍の増殖と転移研究のためのトレーサブル記者との乳癌患者由来の異種移植片の標識 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 学ぶレンチウイルス粒子を用いた乳癌患者由来異種移植片の安定標識法。GFP・ルシフェラーゼレポーター導入により、生体内イメージングで腫瘍増殖と転移をリアルタイム追跡し、組織学的解析の必要性を低減する。

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著者らは、これらの研究で使用された高力価レンチウイルス産生のためのpHAGE-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-Wベクターとプロトコルを提供してくれたボストン大学のDarrel Cotton博士に感謝します。この作業は、DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC)、ACS IRG # 57-001-53 (DMC)、NCI K22CA181250 (DMC)、R01 CA140985 (CAS) によって資金提供されました。NCI P30CA046934 Centerの助成金は、コロラド大学AMCのin vivoイメージングおよび組織培養コアを支援しました。

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<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+models+of+human+breast+cancer%3A+protocols+for+in+vitro+and+in+vivo+applications+in+tumor+biology+and+translational+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine.</a> Curr Protoc Pharmacol. , (2013).</li>
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<li>Indumathi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+depletion+of+stromal+vascular+fractions+isolated+from+human+adipose+tissue%3A+a+novel+approach+towards+cell+enrichment+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Lineage depletion of stromal vascular fractions isolated from human adipose tissue: a novel approach towards cell enrichment technology.</a> Cytotechnology. 66 (2), 219-228 (2014).</li>
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<li>Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Models of bone metastasis.</a> J Vis Exp. (67), e4260(2012).</li>
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<li>Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+human+breast+cancer+cell+lines+that+permit+rapid+and+sensitive+in+vivo+detection+of+mammary+tumors+and+multiple+metastases+in+immune+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice.</a> Breast Cancer Res. 7 (4), R444-R454 (2005).</li>
<li>Lawson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+reveals+a+stem-cell+program+in+human+metastatic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis reveals a stem-cell program in human metastatic breast cancer cells.</a> Nature. 526 (7571), 131-135 (2015).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

プロトコル内の重要なステップ:
高力価レンチウイルス粒子(>108 TU/ml)の使用は、 in vitro 形質導入中の培地組成の慎重な制御を可能にするため、このプロトコルの成功における重要なステップです。高力価ウイルス粒子を製造するための複数の方法が十分に説明されていますが、18,19;このプロトコルは、 <a href="http://www.kottonlab.com">www.kottonlab.com</a> で詳細に説明されているように生成されたレンチウイルス粒子を使用します。腫瘍の消化とがん細胞の解離のための穏やかな方法は、標識腫瘍の標識と増殖を成功させるために重要です。消化時間を3時間以上延長するか、消化温度を37°Cに上げると、解離細胞の数は増加しますが、ほとんどの腫瘍で細胞の生存率と標識の成功率が低下します。
変更とトラブルシューティング:
<p class="jove...

外科的に切除腫瘍サンプルは、直接免疫不全マウスに移植された患者由来の腫瘍異種移植片（PDXs）の開発は、標準的な細胞株の異種移植モデルに比べていくつかの利点を提供し、癌研究1,2における大きな進歩を表しています。 PDXsは最初の継代で増殖させ、腫瘍の遺伝的および生物学的特性の最小の変化で連続継代により維持及び拡張することができます。そしてより正確にヒト癌細胞株3-8由来の異種移植片よりも腫瘍の不均一性を反映しています。これらのモデルは、現在広く医薬品開発6,11における前臨床プラットフォームとしておよび癌生物学4,12を研究するための実験的なツールとして、癌治療9,10をパーソナライズするためのプラットフォームとして使用されています。 ほとんどのPDXsは、移植され、実行可能にキャリパーを使用して、時間をかけて腫瘍増殖の測定を可能にする、皮下に伝播されます。しかしながら、転移性疾患はPDXsを使用してモデル化することはより困難でした。具体的には乳癌のために、別の器官への転移能力を有する異種移植片3,5,13を説明したが、転移部位への自発的な普及の頻度が極めて低いです。報告された場合には、転移性の負担の同定および定量は、死後標的臓器の面倒な組織学的検査に依存しています。生物発光を発現する癌細胞株（ルシフェラーゼ、リュック）または蛍光（緑色蛍光タンパク質、GFP）の遺伝子レポーターは、一般的に、脳、肺、心臓内の後の骨、肝臓、尾静脈、大腿骨内および脾臓注射乳癌転移の実験モデルに使用されています14-16。これらのモデルは、原発腫瘍から播種をバイパスするが、それらは臓器向性および転移性のコロニー形成のメカニズムを研究する価値があります。しかし、一次患者の腫瘍とPDXs由来の細胞は、低トランスフェクションまたは形質導入率usinを持つことができますグラム標準的な手順。一つの代替案は、その後、従来の組織培養プロトコルを用いて標識することができ、インビトロ 17 に PDX由来細胞株を確立することです。このアプローチは、しかしながら、細胞株の誘導が困難であり、細胞の表現型を変更することができるため、最もPDXsを標識するのに適していません。ここでは、in vivoイメージングに適したレンチウイルスベクターを用いたPDX-解離腫瘍細胞の形質導入のためのプロトコルを提示します。加えて、我々は、免疫不全マウスにおいて、解離したLUC-GFP標識されたPDX細胞の心臓内注射を使用して実験的転移を説明します。 遺伝子レポーターを発現するレンチウイルスとPDX-解離オルガノイドの形質導入のための基本的なプロトコルは、以前に18を説明してきました。現在のプロトコルでは、ヒト腫瘍細胞を濃縮し、100％の導入効率の近くに取得するために追加の方法を説明するだけでなく、実験的な乳癌を検出するための標識PDXsの使用転移。このプロトコルは、様々な発光と蛍光マーカーと同様に、遺伝子発現（目的の遺伝子の、すなわち 、のshRNAノックダウン）の調節にPDXsの複数の癌種を標識するために適合させることができます。

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Hyclone</td><td>SH30023.01</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>BD Biosciences</td><td>354060</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>BD Biosciences</td><td>354001</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>17504-44</td><td></td></tr><tr><td>抗真菌抗生物質</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>の革新的な細胞技術</td><td>AM-105-500</td><td>消化緩衝液</td></tr><tr><td>FBS</td><td>アトランタの生物製剤</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>HBSSの赤いCa2+/Mg2+自由な</td><td>Hyclone</td><td>のSH30031.02</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>のHyclone</td><td>のSH30258.01</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex</td><td>Cultrex</td><td>3433-005-01</td><td>地下マトリックス抽出物(BME)</td></tr><tr><td>30&#176;Cシェーカー</td><td>NewBrunswick Scientific CO. INC</td><td>Series 25 Incubator Shaker</td><td></td></tr><tr><td>70 &#956;mフィルター</td><td>ファルコン</td><td>7352350</td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td>フィッシャー</td><td>22079690</td><td></td></tr><tr><td>クロレキシジン消毒剤</td><td>デュルベット&nbsp;</td><td>NDC# 30798-624-35</td><td></td></tr><tr><td>赤血球&nbsp; 細胞溶解試薬</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>ノイラミニダーゼ</td><td>Σ</td><td>N7885-1UN</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (CD326+) マイクロビーズ*</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-061-101</td><td></td></tr><tr><td>系統細胞枯渇キット、マウス*</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separator&nbsp;</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>Mini MACS Magnetic Stand</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MS カラム</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-201</td><td>MS または LS カラムは、セルの数に合わせて調整して使用できます。</td></tr><tr><td>Illumatool チューナブルライトシステム</td><td>ライトツールズの研究</td><td>各種</td><td>in vivo蛍光イメージング</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS200イメージングデバイス</td><td>Xenogen</td><td>各種</td><td>in vivo 発光イメージング</td></tr><tr><td>ヒトサイトケラチンクローン MNF116 モノクローナル抗体</td><td>DAKO</td><td>M0821</td><td>汎サイトケラチン&nbsp;</td></tr><tr><td>上皮成長因子受容体抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>4267S</td><td>EGFR</td></tr></tbody></table>

腫瘍の増殖と転移研究のためのトレーサブル記者との乳癌患者由来の異種移植片の標識

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

腫瘍の生物学と治療への反応を研究するための前臨床モデルの使用は、癌研究の中心です。長年にわたるヒト細胞株や多くのトランスジェニックマウスモデルは、ヒト悪性腫瘍の主要な側面を再現できないことがよくあります。したがって、患者の腫瘍とその転移の不均一性をよりよく表す代替モデルが開発されています。外科的に切除された腫瘍サンプルを免疫不全マウスに移植する患者由来異種移植片(PDX)モデルは、複数世代にわたって移植でき、ヒトがん細胞株に由来する異種移植片よりも腫瘍の不均一性をより効率的に反映するため、魅力的な代替手段となっています。PDXの使用には限界があり、トランスフェクションやトランスデューシングによるトレーサブルレポーターの導入や遺伝子発現の操作が難しいことが挙げられます。現在のプロトコルでは、解離した腫瘍細胞をPDXから高い形質導入効率で形質導入する方法、および乳がん転移の実験モデルに標識PDXを使用することが説明されています。 このプロトコルは、転移カスケードの臓器コロニー形成プロセスを研究するための実験的転移モデルで標識PDXを使用することも示しています。さまざまな臓器への転移は、生きた動物での生物発光イメージング、または解剖中および切除された臓器でのGFP発現を使用して、簡単に視覚化および定量化できます。これらの方法は、複数のタイプのPDXの使用を転移研究に拡張するための強力なツールを提供します。

本手法では、高タイターのレンチウイルスベクターpSIH1-H1-copGFP-T2A-puroおよびpHAGE-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-Wを用い、PDXから解離させた乳がん細胞に導入（トランスダクション）する方法について説明します。これらのベクターは蛍光マーカーを発現するため、導入効率の推定が可能です。 in vitro、感染後早ければ24時間で（図1a）。ほとんどのPDXでは、GFPの発現は感染後最大72時間まで遅延します（図1b）、この時点で細胞凝集体の形成が一般的に観察されます。形質導入は、ヒトがん細胞を濃縮した後に実施することが可能です（すなわち、 Lin+細胞除去法を用いて、 図1a) または未精製 PDX 解離細胞（図1bマウスの血球細胞が生細胞の総数に対して大きな割合を占める血管新生が盛んな腫瘍では、腫瘍上皮細胞の濃縮が推奨されます。
<p class="...

緑色蛍光タンパク質を発現するレンチウイルス粒子とルシフェラーゼレポーターによる患者由来異種移植片(PDX)の安定な標識方法について説明します。この方法により、一次部位でのPDXの増殖を追跡し、in vivoイメージングシステムを使用して自然および実験的転移を検出できます。

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

この導入プロトコルの全体的な目的は、患者由来異種移植片（PDX）にレポーター遺伝子を安定的に導入し、実験的および自発的な転移モデルでの利用を容易にすることです。この手法は、PDXからの皮外転移の程度など、がん研究における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、in vivoイメージングを用いて標識されたPDXを追跡できるため、死後の広範な組織学的解析を行うことなく、組織化された特定の転移の評価が可能になることです。本プロトコールの実演は、乳がん患者由来異種移植片のラベル付けに本手法を日常的に適用しているポストドクターのJessica Finlay-Schultzが行います。無菌操作を用いて、まずメスで腫瘍周囲の皮膚を切開します。次に、ピンセットで皮膚を牽引し、清潔なメスを用いて皮膚を腫瘍から剥離させます。腫瘍が完全に露出したら、清潔なピンセットとメスを使用して、組織を氷上の5 mLの洗浄液に移します。次に、洗浄液を除去し、HEPESを添加した10 mLのHBSSで腫瘍を2回洗浄します。洗浄した腫瘍を、あらかじめ重量を量った滅菌済みの60 cm組織培養プレートに置き、プレートの重量を量って腫瘍重量を推定します。メスを使用して、腫瘍を半分に切断します。次に、その半分から直径3 mmのディスクを切り出し、10% ホルマリンに24時間浸漬します。腫瘍の残りの部分にHEPES含有HBSSを200 µL加え、ピンセットと清潔なメスを用いて、組織を可能な限り細かく刻みます。断片を滅菌済みの50 mLコニカルチューブに移し、腫瘍100 mgあたり、抗真菌薬および抗生物質を添加した消化緩衝液を1 mL以上加えます。30 °C、125～200 rpmの回転条件下で3時間後、35 mLの洗浄培地を加えて消化を停止させ、得られた組織スラリーを70 µmナイロンメッシュでろ過して新しい50 mLコニカルチューブに移し、未消化組織を除去します。遠心分離により細胞を回収し、ペレットを1 mLの赤血球溶血緩衝液に再懸濁し、室温で5分間静置します。溶菌後、10 millilitersの洗浄バッファーを加えて浸透圧を復元し、40 micronフィルターで細胞をろ過して凝集塊を除去します。細胞を再度遠心分離し、ペレットを5 millilitersの洗浄バッファーに懸濁させて氷上に置きます。その後、トリパンブルー排除法により生存細胞数をカウントします。lineage plus Mel細胞除去法を用いてヒト上皮癌細胞を濃縮するため、最大1×10⁷個の細胞を新しい5 mLポリプロピレンチューブに移し、2 mLの上皮濃縮バッファーを細胞に加えます。遠心分離により細胞を回収し、ピペットを用いて上清を完全に除去します。次に、ペレットを40 µLの氷冷した上皮濃縮バッファーで再懸濁し、細胞1×1

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がん研究

びまん性蛍光トモグラフィは、前臨床、高を通じて比較的低コストの可能性のあるアプローチを提供しています...

癌バイオマーカーの局在の小型動物のCTガイド下時間領域拡散蛍光トモグラフィー

次のビデオでは、緑色蛍光タンパク質を発現するレンチウイルスとルシフェラーゼレポーターをin...

標識PDX腫瘍細胞への形質導入:In vitroでの腫瘍細胞への蛍光マーカーを発現するレンチウイルスの導入

この原稿は、循環腫瘍細胞(CTC)から前立腺癌患者由来異種移植片(PDX)を生成するために使用される方法を詳述しています。CTCからのPDXモデルの生成は、前立腺がんを研究するための代替実験モデルを提供します。最も一般的に診断される腫瘍であり、男性の癌による死亡原因として多い。...

前立腺癌患者の発生は、循環腫瘍細胞からの異種移植モデルを派生します

卵巣がんの転移は、多数のびまん性腹腔内病変を特徴としており、腫瘍負荷の正確な視覚的定量化は困難です。 ここでは、赤色蛍光タンパク質(RFP)標識腫瘍細胞と光学イメージングを使用して、転移性腫瘍量のin situおよびex...

腹腔内卵巣癌転移の定量

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超音波の利用ガイド生物学的関連性の転移性腫瘍の異種移植片の確立のため組織指示細胞注入

本研究は、緑色蛍光タンパク質および生物発光シグナルの検出と定量的分子検出技術の統合によって腫瘍負荷を正確に評価するための高度なプロトコルをプリセットする。...

交感性乳癌モデルを用いたトリプルネガティブ乳癌の研究

ここでは、腫瘍のゲノム構成に基づいて選択された標的療法の有効性を試験するプロトコルを提示する。このプロトコルは、構造的DNA再構成の同定と検証、患者の腫瘍のマウスへの生着、および対応する薬物に対する応答のテストを記述する。...

構造DNA改変解析と患者由来異種移植片を用いたがんの標的治療の試験

この原稿は、同所注射された乳房腫瘍からの自然肺転移の確立および縦断的成長モニタリングの方法論を説明しており、転移カスケードのすべての段階での介入に適しています。...

インビボ 同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

このプロトコルは、マウスにおける乳がん患者由来異種移植片の同所性移植のための効率的な非外科的方法を説明しています。この技術には、酵素による腫瘍解離とそれに続く乳腺脂肪パッドへの直接注射が含まれ、ハイスループットの移植が可能になります。包括的な検証により、モデルの忠実度が確保され、さまざまな乳がんサブタイプにわたる厳密な研究が容易になります。...

乳がん患者由来異種移植片のハイスループット解離と同所性移植

学ぶレンチウイルス粒子を用いた乳癌患者由来異種移植片の安定標識法。GFP・ルシフェラーゼレポーター導入により、生体内イメージングで腫瘍増殖と転移をリアルタイム追跡し、組織学的解析の必要性を低減する。

腫瘍の増殖と転移研究のためのトレーサブル記者との乳癌患者由来の異種移植片の標識

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