使用周囲粒子状物質によって誘発される染色体異常の解析インビトロシステム

この実験の全体的な目標は、周囲の空気から抽出された粒子状物質への細胞の曝露によって引き起こされる染色体損傷を検出することです。この方法は、粒子状物質の分野における1つの重要な質問に答えるのに役立ちます、つまり、粒子状物質への曝露は染色体損傷を誘発しますか?この技術の主な利点は、遺伝物質に誘発された損傷を直接視覚化できることです。

テキストプロトコルに従って粒子を収集および分析した後、培養開始前に少なくとも30分間、摂氏37度の水浴中で完全な増殖培地、0.25%トリプシン、およびPBSを温めて粒子曝露を実施します。生の264.7細胞を洗浄した後、温かいトリプシン溶液1ミリリットルを皿に加え、細胞を掻き取って組織培養容器の底から取り除きます。次に、細胞を採取し、ピペッティングを繰り返して単一細胞懸濁液を作製します。

トリパンブルーを使用して細胞の数を数え、事前に加温した完全培地を使用して、100ミリメートルの組織培養皿に1平方センチメートルあたり8000の密度でプレートします。次に、完全な培地を使用して容量を10ミリリットルに調整し、最終濃度を50,000細胞/ミリリットルにします。細胞を摂氏37度、5%CO2で24時間インキュベートして、細胞が付着するのを待ちます。

バイオセーフティキャビネットでは、滅菌PBSを使用して、ろ過された粒子を0.5ミリグラム/ミリリットルの濃度で希釈し、5マイクログラム/ミリリットルの治療用量で50マイクログラムの治療用量で希釈します。粒子状物質を含む細胞を処理するには、培養した細胞を10倍倍に拡大した顕微鏡で細胞増殖、細胞形態、培養状態、および汚染を確認します。この段階では、セルは少なくとも 30% コンフルエントである必要があります。

滅菌ピペットを使用して培地を無菌吸引し、摂氏37度のPBSの2ミリリットルを使用して培養容器を2回洗浄します。あらかじめ決められた量の粒子状物質を新鮮な培地で添加し、培養物を摂氏37度、CO2 5%でインキュベートして、遺伝毒性分析とエピゲノ毒性分析の同時分析に使用される曝露と並行して行います。中期に細胞を停止させるためには、細胞を洗浄した後、コルセミド溶液1ミリリットルあたり5マイクロリットルの予備加温培地を2ミリリットル加え、摂氏37度、CO25%で2時間インキュベー

インキュベーション後、培地を完全に取り出し、温かいPBSを使用して細胞を2回洗浄します。次に、トリプシン溶液を加え、培養物を摂氏37度で1分間インキュベートします。セルスクレーパーを使用して細胞を切り離し、10ミリリットルのPBSを追加してトリプシンを不活性化します。

次に、細胞を少なくとも10回上下にピペットで動かしてシングルセル懸濁液を作成し、細胞を15ミリリットルの円錐形遠心チューブに移します。チューブをスイングアウト遠心分離機に入れ、細胞懸濁液を400g、室温で5分間回転させます。低張治療を行うには、細胞ペレットを乱さずにチューブから上清を取り除き、約0.5ミリリットルのPBSを残します。

細胞ペレットを静かに破砕し、P200ピペットを使用して単一細胞懸濁液を調製します。次に、予め温めた塩化カリウム溶液を4ミリリットル加え、穏やかに振とうします。細胞懸濁液を摂氏37度の水浴中で20分間インキュベー

低張治療後、チューブに等量の固定剤を加えて細胞を固定し、チューブを反転させて穏やかに混合します。チューブを室温で400倍gで5分間遠心分離し、上清を取り除きます。この段階では、細胞ペレットのサイズが大きくなり、色が白っぽくなり、より目立つようになります。

上清を取り除きます。4ミリリットルの新鮮な固定剤を加え、チューブを室温で30分間インキュベートします。次に、チューブを遠心分離し、上清を取り除き、4ミリリットルの固定液を使用して細胞をさらに2回洗浄します。

スライドガラスを10%液体洗剤に30分間完全に浸します。次に、スライドを冷たい水道水で30分間十分にすすいでください。蒸留水を使用してスライドを3回すすぎ、洗剤を完全に取り除きます。

次に、蒸留水に浸し、スライドを冷蔵庫に一晩保管します。冷やした湿ったスライドに10マイクロリットルの細胞懸濁液を落とし、室温で一晩乾燥させます。サンプルを染色してマウントするには、ギムザ染色液の一部とPBSの一部を混合して50ミリリットルのギムザ染色溶液を調製し、コプリンジャーに注ぎます。

スライドを染色液に20分間浸し、蒸留水ですすいで余分な汚れを取り除き、すぐにヘアドライヤーを使用してスライドを乾燥させます。スライドを室温で一晩放置します。翌朝、スライド上に封入剤を1滴垂らします。

カバースリップを上にそっと置き、封入剤がスライド上にゆっくりと広がるのを待ちます。次に、ペーパータオルを使用して余分な媒体を取り除きます。最後に、100倍の倍率で明視野顕微鏡を使用して、中期スプレッドの構造染色体異常を調べます。

この画像は、正常なマウスの中期スプレッドが40の非中心染色体を持つことを示しています。粒子状物質による治療は、染色分体切断、無中心フラグメント、環状染色体、二心染色体、ダブルミニッツ、ロバートソン転座、エンドリデュプリケーションなど、さまざまな染色体異常を誘発します。この手順を試みる際には、増殖している細胞のみを使用する必要があることを覚えておくことが重要です。

この手順に従うと、M-FISHやSKYなどの他の方法を使用して、追加の質問に答えることができます。例えば、染色体間、安定な収差が存在するかどうかなどです。この手順を実行する際には、注意と発がん性物質、手袋の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。