Name: 使用周囲粒子状物質によって誘発される染色体異常の解析インビトロシステム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 学ぶ周囲粒子状物質による染色体異常の検出法。RAW264.7マウスマクロファージを用いて、大気中粒子状物質曝露による遺伝物質損傷を直接可視化し、環境汚染物質の遺伝毒性を評価する。

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仕事はバイオ研究エクセレンス[助成金番号1P20GM109005]、国立航空宇宙局（NASA）[助成金番号NNX15AK32A]を通じてアーカンソースペースグラントコンソーシアムの保健センターの国立研究所、および労働安全のための国立研究所によって部分的にサポートされていました健康（NIOSH）[助成金番号2T420H008436]。著者は、この原稿を校正し、編集するためのクリストファーフェテスに感謝したいと思います。

1.粒子の収集と準備<ol><li> 高容量全浮遊粒子サンプラのキャリブレーション <ol><li>マスフローコントローラからサンプラーモータを取り外し、安定したAC電源（ 図1）にモーターを接続します。 注：フィルタは、この手順の間に使用されていません。 </li><li>サンプラーにキャリブレータオリフィスとトップローディングアダプタプレートをマウントします。空気の漏れが存在しないことを保証するために確実にトップローディングアダプタ押さえナットを締めます。サンプラーモータが通常の動作温度（約10〜15分）まで昇温することを可能にします。 </li><li>手で口にオリフィスと圧力タップの上に穴を覆うことにより、リークテストを実施します。空気をエスケープすることにより作られた甲高いスキール音を聞きます。この音が聞こえる場合はリークが存在しているとして、トップローディングアダプタ押さえナットを締め直してください。音が低い場合、漏出は、SYSの他のガスケットの一つの近くにありますテム。 </li><li>ゴム製の真空管とオリフィスの側の圧力タップに水の圧力計の一方の側を接続します。大気開放圧力計の反対側にしておきます。正確な測定値を確保するために、垂直方向に圧力計を保持します。連続流レコーダーの裏側をタップすると、ペンを中心に、正確な測定値を提供するのに役立ちます。 </li><li> 30〜60フィート/分（約ごとに5〜6フィート3 /分）から操作する流量を表す5の流量を使用して手順を繰り返し1.1.2。 5の異なる位置に可変オリフィス上のノブを調整し、5別の読み取りを行います。 </li><li>認定最後の日付、日付、サイトの場所、およびキャリブレーションシート上のオペレータのイニシャルと周囲の空気の温度、周囲気圧、サンプラーシリアル番号、オリフィスシリアル番号、オリフィススロープとインターセプトを記録します。 </li></ol></li><li> 総浮遊粒子サンプル収集および重量分析 <ol><li>ラップアルミホイルの二つの層8 &quot;×10&quot;の石英繊維フィルター。炉内に包まれたフィルタを置き、550℃に温度を設定。少なくとも4時間、フィルターを焼きます。炉クールにしようとフィルターを取得します。 CaCO 3でデシケーター中にフィルタを配置します。 </li><li> 10μgの精度の天秤でフィルタを計量。日中の測定3回繰り返します。個々の測定値は25μgの範囲内でなければなりません。これが達成されていない場合は、デシケーターに包まれたフィルタを返し、次の日の処理を繰り返します。 </li><li>避難所のふた（ 図2）を開きます。真鍮ボルトとワッシャーが邪魔にならないようにダウンスイングすることができ、4ウィングナットを緩めて、フィルターホルダーフレームを削除します。支援画面上に、粗いサイドアップ、アルミ箔からフィルタを展開し、慎重にそれを中心に清掃鉗子を使用しています。正しく画面にフィルタを合わせます。 </li><li>画面上にフレームを配置し、それを確保縁部での空気漏れを回避するために十分な圧力をかけながら真鍮ボルトとワッシャ。清潔な布でフィルターホルダーの周りの汚れの蓄積を拭いてください。慎重に避難所の蓋を閉じて固定します。 </li><li>すべてのコードが適切なコンセントのソケットに差し込まれており、送風機モータ圧力タップと連続流レコーダー間のチューブが接続されていることを確認します。 </li><li>流れレコーダーを準備します。ペン先を高め、新しいチャートを挿入するためにペンアームリフターを押し下げます。レコーダーのドライブハブにチャートのタブの位置を合わせ、ハブ上にグラフの中心を下げるために親指で押してください。チャート上の正しい時刻が時間インデックスポインタと位置合わせされるまで、ドライブハブを時計回りに回転させることで時間を設定します。 </li><li>手動サンプラーに切り替えて、収集を開始。それが正しくインキングされ、経過時間インジケータは、それが正常に動作していることを確認するために確認するためにレコーダーを監視します。 </li><li>サンプリング期間の終了時に、サンプラー、レコードをオフに時間が経過し、グラフを取得します。フィルタを公開するフレームを削除してください。ピンセットで端で静かに保持することによって支援画面から露出し、フィルタを削除します。サンプルは二回サンプルに触れるように縦にフィルタを折り、元のアルミホイルでそれをラップします。 </li><li>計量前に少なくとも24時間のCaCO 3とデシケーターにフィルタを保管してください。サンプリング後のフィルタの重量を測定するための手順を繰り返し1.2.2。ジップビニール袋にフィルタを配置し、分析まで-80℃に保管してください。 </li></ol></li><li> 収集した全浮遊粒子試料の分析 <ol><li>保存されているフィルタを取得し、アルミ箔を展開し、清潔なテフロン表面にフィルタを転送します。ピンセットやメスを使用して、フィルタの外側（白い）部分を切断して処分します。 <ol><li>次に、100ミリリットルのフラスコに0.5 &quot;×0.5&quot;の作品と場所片でフィルタをカット。超純水の50ミリリットルを追加します。超音波でフラスコを置きますバス、33±3 kHzで60分間超音波処理。 </li></ol></li><li>フィルターを100mlの丸底フラスコに0.45μmのポリプロピレンシリンジフィルターを介して抽出します。約5mlの抽出物をフラスコ中に残るまで50℃で圧力下で回転蒸発器装置を用いて水を蒸発させます。 <ol><li>既知重量の15ミリリットルの梨型フラスコに残った水を蒸発させます。乾燥抽出物の入ったフラスコを計量し、乾燥抽出物の質量を記録します。 </li></ol></li><li> 15分間超音波処理することによって、D 2 Oの400μlの乾燥サンプルを溶解し、5ミリメートルの標準的なNMR管に移します。未溶解物質を除去するために、室温で12,000×gで5分間遠心します。 </li><li> D 2 Oの300μlで繰り返しNMR管にNaN 3を10μlの1.4％（最終濃度：w / vの0.02％）を追加します。 NMRチューブ中のD 2 O（最終濃度0.258ミリモル）に総浮遊粒子（TSP）-d4（3.2 mg / mlで）を10μl（32μgの）を追加します。 </li><li>600.17 MHzで動作するNMR分光計を用いて、1 H NMRスペクトルを取得します。 <ol><li>三重共鳴凍結プローブにNMR管を挿入します。次の順序で機器を較正：ロック、曲、シム、90°パルス長較正及び受信ゲイン調整。 </li><li>デジタルクワッド検出モードで180の水選択パルス、8192スキャン、4ダミースキャン、8012.57ヘルツの掃引幅を使用して、1次元励起彫刻配列と25℃でのスペクトルを測定し、周波数は4.70 ppmに設定された水の信号抑制、1.70のオフセット秒の取得時間、32,768時間領域のデータポイント（TD）、1ミリ秒の持続時間の勾配（P16）、勾配後100μ秒回復遅延（D16）。 </li></ol></li><li> 1ヘルツ及び2（65,536データポイント）倍ゼロフィリングの線幅拡大を適用することによって、プロセス1 H NMRスペクトルを示します。手動相とベースラインを修正して、統合します。 0.0 ppmのTSP-d4のピークを設定します。 </li></ol></li></ol> 2.粒子暴露<ol><li> 文化を設定します <ol><li> （37℃）、10％ウシ胎児血清（FBS）およびペニシリン - ストレプトマイシン溶液（100 U / ml）を、0.25％トリプシン溶液とカルシウムマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水浴中（PBS）を含む暖かい完全増殖培地用培養開始前に少なくとも30分。 </li><li>培養されたRAW264.7細胞を含む、5％CO 2インキュベーターからT75フラスコを取り出し、予め温めておいた2mlのPBSで2回細胞を洗浄します。 </li><li>掻き取り、続いて予熱したトリプシン溶液1mlを使用して、組織培養容器の底から付着RAW264.7細胞を取り除きます。 </li><li>組織培養容器から細胞を収集し、繰り返しピペッティングにより単一細胞懸濁液を作ります。予め温めた完全培地での100mm組織培養皿中で8,000 / cm 2で（合計500,000個の細胞）の密度で、トリパンブルー及びプレートを有する細胞の数を数えます。 50,000個の細胞の最終濃度のために10ミリリットルにメディア音量を調整1mlあたり。 注：DNAメチル化解析も行われている場合、プレートの数を倍増。 </li><li> 37℃、バック、5％CO 2インキュベーター内で新たにメッキRAW264.7細胞を置き、24時間アタッチすることができます。 </li><li>また、安全キャビネット内で、フィルタリングの粒子を再懸濁します。例えば、5μg/ mlの治療用量のための滅菌PBS中の0.5mg / mlの濃度で粒子を希釈および5mg /50μg/ mlの治療用量についてmlで。希釈は、予め月まで調製し、-80℃で保存することができます。 </li></ol></li><li> 粒子状物質による治療 <ol><li> 5％CO 2インキュベーターから細胞を取り出し、細胞増殖、細胞形態、培養条件、および汚染の倒立顕微鏡を用いて10倍の倍率で確認してください。一つは、この段階では、少なくとも30％コンフルエントの細胞を持っていることを期待するべきです。 </li><li>無菌的には、滅菌ピペットを用いて培地を吸引し、2mlの37℃のPBSで培養容器を洗浄します2回完全にメディアおよび浮動または死んだ細胞を除去します。 </li><li>培養容器中の新鮮な培地と粒子状物質の予め決定された投与量を追加し、5％CO 2インキュベーター中、37℃で、所望の時間インキュベートします。本研究では、同時遺伝毒性およびepigenotoxic分析のために使用される露光と平行して72時間のPMでRAW264.7細胞を扱います。 注：細胞毒性は、負に細胞遺伝学的解析の品質に影響を与える可能性があります。したがって、そのような細胞毒性、DNAメチル化、ウエスタンブロッティング、または遺伝子発現分析のような付加的なアッセイは、典型的に処理された細胞上で実行されます。記載されているように細胞を露出させ、所望の特定のアッセイを進めます。経験の浅いユーザーはまた、CAを検出する能力をテストするために、メチルメタンなどのポジティブコントロールを含めることができます。 </li></ol></li></ol> 3.細胞遺伝学的アッセイ<ol><li> 中期で細胞を停止させる治療 <ol><li>そうコルセミドを温めますリューション30分間37℃の水浴中で（10 / mlの）。汚染の危険性を最小限に抑えるために安全キャビネットの下に70％アルコールで蓋を拭きます</li><li>完全に無菌的にメディアを取り出し、2ミリリットル予め温めておいたPBSで2回培養容器を洗います。 </li><li>予め温めておいた新鮮な培地を加える（2ミリリットルメディア/ 10 6細胞）を培養容器中のコルセミド溶液（5μL/ ml）を含む、2時間インキュベートします。 </li></ol></li><li> 細胞収穫 <ol><li> 30分間37℃に維持した水浴中に温かいトリプシン溶液とPBS。以降、このステップから、無菌状態を維持する必要はありません。 </li><li>完全にメディアを取り出し、2回2ミリリットル37°C PBSで培養容器を洗浄し、100ミリメートル皿またはT75フラスコのために予め温めておいたトリプシン溶液（通常は60ミリメートル培養皿またはT25フラスコのための2ミリリットルと4ミリリットルの必要なボリュームを追加）、および1分間37℃、バック、5％CO 2インキュベーター内で培養容器を配置します。 </li><li>ターク電子アウト培養容器を、スクレーパーを用いて細胞を剥離し、トリプシンの作用を停止するためにPBSの10ミリリットルを追加します。 </li><li>上下ピペット少なくとも10回15ミリリットルコニカル遠心管に単一細胞懸濁液と転送細胞を作るために。 </li><li>室温でのアウトスイング遠心機で5分間、400×gで遠心分離細胞懸濁液。 </li><li>上清を取り除き、穏やかなタッピングによって細胞ペレットを破る、PBSの10ミリリットルを追加し、再び5分間遠心します。 </li></ol></li><li> 低張処理および固定 <ol><li>少なくとも30分間、37℃の水浴中でプレ暖かい0.075 M塩化カリウム溶液。 </li><li>細胞ペレットを乱すことなく上清を除去し、PBSの約0.5ミリリットルを残します。 </li><li>静かに細胞ペレットを破壊し、P200のピペットを用いて、単一細胞懸濁液を作ります。 </li><li>穏やかに振盪しながら降下により予熱した塩化カリウム溶液ドロップの4ミリリットルを追加します。 </li><li>低張Pで細胞をインキュベート20分間37℃の水浴中otassium塩化物溶液。 </li><li> 1パート氷酢酸で3部品のメタノールを加えて、新鮮なacetomethanol液を作ります。室温で、この新たに調製した固定液を保管してください。 </li><li>低張処理した後、チューブに固定液の等量の（4 ml）を加え、穏やかにチューブを反転させて溶液を混合。 </li><li>室温で5分間、400×gで遠心分離し、上清を除去します。この段階の細胞ペレットのサイズが大きくなる時に、白っぽいより見えるようになります。 </li><li>上清を除去し、4ミリリットルに新鮮な固定液を追加し、室温で30分間保ちます。 </li><li> 5分間、400×gで遠心分離し、上清を除去し、4ミリリットルの固定液でさらに2回の洗浄を与えます。 </li></ol></li><li> クリーニングと中期スプレッドの準備をスライドさせ <ol><li> 30分間、10％の液体洗剤中に完全にスライドガラスを浸漬します。 </li><li> 30分間冷たいランニング水道水で十分にスライドを洗浄します。 </li><li>凛SEは完全に、界面活性剤を除去蒸留水に浸し、そして将来の使用のために冷蔵庫に保存するために蒸留水で3回スライドさせます。 注：使用が広がると中期の品質を増大させるの均一性を容易にする前に、スライドを清掃。 </li><li>チルド濡れたスライド上の10μlの細胞懸濁液をドロップし、それを室温で一晩乾燥を放送することを可能にします。 </li></ol></li><li> 染色および取り付け <ol><li> PBSの一部でギムザ染色液の一部を混合して50ミリリットルギムザ染色液を調製し、コプリンジャーに注ぎます。 </li><li> 20分間染色液でスライドを浸し。 </li><li>過剰な汚れを除去し、すぐにヘアドライヤーを使用してスライドを乾燥させるために、蒸留水でスライドを洗浄します。 </li><li>室温で一晩スライドを残します。 </li><li>媒体はゆっくりとスライド上に拡散することを可能にする、そっとマウンティング培地にカバースリップを置き、スライド上の封入剤の一滴を適用し、削除ペーパータオルで余分な培地。マウントされたスライドが前に移動、またはカバースリップの動きを回避するために、顕微鏡下での表示に少なくとも1時間乾燥することができます。 注意：このステップの間に気泡を形成することなく、慎重にカバースリップを配置することが重要です。気泡を除去するために過剰な熱の使用は推奨されません。 </li></ol></li><li> 顕微鏡観察および収差の種類 <ol><li>中期は良質の明視野顕微鏡を用いて100倍の倍率で広がるの構造のCAを調べます。 </li><li>少なくとも50〜100中期はCAの多数を誘導治療のために、各治療群スプレッドスコア。小さい効果サイズの場合、最大300の中期スプレッドの分析をお勧めします。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

細胞遺伝学的研究や数字や、主に中期スプレッド中の染色体の構造の顕微鏡分析は、様々な疾患の予後、リスク評価、および治療のための重要な情報を提供しています。現在では、細胞遺伝学的異常は、癌を含むいくつかの疾患の進行と開発にリンクされていることを十分に確立されています。現在までに、CAは、すべての主要な腫瘍タイプで発見されています。細胞遺伝学的改変16の様々なタイプを誘導することができる主要な外部危険因子の1 - CAは、自然に、またはそのような電離放射線（IR）のいずれかと外部または内部刺激によって生じる可能性があります。吸収された放射線量の評価でのCA助剤の分析（細胞遺伝学的、放射線生物学的線量推定と呼ばれます）。また、周波数及び特定の収差の種類の分析は、放射線の品質を決定する重要な情報は、17、18を吸収されています。細胞遺伝学的研究は、iの直接的な画像を提供しますDNA上の損傷剤のMPACT。これは、コメットアッセイなどの間接的な技術とは対照的です。しかし、細胞遺伝学的研究は、部分的には、多数のハンズオン関与のステップで、放射線の外分野での下で、利用されてきました。 <p class...

主に、心肺疾患および肺癌1から、粒子状物質（PM）への曝露は、毎年300万人を超える過剰な死亡を引き起こすと推定されています。 PMへの曝露のレベルの増加に伴う肺癌リスクの増加が2が示されているように、実際に、PMは、国際がん研究機関（グループ1）によってヒトに発癌性として認識されました。興味深いことに、ほとんどすべての癌細胞は、数値および/または構造的染色体異常を保有します。粒状有機炭素は、その組成およびサイズ分布の排出量だけでなく、物理的、化学的変換に依存するバリアント、複雑で、不均一な混合物、です。これは、35-55（サイズのPM 2.5ミクロンと小さい）都市PM 2.5質量％と農村部と大陸背景PM 2.5質量3、4の60％以上から占めます。水溶性画分は、有機エアロゾル30〜90％を占めます。有機化合物の多数脂肪族炭化水素、多環芳香族炭化水素、ならびにそれらの酸素化及びニトロ化誘導体、脂肪族アルデヒドおよびアルコール、遊離脂肪酸およびその塩、ジ - カルボン酸、多官能性化合物、タンパク質、及びフミン状高分子（HULIS）の使用を含む、同定されています質量分析技術5-8と結合されたクロマトグラフィー法。これらの化合物は、このように有機炭素の大部分は9未知である、粒子状有機炭素未満の10〜20％を表します。 実験的証拠は、細胞毒性、酸化ストレス、および炎症はPM-関連する病理学的状態の発症に関与していることを示唆しています。それが最近示されたが、PMへの暴露はまた、 インビトロ系および 10-12ヒト被験体の両方の実験において、反復エレメントのDNAメチル化の変化を含む、エピジェネティックな変化の数になります。特に興味深いの効果がありますメジャーとマイナーの衛星 - - の染色体のセントロメアの周りのヘテロクロマチン領域に見出されているサテライトDNA上のPM。それは暴露12の後、少なくとも72時間を検出することができるようにこれらの効果は、本質的に永続的であり得ることが示されました。特にセントロメアの周りのDNAメチル化の変化は、衛星DNAのmRNA転写物の蓄積をもたらす細胞分裂の際に染色体の完全性を損なうことと、その後、病理学的状態13の様々な開発につながることがあります。 PMによって引き起こされるエピジェネティックな変化の終点としてCAの分析のための細胞遺伝学的アプローチの適用は、このように、非常に重要です。ここでは、マウスマクロファージRAW264.7モデルシステムを使用して、CAのインビトロでの曝露と分析で 、周囲のPM収集と準備のためのアプローチを報告しています。マクロファージは、吸入異物に対する防御の最初の行を含み、したがって、トンその細胞株を確立し、粒子毒物11、12、14、15の中で最も頻繁に使用されるモデルとして役立ちます。

<table><tbody><tr><td>全懸濁微粒子サンプラー</td><td>Tisch Environmental</td><td>TE-5170</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III NMR spectrometer&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 3.5/pl2 software</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ACD/NMR Processor Academic Edition</td><td>ACD/Labs</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 マウスマクロファージ</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>高グルコース DMEM GlutaMAX 培地</td><td>ThermoFisher</td><td>10569010</td><td>37°C で温まる;Cウォーターバス使用前の</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャー</td><td>16000044</td><td>37°Cで温めます。使用前のCウォーターバス</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140163</td><td>37°Cで温めます。使用前のCウォーターバス</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA(0.25%)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>25200056</td><td>37°Cで温かく;Cウォーターバス使用前</td></tr><tr><td>PBS、pH 7.4</td><td>ThermoFisher</td><td>10010049</td><td>37°Cで温めます。PBS</td></tr><tr><td>サーモフィッシャー</td><td>のKaryoMAXコルセミド溶液</td>を使用する前にCウォーターバス<td>15212012</td><td>37°Cで温めます。使用前のCウォーターバス</td></tr><tr><td>KaryoMAX塩化カリウム溶液</td><td>ThermoFisher</td><td>10575090</td><td>37°Cで温めます。Cウォーターバス使用前</td></tr>メタ<tr><td>ノール(HPLC)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A452N1-19</td><td></td></tr><tr><td>酢酸、氷河</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1185-500</td><td></td></tr>デ<tr><td>コントラッド70液体洗剤</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック04-355-1</td><td></td><td></td></tr>ライト<tr><td>およびライトギムサ染色液</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>23-200733</td>パー<td></td></tr><tr><td>マウントメディウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>アクシオイメージャー2</td>ツァ<td>イス</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

使用周囲粒子状物質によって誘発される染色体異常の解析<em&gt;インビトロ</em&gt;システム

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

粒子状物質（PM）への曝露は、核の遺伝物質を含む様々な細胞成分を損傷する恐れがあり、主要な世界的健康問題です。核遺伝的整合性にPMの影響を評価するために、構造的染色体異常は、マウスRAW264.7マクロファージ細胞の分裂中期スプレッドで採点されます。 PMは、大量の全浮遊粒子サンプラと周囲空気から収集されます。捕集された材料は、水溶性、微細な部分を保持するように可溶化し、濾過します。粒子は、核磁気共鳴（NMR）分光法による化学組成を特徴としています。粒子懸濁液の異なる濃度は、未処理対照細胞と一緒に、72時間の総露光時間のRAW264.7マウスマクロファージのインビトロ培養物に添加されます。露光の終了時に、培養は中期で細胞を停止させるコルセミドで処理されます。次いで、細胞を採取し、acetomethanolで固定低張液、Dで処理されていますガラススライド上ropped、最後にギムザ溶液で染色しました。スライドを明視野顕微鏡を用いて1,000倍の倍率で中期スプレッド構造的染色体異常（CAS）内を評価するために調べられます。 50〜100の中期スプレッドは、各処置群について採点します。この技術は、このような染色分型改、染色分型の交換、非中心フラグメント、二動原体とリング染色体、ダブル分、核内倍加、およびPMへの曝露後のin vitroでのロバートソン転座などの構造的染色体異常（CAS）の検出のために適合されています。エピジェネティックな変化に十分に確立された細胞遺伝学的エンドポイントを関連付けるために強力な方法です。

細心の注意は、TSPサンプラーの場所だけでなく、収集が行われる年の時間を選択する際に注意すべきです。化学組成並びに粒子のサイズは、実質的に結果に影響を与え得ます。収集した材料は、白色フィルタに対して表示されるはずです。正常マウスの中期スプレッドは40無動原染色体を持つことになります。技術の目標は、対対照処理細胞における染色体異常の割合の変化（またはその欠如）を実証することです。その変更は、次に（異常な染色体の数）の資格（異常の種類）を定量することができます。 正常マウスの分裂中期スプレッドは40無動原染色体（ 図3A）を持つことになります。 図3に示すように、粒子状物質を用いた治療は、このような染色分の休憩（3B）、無動原体断片（のように、さまざまなCAを誘導します<strオング&gt; 3C）、環状染色体（3D）、二...

このプロトコルは、周囲の空気の粒子状物質で処理した後、RAW264.7マウスマクロファージにおけるin vitroで染色体異常の定量および特徴付けのための手法について説明します。

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

本実験の全体的な目的は、環境空気から抽出した粒子状物質に細胞を曝露させたことで誘発される染色体損傷を検出することです。この手法は、粒子状物質の分野における重要な問いの一つである「粒子状物質への曝露は染色体損傷を誘発するか」という点に対する答えを得るのに役立ちます。本手法の主な利点は、遺伝物質に誘発された損傷を直接可視化できることです。テキストのプロトコルに従って粒子を回収および分析した後、培養開始前に、完全増殖培地、0.25% trypsin、およびPBSを37 °Cのウォーターバスで少なくとも30分間加温し、粒子曝露を行います。未処理のRAW 264.7細胞を洗浄した後、温めたtrypsin溶液1 mLをディッシュに加え、スクレイピングによって組織培養容器の底から細胞を剥離させます。その後、細胞を回収し、ピペッティングを繰り返して単一細胞懸濁液を作成します。トリパンブルーを用いて細胞数をカウントし、あらかじめ温めておいた完全培地を使用して、100 mm組織培養ディッシュに 8000/cm² の密度で播種します。次に、完全培地を用いて液量を 10 mL に調整し、最終濃度を 50,000 cells/mL にします。細胞を 37 °C、5% CO2 下で 24 時間インキュベートし、細胞を接着させます。バイオセーフティキャビネット内で、滅菌PBSを用いて、5 $\mu\text{g}/\text{mL}$の処理用量には0.5 $\text{mg}/\text{mL}$の濃度に、50 $\mu\text{g}/\text{mL}$の処理用量には5 $\text{mg}/\text{mL}$の濃度にフィルター済み粒子を希釈します。粒子状物質で細胞を処理する前に、培養細胞を10倍の倍率の顕微鏡で観察し、細胞の増殖、形態、培養状態、および汚染を確認してください。この段階で、細胞のコンフルエンシーは少なくとも30%である必要があります。滅菌ピペットを使用して、培地を無菌的に吸引し、37 °CのPBS 2 mLを用いて培養容器を2回洗浄します。あらかじめ決定した用量の粒子状物質を新鮮な培地とともに添加し、同時並行で実施する遺伝毒性およびエピジェネティック毒性解析の曝露条件に合わせて、37 °C、5% CO2で培養します。細胞を中期で停止させるため、細胞を洗浄した後、5 µL/mLのコルセミド溶液を含むあらかじめ加温した培地 2 mLを培養液に加え、37 °C、5% CO2で2時間インキュベートします。インキュベーション後、培地を完全に除去し、温めたPBSを用いて細胞を2回洗浄します。次に、トリプシン溶液を加え、37 °Cで1分間インキュベートします。セルスクレーパーを用いて細胞を剥離させ、10 mLのPBSを加えてトリプシンを不活化させます。次に、ピペットで細胞を10回以上吸い上げ、単一細胞懸濁液を作成し、細胞を15 milliliterのコニカル遠心チューブに移します。チューブをスイングローター遠心機にセットし、細胞懸濁液を400 times g、室温で5分間遠心分離します。低張処理を行うため、細胞ペレットを乱さないようにチューブから上清を除去し、PBSを約0.5 milliliters残します。細胞ペレットを静かにほぐし、P200ピペットを用いて単一細胞懸濁液を作成します。次に、あらかじめ温めておいた塩化カリウム溶液4 mLを、緩やかに振盪しながら滴下して加えます。この細胞懸濁液を37 °Cのウォーターバスで20分間インキュベートします。低張処理の後、チューブに等量の固定液を加えて細胞を固定し、チューブを反転させて穏やかに混ぜ合わせます。室温で400 ×gにて5分間遠心分離し、上清を除去します。この段階で、細胞ペレットのサイズが大きくなり、白色を帯びて視認しやすくなります。上澄みを除去します。4 mLの新鮮な固定液を加え、チューブを室温で30分間インキュベートします。その後、チューブを遠心分離して上澄みを除去し、4 mLの固定液を用いて細胞をさらに2回洗浄します。ガラススライドを10%液体洗剤に30分間完全に浸します。その後、冷たい流水で30分間十分にすすぎます。蒸留水を用いてスライドを3回すすぎ、洗剤を完全に除去します。その後、蒸留水に浸し、スライドを冷蔵庫で一晩保存します。冷却したウェットスライドに細胞懸濁液を10 µL滴下し、室温で一晩乾燥させます。サンプルの染色および封入を行うため、ギムザ染色液とPBSを1:1の割合で混合して50 mLのギムザ染色溶液を調製し、コプリンジャーに注ぎます。スライドを染色液に20分間浸し、その後、蒸留水で洗浄して過剰な染色剤を除去し、すぐにヘアドライヤーでスライドを乾燥させます。スライドを室温で一晩放置します。翌朝、スライドに封入剤を1滴滴下します。カバーグラスをそっと上に載せ、封入剤がスライド全体にゆっくりと広がるようにします。次に、ペーパータオルを使用して余分な封入剤を取り除きます。最後に、明視野顕微鏡を用い、100倍の倍率で中期展開における染色体の構造異常を観察します。この画像は、正常なマウスの中期分散では40本の中心体を持つ染色体が見られることを示しています。粒子状物質による処理は、姉妹染色分体断裂、無中心断片、環状染色体、二中心染色体、ダブルミニッツ、ロバートソン転座、およびエンドリデュプリケーション（内倍数化）などの様々な染色体異常を誘発します。この手順を行う際は、増殖細胞のみを使用する必要があることに注意してください。本手順に続いて、M-FISHやSKYなどの他の手法を用いて、さらに詳細な解析を行うことができます。例えば、染色体間での安定的な転座などの異常が存在するかどうかを確認できます。本手順を実施する際は、注意点や発がん性物質に留意し、手袋の着用などの予防措置を常に講じてください。

analysis-ambient-particulate-matter-induced-chromosomal-aberrations

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

アフリカツメガエルの卵抽出物は、DNA損傷チェックポイントを調査するために有用なモデル系である。このプロトコルは、...

用いたDNA損傷チェックポイントの研究<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;卵抽出

このビデオは、ゼブラフィッシュの胚の心臓におけるPM2.5による酸化的損傷を検出するための高感度免疫蛍光法に基づくアッセイを、DNA損傷と二本鎖DNA切断を示す8-OHdGとγH2AXのレベルを測定する方法を示しています。...

魚の胚におけるPM2.5媒介性DNA損傷を検出するための免疫蛍光アッセイ

染色体は、例えば、リンパ球または皮膚線維芽細胞等の生細胞から、ヒトまたはマウスを含む生物から単離することができる。これらの染色体調製物は、さらに、ルーチンG-バンディングなどsituハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光 、比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）、スペクトル核型分析（SKY）のような分子細胞遺伝学手順のために利用することができる。...

培養細胞からの染色体の準備

DNA修復経路は、ゲノムの完全性の維持および変異および癌を予防するために必須である。このプロトコルの目的は、中期の染色体異常の直接観察によりゲノム不安定性を定量化することであるテロメアDNA反復のためのin situハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光を使用して、マウスのB細胞から広がる。...

PNA-FISHによるマウスのBリンパ球における染色体異常の迅速分析

生殖細胞毒性を評価するために使用された線虫Caenorhabditis...

線虫を用いて生殖化学毒性を総合的に評価<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

マウス脾臓リンパ球への慢性的なin vivo低線量照射によって誘発される可能性のあるDNA損傷レベルとDNA修復能力の変化を評価するためのプロトコルが、フローサイトメトリーを使用してDNA二本鎖切断のマーカーであるリン酸化ヒストンH2AXを測定することによって提示されます。...

慢性後のマウス脾細胞におけるDNA損傷と修復の測定<em&gt;インビボ</em&gt;β-およびγ-放射線の非常に低い用量への暴露

現在のプロトコルは、全身照射への曝露後のマウスの骨髄細胞における染色体間安定異常の同定における多重蛍光in situハイブリダイゼーション(mFISH)およびスペクトル核型分析(SKY)の有用性を説明しています。...

複数の蛍光によるインター染色体安定型異常の検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（mFISH）と照射されたマウスにおけるスペクトル核型分析（SKY）

インビトロマイクロ核アッセイは、ゲノ毒性および細胞毒性を評価するための確立された方法ですが、手動顕微鏡検査を使用してアッセイを採点することは面倒であり、主観性とスコアラー間の変動に苦しんでいます。本論文では、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いてアッセイの完全自動化バージョンを実行するために開発されたプロトコルについて述べた。...

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いてインビトロ微小核アッセイを行う自動化方法

ここでは、病変の高感度かつ正確な定量のための方法 8-オキソ-7, 8-ジヒドロ-2'-デオキシグアノシン (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-デオキシアデノシン (1,n6-茶道) および 1,n2-etheno-2'-デオキシグアノシン (1,N2-dGuo) DNA で.この方法は、曝露された A/J マウスの組織 (肺、肝臓および腎臓) における周囲微細粒子状物質 (PM2.5)...

質量分析による3つの DNA 病変の定量化と、周囲の微細粒子状物質に曝露したマウスの組織におけるそのレベルの評価

この手順は、急性または長期の反復用量レジーム上のナノ物質暴露に関連する遺伝子毒性有害性のより生理学的に関連する評価を提供することができるインビトロで高度な3D肝培養物を開発するために使用されるように確立された。...

長期ナノ材料暴露後のインビトロ遺伝子毒性試験のための高度な3D肝モデル

私たちは、ゼブラフィッシュ胚における16種類のPAHの内部レベルを評価するために、修正されたQuEChERS-HPLC法を開発しました。...

微小粒子状物質に曝露されたゼブラフィッシュ胚中の多環芳香族炭化水素を検出するための修正QuEChERS-HPLC法

学ぶ周囲粒子状物質による染色体異常の検出法。RAW264.7マウスマクロファージを用いて、大気中粒子状物質曝露による遺伝物質損傷を直接可視化し、環境汚染物質の遺伝毒性を評価する。

使用周囲粒子状物質によって誘発される染色体異常の解析

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