植物の細胞や細胞小器官の壁を越え遺伝子やタンパク質を輸送するために、ペプチド由来方法

このペプチド由来の手法の全体的な目的は、植物における細胞およびオルガネラの障壁を越えて遺伝子とタンパク質を輸送することです。この手法は、特定の遺伝子の発現を媒介するためにさまざまな遺伝子やタンパク質を届ける、合理的に設計されたペプチド複合体を用いて植物を改変することで、重要な疑問への回答を得るのに役立ちます。この技術の直接的な利点は、細胞やオルガネラの境界を越えることができるペプチドに基づいた、植物の葉に対する簡便なシリンジ介在法によるトランスフェクション手順を採用していることです。

従来の植物形質転換法はコストが高く、一部の植物種に適用できず、細胞内オルガネラを標的にすることができないため、私たちはこの簡便で効果的な新しい植物形質転換法を開発しました。Jo-Ann Churchが、私の研究室の技術者である堀井陽子と共に、その手順を実演します。テキストプロトコルに従って、ペプチドプラズマDNA製剤を準備してください。

ペプチドを血漿DNAに添加すると、溶液が白濁します。テキストプロトコルで指定された最終量まで超純水で希釈すると、混合液は透明になります。希釈液 800 µL を、動的光散乱分析用のキュベットに分注します。

ZetaNanosizerを用いて、形成された複合体の水力学的直径および多分散指数を測定します。波長633 nmのヘリウムネオンレーザーを使用し、温度25 °C、後方散乱検出角173°で測定を行います。サイズ測定後、溶液を折り畳み型キャピラリーセルに移し、25 °Cにおける水の誘電率、屈折率、および粘度のデフォルトパラメータを用いてゼータ電位を測定します。

原子間力顕微鏡で複合体溶液を観察するには、マイカシートの剥離したばかりの新鮮な表面に10 µLを滴下し、蓋付きのプラスチック製ペトリ皿に入れて一晩空気乾燥させます。ばね定数1.3 N/mのシリコンカンチレバーを用い、タッピングモードにて25 °Cの空気中で複合体の画像を取得します。16時間明期、8時間暗期のサイクルで22 °Cで栽培した、生後3週間のArabidopsis thalianaを使用します。

遺伝子発現の定量化において3連（トリプリケート）として使用するため、トランスフェクション用に少なくとも3枚の葉を選択します。葉1枚のトランスフェクションに使用する複合溶液100 µLを、1 mLの針なしプラスチック製シリンジに充填します。次に、シリンジの先端を葉の背軸面に当てます。

シリンジのチップを葉に軽く押し当て、反対側からラテックス手袋を着用した手の人差し指で対抗圧をかけながら、シリンジのプランジャーをゆっくりと押し下げます。浸潤が成功すると、葉に水浸状の領域が広がるのが観察されます。識別しやすいように、浸潤させた葉にラベルを貼ってください。

ペプチドプラズマDNAを導入した植物を、グロースチャンバー内で12時間インキュベートします。導入効率を評価するために、まず導入した葉全体を切り出します。Renilla Luciferaseレポーターベクターを用いた導入実験では、Renilla Luciferaseアッセイキットを使用して導入効率を定量的に測定します。

まず、切り出した各葉を1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに入れます。チューブあたり100 microlitersの1X Lysis Bufferを添加します。同様の方法で、非導入コントロール葉のライセートを3サンプルずつ準備します。

ホモジナイザーのペッスルを用いて葉をすり潰し、得られた溶解液を25 °Cで6〜10時間インキュベートします。インキュベーション後、マイクロセントリフュージで溶解液を12,470 ×gで1分間遠心分離します。清澄化した溶解液20 µLを96ウェルマイクロプレートのウェルに移します。

残りの容量を、メーカーのプロトコルに従ってBCAタンパク質定量キットを用いて全タンパク質濃度の定量に使用します。次に、1× Renilla Luciferase アッセイ基質を100 µLウェルに加え、ゆっくりとピペッティングして混ぜ合わせます。マイクロプレートをマルチモードマイクロプレートリーダーにセットし、測定を開始します。

緑色蛍光タンパク質リポーターベクターを用いたトランスフェクション実験では、共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して蛍光を観察します。まず、気泡の除去を容易にするため、葉全体の端を切り取ります。次に、10 milileter シリンジからプランジャーを取り外し、切り出した各葉または葉の断片をシリンジに入れます。

プランジャーを戻し、葉を潰さないように注意しながら、ゆっくりとシリンジの底まで押し下げます。シリンジの約半分まで水を引き込みます。シリンジを上に向けてプランジャーを押し、チップから空気を抜きます。

次に、シリンジの先端を塞ぎ、プランジャーをゆっくりと下に引いて葉の中の空気を排出します。葉が半透明に見えるまで、この操作を数回繰り返します。続いて、顕微鏡スライドの表面を粘着テープで覆います。

ブレードを用いて、葉のサンプルを収めるのに十分な大きさの正方形をテープ上に切り出し、ピンセットでその正方形のテープを剥がして検体チャンバーを作成します。このテープは、スライドガラスとカバーガラスの間のスペーサーとして機能します。葉を背面が上を向くようにチャンバー内に配置し、チャンバーの残りの領域を水で満たします。

ガラスカバーのスリップで葉をチャンバー内に密封し、カバーのスリップの端を粘着テープで固定します。共焦点レーザー走査顕微鏡を用い、40倍対物レンズまたは63倍水浸対物レンズで葉の試料を観察します。GFP蛍光は、励起波長488 nanometersで可視化できます。

ペプチド対DNA比が0.5のペプチドプラズマDNA製剤の最適な調製では、平均粒子径が約290 nmであり、均一なサイズ分布を示す低分散度指数（PDI）が約0.3である必要があります。さらに、複合体は-30 mV程度のゼータ電位を示すはずです。ここに、ペプチドプラズマDNA複合体の代表的な原子間力顕微鏡画像を示します。

均質な球状の複合体が観察されました。ペプチドプラズマDNA製剤を用いることで、Arabidopsis thalianaにおいてプラズマDNAの核標的デリバリーおよび発現が可能となり、Renilla Luciferaseの1ミリグラムあたりの推定値は約100,000となりました。遺伝子発現を評価するため、GFPレポーターをコードするプラズマDNAを用いて調製した複合体で処理した葉の顕微鏡観察を行いました。

画像により、非標的ペプチドプラスミドDNA複合体を導入した細胞において、GFP発現に対応する拡散した緑色蛍光が明確に観察され、それが細胞質に局在していることが判明しました。この技術の開発により、植物バイオテクノロジー分野の研究者が、さまざまなタンパク質および核酸ベースの貨物を生きた植物に導入することが可能になりました。このビデオを視聴し、テキストプロトコルを読むことで、プラスミドDNA、二本鎖DNAまたはRNA、およびタンパク質を含む各タイプの貨物に対して、最適化されたさまざまな処方をどのように調製し、特性評価し、適用するかについて、十分に理解できるはずです。