Name: 隣接セル受けてアポトーシス細胞死との相互作用によって生細胞に誘導されるイベントを細胞内シグナルの同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学ぶアポトーシス細胞と隣接する生細胞との物理的相互作用によって誘導される細胞内シグナルイベントの同定方法。BUNPT細胞を用いて、死細胞が隣接する生細胞に与える影響を研究する。

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この作業は、全体的または部分的に、ホセ・A・アルーダ博士とイリノイ大学シカゴ校腎臓内科からの機関資金(J. S. L.へ)と、マギル大学医学部とマギル大学保健センターの研究所からの資金提供(J.R.へ)によって支援されました。

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<li>Wallach, D., Kang, T. -B., Kovalenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concepts+of+tissue+injury+and+cell+death+in+inflammation%3A+a+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective.</a> Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).</li>
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<li>Reddy, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+of+apoptotic+cells+by+macrophages+induces+novel+signaling+events+leading+to+cytokine-independent+survival+and+inhibition+of+proliferation%3A+activation+of+Akt+and+inhibition+of+extracellular+signal-regulated+kinases+1+and+2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2.</a> J. Immunol. 169, 702-713 (2002).</li>
<li>Cvetanovic, M., Ucker, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+discrimination+of+apoptotic+cells%3A+repression+of+proinflammatory+macrophage+transcription+is+coupled+directly+to+specific+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition.</a> J. Immunol. 172, 880-889 (2004).</li>
<li>Patel, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cells%2C+at+all+stages+of+the+death+process%2C+trigger+characteristic+signaling+events+that+are+divergent+from+and+dominant+over+those+triggered+by+necrotic+cells%3A+implications+for+the+delayed+clearance+model+of+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity.</a> J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).</li>
<li>Cvetanovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+recognition+of+apoptotic+cells+reveals+a+ubiquitous+and+unconventional+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity.</a> J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).</li>
<li>Birge, R. B., Ucker, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+apoptotic+immunity%3A+the+calming+touch+of+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Innate apoptotic immunity: the calming touch of death.</a> Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).</li>
<li>Patel, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+apoptotic+cells+by+epithelial+cells%3A+conserved+versus+tissue-specific+signaling+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses.</a> J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).</li>
<li>Patel, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition-dependent+signaling+events+in+response+to+apoptotic+targets+inhibit+epithelial+cell+viability+by+multiple+mechanisms%3A+implications+for+non-immune+tissue+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis.</a> J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).</li>
<li>Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppressive+effects+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunosuppressive effects of apoptotic cells.</a> Nature. 390, 350-351 (1997).</li>
<li>Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+that+have+ingested+apoptotic+cells+in+vitro+inhibit+proinflammatory+cytokine+production+through+autocrine%2F+paracrine+mechanisms+involving+TGF-%CE%B2%2C+PGE2%2C+and+PAF%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Investig%22%5BJournal%5D)">Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF.</a> J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).</li>
<li>Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cells+and+innate+immune+stimuli+combine+to+regulate+macrophage+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion.</a> J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).</li>
<li>Ariel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+neutrophils+and+T+cells+sequester+chemokines+during+immune+response+resolution+through+modulation+of+CCR5+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression.</a> Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).</li>
<li>Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvin+E1+and+protectin+D1+activate+inflammation-resolution+programmes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes.</a> Nature. 447, 869-874 (2007).</li>
<li>Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAM+receptors+are+pleiotropic+inhibitors+of+the+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response.</a> Cell. 131, 1124-1136 (2007).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cells+can+activate+the+%22phoenix+rising%22+pathway+to+promote+wound+healing+and+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cells can activate the "phoenix rising" pathway to promote wound healing and tissue regeneration.</a> Sci. Signal. 3, ra13(2010).</li>
<li>Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dangerous+attraction%3A+phagocyte+recruitment+and+danger+signals+of+apoptotic+and+necrotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells.</a> Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).</li>
<li>Patel, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cells+activate+AMPK+and+inhibit+epithelial+cell+growth+without+change+in+intracellular+energy+stores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores.</a> J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).</li>
<li>Hess, K. L., Tudor, K. -S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cook-Mills+J.M.+Human+and+murine+high+endothelial+venule+cells+phagocytose+apoptotic+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes.</a> Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).</li>
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<li>Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dangerous+attraction%3A+phagocyte+recruitment+and+danger+signals+of+apoptotic+and+necrotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells.</a> Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).</li>
<li>Sinha, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium+activates+the+Wnt+and+phosphatidylinositol+3-kinase+Akt+signaling+pathways+to+promote+cell+survival+in+the+absence+of+soluble+survival+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).</li>
<li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).</li>
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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ここでは、アポトーシスまたは細胞死の他の形態を経ている細胞への曝露後の生存細胞に誘導される細胞内シグナル伝達事象を特徴づけるためのプロトコルを提供します。プロトコルは、アポトーシス細胞の曝露は、生存応答細胞内の細胞内シグナル伝達経路を調節することが可能な複数の機構を強調しています。これらのメカニズムは、次のとおりです。対話を（死んだ細胞またはその小屋の小胞および微小胞の分子または表面決定をブリッジを経由して、多くの場合、アポトーシス小体と呼ばれる）応答細胞上の特定の受容体と; （偶数またはその細胞外世代27）可溶性メディエーターの放出;そして、貪食機械の締結。実質的な食作用が発生する状況下では、考慮すべき追加的なメカニズムは、アポトーシス細胞またはその小胞21内に濃縮されたようなマイクロRNAなどのメディエーター、の配信です。 Oと比較して、私たちのプロトコルの重要性、THERの方法論は、アポトーシス細胞が応答する細胞内シグナル伝達を調節することができることにより、複数のメカニズムのその慎重な解剖です。主な利点は、必要な技術の大部分は簡単で、細胞培養に標準装備されていることです。 <p...

アポトーシス、または規制された細胞死1は 、組織の維持・発展に不可欠な方法で貢献しています。最も単純に見ると、アポトーシスが損傷し、高齢者許可、または過剰な細胞が組織2,3の周囲に害を及ぼすことなく排除されます。組織ホメオスタシスに対するアポトーシスの寄与は、しかしながら、かなり動的で変化します。アポトーシスによる死細胞は、複数の新たな活動を取得し、両方の分泌され、細胞関連、隣接する生きた細胞4-10の機能に影響を与えるために、それらを可能にします。以前の研究は、炎症11-16を抑制するために、アポトーシス細胞の能力に焦点を当てたが、アポトーシス細胞はまた、生存4,9,10、増殖4,9,10、分化17、などの重要な活動を含む細胞機能の広い範囲を調節しますマイグレーション18、および成長19。また、これらの効果は、マクロファージのような専門の食細胞に限定されるものではありませんsの、そのような上皮および内皮細胞7,9,10,18-21として伝統的に非食細胞を含む、実質的にすべての細胞型および系統、にまで及びます。 アポトーシス細胞への曝露後に隣接する生きた細胞の特異的な応答は、生存応答細胞およびアポトーシス細胞自体の両方に関連する複数の要因に依存します。アポトーシス細胞への曝露は、マウスマクロファージおよび腎臓の近位尿細管上皮細胞（PTECs）の両方の増殖を阻害するが、例えば、これら2つの細胞型は、アポトーシス細胞4,6,9,10に対する生存応答に劇的に異なります。アポトーシス細胞は、マクロファージの生存を促進するが、PTECs 4,6,9,10のアポトーシス死を誘導します。特に、アポトーシス細胞に対する応答は、乳房上皮対 例えば 、腎臓PTECs（起源10の応答細胞の器官に応じて、同じであっても系統の応答細胞の間で異なる場合があります細胞）または活性化22の状態（ 例えば 、好中球）。逆に、アポトーシス細胞は、アポトーシス10,23またはアポトーシス10,14のステージを刺激の性質に依存して全く同じセル内の異なる応答を誘発することができます。 アポトーシス細胞に対する応答の多様性と複雑さを考えると、細心の注意は、任意の特定の結果の責任シグナル伝達事象および経路を解剖に注意しなければなりません。まず、生存可能とアポトーシス細胞との間の直接的な物理的相互作用を必要とする回答は、アポトーシス細胞3,6-10によって放出されたか、生成された可溶性メディエーターによって誘発されるものと区別されなければなりません。物理的な相互作用が必要な場合は、さらなる分化が行われるべきです。シグナル伝達事象は、アポトーシス細胞に特異的に結合する特異的受容体とは無関係に、その後の飲み込みの独立したアポトーシス細胞の受容体媒介認識、上、または貪食取り込みに依存してもよいです<html> 3-7,9,10,19。後者の場合、応答は、アポトーシス細胞に特異的ではなく、任意の食作用物質4,6によってトリガすることができます。 これらの区別の重要性は、再びマクロファージおよび腎臓PTECsの応答を対比することによって理解することができます。両方の細胞型のために、アポトーシス細胞への暴露は、プロ生存キナーゼAktの活性を変化させます。 0.4μmのポリカーボネート膜により応答とアポトーシス細胞の分離が応答4,9,10,19を廃止するので変調は、物理的な相互作用に依存しています。マクロファージの応答は貪食4,9,10,19によって駆動されるのに対し、しかし、PTECsの応答は、受容体媒介および食作用とは無関係です。この結論は、ラテックスビーズ、中性食作用の刺激への曝露は、PTECsにおけるAkt活性に影響を及ぼさないという事実が、模倣マクロファージ4,9におけるアポトーシス細胞の効果によって強化されます。 &quot;&gt;あまり研究が、壊死により死細胞、または偶発的な細胞死1、また3-10,19近くの生細胞の機能を調節する。アポトーシス細胞と同様に、壊死細胞は、様々なメカニズム、特に漏れを介してその効果を発揮しますその破裂し、細胞膜3,5,6,9,24を介して細胞内のコンテンツの。PTECsおよびマクロファージを含む多くの細胞は、壊死5,9により死細胞のための明確な非競合受容体を有する。これらの受容体の婚約があるシグナリング事象を誘発しますアポトーシス細胞は、リン酸化9,10,19を減少させる一方、アポトーシス細胞の受容体4-10,19の係合によって誘発されたものとしばしば反対。例えば、PTECsに、壊死細胞は、Aktのリン酸化を増加させます。 ここでは、隣接するアポトーシスPTECsの受容体媒介性の認識によって実行可能な腎臓PTECsに誘導される細胞内シグナル伝達事象を識別するためのプロトコルを記述します<sup&gt; 9,10,19。プロトコルはBU.MPT細胞9,10,19,25,26のように知られている条件付きで不死化PTECの細胞株に特異的であるが、それは容易に原点非上皮および/または以外の臓器に由来する細胞系に適合されています腎臓。重要なことには、細胞刺激などのアポトーシス細胞の使用は、可溶性リガンドと共に存在しない特定の固有の実験的な困難をもたらします。これらの中で最も重要なのは、アポトーシス細胞を懸濁液としてではなく、溶液として添加されなければならないということです。これらの問題だけでなく、それらを最小化または回避するための戦略は、プロトコル内で議論されています。ほとんどのプロトコルに記載された技術のすべては、簡単で、細胞培養の標準です。このプロトコルの利点は、アポトーシス細胞が応答して細胞内のシグナル伝達を調節することにより、複数のメカニズムに注目です。これらのメカニズムは、表面決定を経由して結合または再上の特定の受容体に架橋分子が含まsponding細胞、可溶性メディエーターの放出、および/または食作用機械の締結。壊死細胞は、結果は、細胞死のモードではなく、死細胞に一般的な応答に特異的であることを保証するために、すべての実験に含まれています。このプロトコルで推奨されているように慎重なアプローチは、死にかけている細胞は、健康と病気の両方で、彼らのライブの隣人に及ぼす拡大を続ける影響の理解に重要です。

<table><tbody><tr><td>細胞培養材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM、1x with [4.5 g/L] グルコース、&#671;-グルタミン & ピルビン酸ナトリウム</td><td>Mediatech (バージニア州マナサス)</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Fetal Clone II, 胎児ウシ血清</td><td>GE Healthcare (ユタ州ローガン)</td><td>SH30066.03</td> 培地 A ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン<td>に 10% (v/v)&nbsp; を加え</td></tr><tr><td>ます。100x</td><td>Life Technologies (Grand Island, NY)</td><td>10378-016</td><td>培地 A および B</td></tr><tr><td>&γ;-インターフェロン、マウス組換え体、Escherichia coli</td><td>Calbiochem、Millipore (Billerica, MA)</td>から <td>10 単位/mL を添加</td>し<td>407303</td>培地 A</tr><tr><td>Falcon ポリスチレン組織培養処理皿、非発熱性</td><td>Corning (ノースカロライナ州ダーラム)</td><td>353003</td><td>滅菌済み、 直径 100 mm</td></tr><tr><td>のファルコン ポリスチレン遠心チューブ、円錐底</td><td>コーニング (ノースカロライナ州ダーラム)</td><td>352095</td><td>滅菌済み、15 mL</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA、0.05%、Gibco</td><td>Fisher (マサチューセッツ州ウォルサム)</td><td>25300062</td><td>滅菌済み、100 mL</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ</td><td>コメント</td></tr><tr><td>化学物質および阻害剤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>スタウロスポリン、Streptomyces spから。</td><td>シグマ(ミズーリ州セントルイス)</td><td>S4400</td>は<td>[1&mu;アポトーシスを誘導するために3時間g/mL]</td></tr>上<tr><td>皮成長因子(EGF)、[1 mg / mL]</td><td>ミリポア(ビレリカ、マサチューセッツ州)</td><td>EA140</td>を<td>50 nMで使用してレスポンダー細胞を刺激する</td></tr><tr><td>UltraPure、0.5 M EDTA、pH 8.0</td><td>Life Technologies(グランドアイランド、ニューヨーク)</td><td>15575-038</td><td>5 mMを使用して付着細胞を剥離します</td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液、0.4%</td><td>MP Biomedicals(カリフォルニア州サンタアナ)</td><td>91691049</td><td>死細胞</td></tr><tr><td>染色用パラホルムアルデヒド溶液、DPBS</td><td>Affymetrix (カリフォルニア州サンタクララ)</td><td>19943</td> 細胞<td>固定に 1x DPBS で 0.4% (v/v) を使用</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)、1x、Gibco</td><td>Life Technologies (ニューヨーク州グランドアイランド)</td><td>14040133</td><td>原液</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)、Ca2+- および Mg2+-フリー、 1x、Gibco</td><td>Life Technologies(ニューヨーク州グランドアイランド)</td><td>14190367</td><td>ストック溶液</td></tr><tr><td>サイトカラシンD、4 mMのジメチルスルホキシド(DMSO)、Zygosporium mansonii</td><td>Sigma(ミズーリ州セントルイス)</td><td>C8273</td>を<td>[4 &mu;食作用を阻害する</td></tr>ジ<tr><td>メチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Sigma(ミズーリ州セントルイス)</td><td>D2650</td><td>サイトカラシン用溶媒 D</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>細胞溶解緩衝液 ingredients</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-buffered saline (TBS), 10x, pH 7.4</td><td>BioRad (Hercules, CA)</td><td>1706435</td><td>細胞溶解緩衝液用</td></tr>ピ<tr><td>ロリン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich (ミズーリ州セントルイス)</td><td>221368</td><td>10 mM 細胞溶解バッファー用</td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich (ミズーリ州セントルイス)</td><td>D6750</td><td>0.5% w/v 細胞溶解バッファー用</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich (ミズーリ州セントルイス)</td><td>L3771&nbsp;</td><td>0.1% w/v 細胞溶解バッファー用</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich (ミズーリ州セントルイス)</td> <td>G5516</td><td>10% 細胞溶解バッファー用</td></tr> フ<tr><td>ッ化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich (ミズーリ州セントルイス)</td><td>450022</td><td>25 mM 細胞溶解バッファー用</td></tr><tr><td>完全ミニ EDTA フリープロテアーゼ阻害剤カクテル錠</td><td>Roche Diagnostics (インディアナポリス州インディアナポリス)</td><td>4693159001</td><td>細胞溶解バッファー用</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich (セントルイス、MO)</td><td>T8787</td><td>10% 細胞溶解バッファー用</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>MP Biomedicals (Santa Ana, CA)</td><td>11DTT00005</td><td>1 mM 細胞溶解バッファー</td></tr>用 <tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>MP Biomedicals (Santa Ana, CA)</td><td>4800263</td><td>1 mM for cell lysis</td></tr> buffer オル<tr><td>ソバンデートナトリウム</td><td>MP Biomedicals (Santa Ana, CA)</td><td>2159664</td><td>10 mM 細胞溶解バッファー用</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall T6000B遠心分離機</td><td>デュポン(ウィルミントン、DE)</td><td>T6000B</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーティッシュマット、ウォーターバス</td><td>フィッシャー(ウォルサム、マサチューセッツ州)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator (sonicator)、モデル 100</td><td>Fisher (Waltham, MA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miscellaneous</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell counting chamber、Neubauer</td><td>Hawksley (Lancing, Sussex, UK)</td><td>AC2000</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II</td><td>Millipore (Billerica, MA)</td><td>CBA059</td><td>for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis</td></tr><tr><td>Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 mL</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 透過性担体, 0.4 &mu;mポリカーボネート膜</td><td>コーニング(コーニング、ニューヨーク)</td><td>3413</td><td>無菌、ポリスチレン、組織培養治療<</td></tr><tr><td>strong>名前</td><td>Company</td><td>Catalog</td><td>Comments</td></tr><tr><td>strong<>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸化グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3&α;/&beta;(GSK-3&alpha;/&beta;)(Ser21/9)、ポリクローナル抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9331</td><td>rabbit polyclonal antibody</td></tr><tr><td>Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) )</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2118</td><td>rabbit monoclonal antibody</td></tr></tbody></table>

隣接セル受けてアポトーシス細胞死との相互作用によって生細胞に誘導されるイベントを細胞内シグナルの同定

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

アポトーシスによって死細胞は、隣接する生細胞の機能に影響を与えることを可能に複数の新たな活動を取得し、調整された細胞死と呼ばれます。このような生存、増殖、成長、および分化などの生命活動は、アポトーシス細胞によって変調された多くの細胞機能の一つです。認識し、アポトーシス細胞に応答する能力にかかわらず、発信の系統または器官の、すべてのセルの普遍的な特徴であるように思われます。しかし、細心の注意が任意の特定の結果の責任シグナル伝達事象および経路を解剖に取られるアポトーシス細胞の義務に対する応答の多様性と複雑さ。特に、1はアポトーシス細胞を含む、実行可能な応答細胞内の細胞内シグナル伝達経路に影響を与えることが可能な複数のメカニズムを区別する必要がありますの受容体媒介アポトーシス細胞の認識、アポトーシス細胞による可溶性メディエーターの放出、および/または婚約をphagocytic機械。ここでは、アポトーシス細胞への曝露後の生存可能な応答細胞に誘導される細胞内シグナル伝達事象を識別するためのプロトコルを提供します。プロトコルの主な利点は、アポトーシス細胞が応答する細胞内シグナル伝達事象を調節するメカニズムの解剖に支払う注意にあります。プロトコルは、条件付きで不死化したマウスの腎臓近位尿細管細胞株（BU.MPT細胞）に特異的であるが、それは容易に原点非上皮細胞および/または腎臓以外の臓器に由来する細胞系に適合されます。刺激として死んだ細胞の使用は、細胞内シグナル伝達事象の検出を妨げることができますいくつかのユニークな要素を紹介します。これらの問題だけでなく、それらを最小化または回避するための戦略は、プロトコル内で議論されています。このプロトコルの適用は健康にし、diseaの両方で、死亡または瀕死の細胞は、それらのライブの隣人に及ぼす幅広い影響の私達の拡大の知識を支援する必要がありSE。

図1では、我々はタイミングおよびアポトーシス細胞（プロトコル1）および壊死細胞（プロトコル2）の製造およびアポトーシスと壊死細胞（プロトコル4）の懸濁液と応答細胞の刺激に関与する重要なステップを示す概略図を提供します。 図2において、我々は、セリン-スレオニンキナーゼグリコーゲンシンターゼキナーゼ-3（GSK-3）、GSK-3αおよびGSK-3βの二つのアイソフォームのリン酸化に対するアポトーシス細胞の効果を示す代表的な結果をもたらします。 GSK-3α/βは、細胞の増殖および生存の調節において重要な役割、ならびにグルコース代謝におけるその重要な役割を担っています。セリン9におけるセリン21及びGSK-3βにおいてGSK-3αのリン酸化は、キナーゼ活性を阻害し、次いで、リン酸化およびβカテニンの増加した安定性の減少につながります。 βカテニンそれは、細胞増殖を刺激し、アポトーシスを...

ここでは、隣接する死細胞または死にかけている細胞との物理的相互作用によって生存細胞に誘発される細胞内シグナル伝達イベントを決定するためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、死細胞の食作用取り込みまたは可溶性メディエーターの放出とは対照的に、死細胞の受容体媒介認識によって誘発されるシグナル伝達イベントに焦点を当てています。

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

この手順の全体的な目標は、近くの死細胞との物理的相互作用に続いて、誘導された生存可能なレスポンダー細胞をシグナル伝達イベントを特定することです。この方法は、細胞生物学、病理学、生理学の分野における重要な疑問(死んだ細胞や死にかけている細胞が生きている細胞に及ぼす影響など)に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、簡単で安価であること、そしてアポトーシスを受けている隣接細胞との相互作用に続いて生細胞に誘導される生物学的効果の研究に適用できることです。この技術を実演するのは、私の研究室の技術者であるLanfei Fengです。この手順を開始するには、BUNPT細胞を100mm真空ガスプラズマ処理組織培養皿に通した後、培養培地Aで培養液Aをコンフルエントし、5%二酸化炭素雰囲気を37°Cで加湿して増殖させます。その後、接着細胞単層を培地Bで3回すすぎ、非選択的プロテインキナーゼ阻害剤であるスタウロスポリンを含む培地Bで細胞をインキュベートし、アポトーシスを誘導します。37°Cで3時間。3時間後、単層から分離した浮遊アポトーシス細胞を含む培地を回収します。その後、この培地を500倍Gで10分間遠心分離し、その後、上清を廃棄し、ペレットを培地Bで3回洗浄してから、接着細胞に戻します。この洗浄ステップの後、1X カルシウムおよびマグネシウムを含まないDPBSに5ミリモルEDTAを添加して、残りの接着細胞を剥離します。剥離したアポトーシス細胞を含む培地を採取し、剥離した細胞と浮遊アポトーシス細胞を無菌の15ミリリットルポリスチレン遠心チューブに入れます。次に、500 x Gで10分間遠心分離することにより、アポトーシス細胞を3回洗浄し、その後、10ミリリットルの1XカルシウムおよびマグネシウムフリーDPBSを洗浄ごとに再懸濁します。最後の洗浄後、アポトーシス細胞を新鮮な培養液Bに5x10^6細胞/ミリリットルで懸濁してから、レスポンダー細胞を刺激するために使用します。あるいは、洗浄したアポトーシス細胞を0.4パラホルムアルデヒドの1X DPBSに30分間固定し、培養培地Bで3回洗浄し、レスポンダー細胞を刺激するために使用する前に、1ミリリットルあたり5x10^6細胞で懸濁します。BUNPT細胞を直径100mmの滅菌ポリスチレン真空ガスプラズマ処理組織培養皿に継代した後、許容条件下で5%二酸化炭素雰囲気を合流させ、加湿します。次に、1回のすすぎにつき10 mLの培地Bで接着性細胞単層を3回すすぎます。続いて、1X カルシウムおよびマグネシウムフリーのDPBSに5 mM EDTAを添加して細胞を剥離します。分離した細胞をEDTA含有培地から収集し、細胞懸濁液を滅菌済みの15mLポリスチレン遠心チューブに加えます。次に、細胞を500倍Gで10分間遠心分離して3回洗浄し、1回の洗浄につき10mLのカルシウムおよびマグネシウムフリーのDPBSに再懸濁します。最後の洗浄後、細胞を新鮮な培地Bに5x10^6細胞/ミリリットルで懸濁します。これに続いて、細胞を水浴中で摂氏70度に45分間加熱し、この細胞懸濁液を10分ごとに穏やかにボルテックスすることにより壊死を誘発します。壊死の誘導後、37°Cの加湿5%二酸化炭素雰囲気で細胞を2時間インキュベートし、細胞懸濁液を15分ごとに穏やかにボルテックスします。この手順では、許容条件下で無菌の100 mm組織培養皿でBUNPT細胞を増殖させ、約85%のコンフルエントを達成するまで培養します。その後、培地Aを吸引し、すすぎごとに10 mLの培地Bで細胞を3回すすぎます。次いで、血清は、非許容条件下で加湿された5%二酸化炭素雰囲気中で、培養培地B中の細胞を18〜24時間飢餓状態にし、静止を誘導する。コンフルエントBUNPT細胞の別の組織培養皿を標識し、次の手順の6つの実験条件について使用します。次に、静止状態のBUNPTレスポンダー細胞の標識済み皿から培地Bを吸引します。異なる条件で100ミリメートル皿を調製するには、細胞を含まない培養培地Bのいずれかの2 mL、アポトーシス細胞懸濁液を5X10^6細胞/ミリリットルの培養培地B、または壊死細胞懸濁液を5X10^6細胞/mLの培養培地Bで1対1の死細胞比を達成します。10X10^6個の細胞を含むconfluent 100ミリメートル皿。皿をそっと回します。次に、加湿された5%二酸化炭素の雰囲気で摂氏37度でそれらをインキュベートします。30分後、培養皿の事前標識に従って、ビヒクルまたは15 nMOL EGFのいずれかでレスポンダー細胞を刺激します。加湿された5%二酸化炭素雰囲気下で、細胞を摂氏37度で15分間インキュベートします。その後、氷冷したDPBSを5mm加えて死細胞を洗い流します。皿を回し、洗浄液を吸引します。洗濯を3回繰り返します。その後、レスポンダー細胞の皿をすぐに氷の上に置いて、さらに処理します。この図は、静止状態のBUNPTレスポンダーをアポトーシス細胞に30分間ばく露すると、GSK3αβの基礎リン酸化が強く阻害されたことを示しています。BUNPTレスポンダーとアポトーシス細胞との間の物理的相互作用を防ぐために、BUNPTレスポンダーは透過性支持システムで増殖し、0.4ミクロンのポリカーボネート膜によってアポトーシスターゲットから分離されました。BUNPTレスポンダーとアポトーシス細胞との間の物理的相互作用の防止は、アポトーシス標的がGSK3αβのリン酸化を阻害する能力を消滅させた。食作用の役割を評価するために、細胞骨格阻害剤であるサイトカラシンDを使用して、死細胞の食作用取り込みを防止しました。アポトーシス細胞に応答したGSK3αβのリン酸化の阻害は、食作用がない場合に起こりました。この手法を習得すると、適切に実施されれば、ゲル電気泳動とイムノブロッティングに必要な時間を除いて、4〜6時間で完了できます。この手順を試みる際には、刺激として可溶性リガンドとは対照的に細胞懸濁液を使用することは、いくつかの固有の、そしてほとんど避けられない実験的障害をもたらすことを覚えておくことが重要です。同じ手順を使用して、生存、増殖、細胞増殖などの他の細胞機能を研究し、近くの死細胞との相互作用に続いて生きた応答細胞で誘導されるシグナル伝達イベントの機能的影響を判断できます。このビデオを見れば、生存細胞が近くの死細胞と物理的に相互作用した後、生存細胞で誘導される特定のシグナル伝達イベントを特定する方法について十分に理解できるはずです。

identification-intracellular-signaling-events-induced-viable-cells

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

Source: Berens, C. et al. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the use of immunoblotting to assess apoptosis inhibition by the bacterial effector protein CaeB in human cells. It outlines the steps for detecting apoptotic markers following doxycycline-induced expression of pro-apoptotic proteins in host cells expressing the effector.

Immunoblot Analysis of Apoptosis Inhibition in Host Cells Expressing an Antiapoptotic Bacterial Protein

アナスタシスという用語は、死にかけている細胞が細胞の自殺プロセスを後期段階で逆転させ、自分自身を修復し、最終的に生き残る現象を指します。ここでは、アナスタシスを受ける細胞を検出および追跡するためのプロトコルを示します。...

トラッキングアナスタシス、アポトーシスを逆に細胞生存現象のための戦略

ここで述べられている方法は、抗アポトーシス細菌のエフェクタータンパク質の活性を解剖するために、定義されたステップでアポトーシスシグナル伝達カスケードを誘導するために使用されます。この方法は、アポトーシス促進性または毒性タンパク質の誘導性発現、または他のシグナル伝達経路との干渉の解剖にも使用できます。...

誘導発現系を適用すると、細胞内シグナル伝達と細菌の病原性因子の干渉を研究するために、

アナスタシスは、細胞死のプロセスを逆転させた細胞は通常の健康な細胞と形態学的区別することができますので、生体内で検出する技術的に困難です。ここでの検出と追跡システムを使用して、新たに開発した生体内でCaspaseTracker バイオ センサー...

アナスタシスはIn Vivo CaspaseTracker バイオ センサーによる検出

Efferocytosis、アポトーシス細胞の貪食除去は恒常性を維持するために必要な受容体と認識、キャニスター、アポトーシス細胞の内面化を可能にするシグナル伝達経路によって促進されます。ここで、efferocytosis の定量化と efferocytic シグナル伝達経路の活性の蛍光顕微鏡のプロトコルを提案する.

単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

検出、定量化およびアポトーシス サンプルから高純度にアポトーシス小体を分離する流れの cytometry...

高純度にアポトーシス小体の検出と分離

ここで前の活性化 cd8 陽性の細胞毒性を調査するプロトコルについて述べるリアルタイム顕微鏡を介してアポトーシスがん細胞を検出することにより癌細胞に対して細胞の+ T。このプロトコルは、骨髄細胞による T 細胞抑制の背後にあるメカニズムを調査し、免疫抑制の骨髄系細胞の封鎖を介してT...

CD8 による培養腫瘍細胞のアポトーシスのリアルタイム検出+ T 細胞腫瘍浸潤骨髄細胞の免疫抑制機能を勉強するには

ここでは、アポトーシス胸腺細胞および腹膜マクロファージを調製するためのプロトコールを提示し、efferocytosis...

マクロファージに貪食アポトーシス胸腺細胞の実験的解析

アポトーシスは、初期および後期のアポトーシスバイオマーカーのフローサイトメトリー分析によって特徴付けることができます。子宮頸がん細胞株SiHaを、卓上フローサイトメーターを用いてアクチノマイシンDで処理した後のアポトーシスバイオマーカーについて分析した。...

アクチノマイシンD処理SiHa子宮頸癌細胞におけるアポトーシスバイオマーカーのフローサイトメトリー解析

OCT4、SOX2、KLF4とMYCのレトロウイルス媒介性異所性発現を介してヒトの人工多能性幹細胞（性IPSC）を生成する方法が記載されている。...

GFPをレトロウイルスベクターを用いた誘導多能性幹細胞（性IPSC）にヒト体細胞を再プログラミングする

学ぶアポトーシス細胞と隣接する生細胞との物理的相互作用によって誘導される細胞内シグナルイベントの同定方法。BUNPT細胞を用いて、死細胞が隣接する生細胞に与える影響を研究する。

隣接セル受けてアポトーシス細胞死との相互作用によって生細胞に誘導されるイベントを細胞内シグナルの同定

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