隣接セル受けてアポトーシス細胞死との相互作用によって生細胞に誘導されるイベントを細胞内シグナルの同定
2016年12月27日
ここでは、隣接する死細胞または死にかけている細胞との物理的相互作用によって生存細胞に誘発される細胞内シグナル伝達イベントを決定するためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、死細胞の食作用取り込みまたは可溶性メディエーターの放出とは対照的に、死細胞の受容体媒介認識によって誘発されるシグナル伝達イベントに焦点を当てています。
この手順の全体的な目標は、近くの死細胞との物理的相互作用に続いて、誘導された生存可能なレスポンダー細胞をシグナル伝達イベントを特定することです。この方法は、細胞生物学、病理学、生理学の分野における重要な疑問(死んだ細胞や死にかけている細胞が生きている細胞に及ぼす影響など)に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、簡単で安価であること、そしてアポトーシスを受けている隣接細胞との相互作用に続いて生細胞に誘導される生物学的効果の研究に適用できることです。
この技術を実演するのは、私の研究室の技術者であるLanfei Fengです。この手順を開始するには、BUNPT細胞を100mm真空ガスプラズマ処理組織培養皿に通した後、培養培地Aで培養液Aをコンフルエントし、5%二酸化炭素雰囲気を37°Cで加湿して増殖させます。その後、接着細胞単層を培地Bで3回すすぎ、非選択的プロテインキナーゼ阻害剤であるスタウロスポリンを含む培地Bで細胞をインキュベートし、アポトーシスを誘導します。37°Cで3時間。
3時間後、単層から分離した浮遊アポトーシス細胞を含む培地を回収します。その後、この培地を500倍Gで10分間遠心分離し、その後、上清を廃棄し、ペレットを培地Bで3回洗浄してから、接着細胞に戻します。この洗浄ステップの後、1X カルシウムおよびマグネシウムを含まないDPBSに5ミリモルEDTAを添加して、残りの接着細胞を剥離します。
剥離したアポトーシス細胞を含む培地を採取し、剥離した細胞と浮遊アポトーシス細胞を無菌の15ミリリットルポリスチレン遠心チューブに入れます。次に、500 x Gで10分間遠心分離することにより、アポトーシス細胞を3回洗浄し、その後、10ミリリットルの1XカルシウムおよびマグネシウムフリーDPBSを洗浄ごとに再懸濁します。最後の洗浄後、アポトーシス細胞を新鮮な培養液Bに5x10^6細胞/ミリリットルで懸濁してから、レスポンダー細胞を刺激するために使用します。
あるいは、洗浄したアポトーシス細胞を0.4パラホルムアルデヒドの1X DPBSに30分間固定し、培養培地Bで3回洗浄し、レスポンダー細胞を刺激するために使用する前に、1ミリリットルあたり5x10^6細胞で懸濁します。BUNPT細胞を直径100mmの滅菌ポリスチレン真空ガスプラズマ処理組織培養皿に継代した後、許容条件下で5%二酸化炭素雰囲気を合流させ、加湿します。次に、1回のすすぎにつき10 mLの培地Bで接着性細胞単層を3回すすぎます。
続いて、1X カルシウムおよびマグネシウムフリーのDPBSに5 mM EDTAを添加して細胞を剥離します。分離した細胞をEDTA含有培地から収集し、細胞懸濁液を滅菌済みの15mLポリスチレン遠心チューブに加えます。次に、細胞を500倍Gで10分間遠心分離して3回洗浄し、1回の洗浄につき10mLのカルシウムおよびマグネシウムフリーのDPBSに再懸濁します。
最後の洗浄後、細胞を新鮮な培地Bに5x10^6細胞/ミリリットルで懸濁します。これに続いて、細胞を水浴中で摂氏70度に45分間加熱し、この細胞懸濁液を10分ごとに穏やかにボルテックスすることにより壊死を誘発します。壊死の誘導後、37°Cの加湿5%二酸化炭素雰囲気で細胞を2時間インキュベートし、細胞懸濁液を15分ごとに穏やかにボルテックスします。
この手順では、許容条件下で無菌の100 mm組織培養皿でBUNPT細胞を増殖させ、約85%のコンフルエントを達成するまで培養します。その後、培地Aを吸引し、すすぎごとに10 mLの培地Bで細胞を3回すすぎます。次いで、血清は、非許容条件下で加湿された5%二酸化炭素雰囲気中で、培養培地B中の細胞を18〜24時間飢餓状態にし、静止を誘導する。
コンフルエントBUNPT細胞の別の組織培養皿を標識し、次の手順の6つの実験条件について使用します。次に、静止状態のBUNPTレスポンダー細胞の標識済み皿から培地Bを吸引します。異なる条件で100ミリメートル皿を調製するには、細胞を含まない培養培地Bのいずれかの2 mL、アポトーシス細胞懸濁液を5X10^6細胞/ミリリットルの培養培地B、または壊死細胞懸濁液を5X10^6細胞/mLの培養培地Bで1対1の死細胞比を達成します。10X10^6個の細胞を含むconfluent 100ミリメートル皿。
皿をそっと回します。次に、加湿された5%二酸化炭素の雰囲気で摂氏37度でそれらをインキュベートします。30分後、培養皿の事前標識に従って、ビヒクルまたは15 nMOL EGFのいずれかでレスポンダー細胞を刺激します。
加湿された5%二酸化炭素雰囲気下で、細胞を摂氏37度で15分間インキュベートします。その後、氷冷したDPBSを5mm加えて死細胞を洗い流します。皿を回し、洗浄液を吸引します。
洗濯を3回繰り返します。その後、レスポンダー細胞の皿をすぐに氷の上に置いて、さらに処理します。この図は、静止状態のBUNPTレスポンダーをアポトーシス細胞に30分間ばく露すると、GSK3αβの基礎リン酸化が強く阻害されたことを示しています。
BUNPTレスポンダーとアポトーシス細胞との間の物理的相互作用を防ぐために、BUNPTレスポンダーは透過性支持システムで増殖し、0.4ミクロンのポリカーボネート膜によってアポトーシスターゲットから分離されました。BUNPTレスポンダーとアポトーシス細胞との間の物理的相互作用の防止は、アポトーシス標的がGSK3αβのリン酸化を阻害する能力を消滅させた。食作用の役割を評価するために、細胞骨格阻害剤であるサイトカラシンDを使用して、死細胞の食作用取り込みを防止しました。
アポトーシス細胞に応答したGSK3αβのリン酸化の阻害は、食作用がない場合に起こりました。この手法を習得すると、適切に実施されれば、ゲル電気泳動とイムノブロッティングに必要な時間を除いて、4〜6時間で完了できます。この手順を試みる際には、刺激として可溶性リガンドとは対照的に細胞懸濁液を使用することは、いくつかの固有の、そしてほとんど避けられない実験的障害をもたらすことを覚えておくことが重要です。
同じ手順を使用して、生存、増殖、細胞増殖などの他の細胞機能を研究し、近くの死細胞との相互作用に続いて生きた応答細胞で誘導されるシグナル伝達イベントの機能的影響を判断できます。このビデオを見れば、生存細胞が近くの死細胞と物理的に相互作用した後、生存細胞で誘導される特定のシグナル伝達イベントを特定する方法について十分に理解できるはずです。
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概要
このプロトコルは、隣接する死んだ細胞または死にゆく細胞との物理的相互作用によって誘導される、生存可能な細胞内のシグナリングイベントの決定を概説しています。これは、細胞呑作用よりも受容体を介した認識を強調します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 細胞生物学
- 病理学
- 生理学
背景
- 死んだ細胞が生存可能な隣接する細胞に与える影響を理解することは重要です。
- この方法は簡単で費用対効果が高いです。
- アポトーシス細胞との相互作用後の生存可能な細胞における生物学的効果を研究するのに適用できます。
- ランフェイ・フォンによって実験室技術者によって実証されました。
研究の目的
- 生存可能な応答細胞におけるシグナリングイベントを特定すること。
- 死んだ細胞または死にゆく細胞が生存可能な細胞に与える影響を探ること。
- 細胞相互作用を研究するためのプロトコルを提供すること。
使用された方法
- 真空ガスプラズマ処理済みの皿でBUNPT細胞を培養します。
- 培地Aで細胞を培養してコンフルエンスを達成させます。
- 付着した細胞モノレイヤーを培地Bで洗浄します。
- 培地Bでストロスペリンを使用してアポトーシスを誘導します。
主な結果
- シグナリングイベントを効果的に測定できます。
- 生存可能な細胞と死んだ細胞の間の物理的相互作用は重要です。
- このプロトコルは再現可能で信頼できます。
- アポトーシスに対する細胞応答に関する洞察が得られます。
結論
- この技術は細胞シグナリングに関する貴重な洞察を提供します。
- 様々な生物学的文脈における細胞相互作用の理解を深めます。
- この方法は関連分野の研究者にとってアクセス可能です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding how apoptotic cells modulate signaling in viable neighbors informs target validation by revealing context-dependent pathway modulation. This protocol enables mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses by distinguishing receptor-mediated, soluble mediator, and phagocytosis-dependent signaling mechanisms. Insights support predictive confidence in early discovery by clarifying how cell death influences functional outcomes in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by identifying intracellular signaling events induced in responder cells via apoptotic cell interaction.
- Operational Value: Enables dissection of mechanism (receptor-mediated, soluble release, phagocytosis) to clarify pathway-specific effects.
- Predictive Value: Supports target validation by determining whether observed phenotypes depend on direct contact or soluble factors from apoptotic cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for assessing compound effects on apoptosis-induced signaling in live cells.
- Operational Value: Standardizes co-culture conditions with defined apoptotic:responder ratios and wash steps to ensure reproducibility.
- Scalability: Uses inexpensive, straightforward techniques adaptable to multi-well formats for screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase signaling observations to disease-relevant systems where apoptotic cell clearance influences tissue homeostasis.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes phagocytosis-dependent vs. independent signaling to avoid misattribution of drug effects in preclinical models.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing whether target modulation requires viable cell interaction with dying neighbors.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within early discovery to assess how microenvironmental cues from apoptotic cells influence target engagement and pathway modulation prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating variables (e.g., phagocytosis inhibition) to determine mechanism of apoptotic cell signaling.
- Screening: Enables assay readiness through standardized preparation of apoptotic cells and serum-starved responders for consistent stimulus delivery.
- Analytics: Facilitates quantitative measurement of phosphorylation states (e.g., GSK3 alpha/beta) as dependent variables to compare signaling conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical relevance by modeling how apoptotic cell burden in tissues may alter drug response in viable cells.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable platform for studying necrotic vs. apoptotic cell effects across cell lines and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through mechanistic dissection of apoptotic cell signaling pathways.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined cell ratios, wash steps, and controls for phagocytosis and physical separation.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by identifying whether drug effects require intact apoptotic cell interaction or are mediated by soluble factors.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization by distinguishing contact-dependent vs. soluble mediator mechanisms in pathway modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, apoptosis induction, and sterile handling of cell suspensions.
- Needs centrifugation equipment, vacuum gas plasma-treated dishes, and reagents for apoptosis (staurosporine) and necrosis induction.
- Demands standardization across teams for apoptotic cell preparation, washing, and quantification to ensure consistent stimulus activity.
- Involves adaptation considerations when transferring to non-epithelial or non-kidney-derived cell lines, though protocol notes ease of adaptation.
- Includes practical limitations such as variability in apoptotic cell yield and challenges in detecting signaling amid cellular debris, mitigated by multiple washes and controls.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:49
Preparation of Apoptotic BU.MPT Cells
3:03
Preparation of Necrotic BU.MPT Cells
4:39
Preparation of BU.MPT Responder Cells
5:27
Stimulation of Responder Cells with Apoptotic and Necrotic Cells
7:03
Results: Inhibition of Phosphorylation of GSK3α/β in BU.MPT Responder Cells Following Exposure to Apoptotic Cells Requires Direct Cell-cell Interaction but Is Independent of Phagocytosis
8:08
Conclusion
