2.13: 1D薄層クロマトグラフィーの実施

1. TLCプレート

1. TLCの一般的な吸着剤は、シリカゲル、アルミナ、セルロースです。TLCプレートは、さまざまな特性を備えた市販されています。TLCプレートを選択し、適切なサイズにカットします(ほとんどの用途では約5cm×5cmで十分です)。ガラス張りのTLCプレートの場合は、定規とガラスカッターを使用してガラスに切り込みを入れ、線に沿って慎重に割ります。

2. スポッティング

1. サンプルを適切な溶媒に溶解して、約1%の溶液を作ります。可能であれば、溶媒は非極性である必要があります。カラムクロマトグラフィー画分およびその他の希釈溶液は、溶質が0.2%〜2.0%の濃度で存在する場合、希釈せずに使用できます。
2. プレートの底から約1.0cmのところに鉛筆でベースラインに印を付けます。プレートの端から少なくとも1.0cmのところにスポットを配置し、適切にラベルを付けます。
3. スポットは、ガラスキャピラリーを使用して適用できます。TLCプレートを見つけるには、キャピラリーを溶液に浸して少量の液体を吸い込みます。先端をTLCプレートの目的の場所にそっと触れ、すぐに取り外します。
4. あるいは、マイクロリットルのシリンジで、各アプリケーションに対して約1μLの溶液を送達してスポットを塗布します。
5. スポットは、スポッターで吸着剤の表面を乱さないように注意しながら、各場所に連続して塗布することができます。アプリケーションの合間に溶剤を乾燥させます。

3. 現像溶剤の選択

1. 良好な分離のためには、可能な限り極性の低い溶媒を使用することが望ましいです。TLCの一般的な溶媒には、ヘキサン、酢酸エチル、ジクロロメタン、メタノールなどがあります(表1)。
2. 適切な移動相を見つける便利な方法は、サンプルを含むTLCプレートを見つけることです。十分な量の溶媒をスポットに直接塗布して、直径1〜2cmの溶媒の円を形成します。円の円周をマークします。視覚化すると、適切な溶媒は十分に分離されたリングを示し、最も外側のリングは中心から溶媒前面までの距離の約50%になります。
3. 移動相の極性を調整するには、2種類の混和性溶媒を選択し、それらをさまざまな比率で試験する必要があります。一般的な混合物の例としては、ヘキサンと酢酸エチル、ジクロロメタンとメタノールなどがあります。

4. 開発

1. スポットTLCプレートを、適切な現像溶媒を含む現像チャンバーに入れます。溶媒ラインは、TLCプレートにマークされたベースラインより下にある必要があります。
2. 現像室は、蓋付きの瓶、またはアルミホイルまたはプラスチックフィルムで覆われたビーカーであり得る。TLCプレートを収容できる最小の容器を使用してください。
3. 溶剤がプレートの上端に到達しないようにしてください。溶剤の前面(吸着剤の濡れた部分が終わる境界)がプレートの上部から5〜10 mmのところにある場合、TLCプレートを現像チャンバーから取り外し、溶剤が乾く前に溶剤の前面に鉛筆で印を付けます。

5. 視覚化

1. 色付きの斑点はすぐに視覚化され、鉛筆でマークすることができます。多くの場合、スポットは見えないため、他の方法で視覚化する必要があります。
2. 多くの場合、TLC吸着剤には蛍光インジケーターが含まれています。スポットは、ハンドヘルド紫外線(UV)ランプを使用して視覚化できます。蛍光を消光する化合物は、プレートに短波長(254nm)の紫外線を照射するとダークスポットとして現れます。蛍光化合物は、適切な波長の紫外線を照射すると明るいスポットを生成します。各スポットの中央を鉛筆でマークします。
3. スポットは、視覚化試薬または染色剤をTLCプレートに塗布することによっても視覚化できます。可視化試薬は、プレートを試薬に浸すことによって、または非腐食性試薬で飽和させた綿球でプレートを拭くことによって適用することができる。
4. エタノール中のホスホモリブデン酸の20%溶液は、ほとんどの有機化合物の可視化に役立ちます。スポットは、ヒートガンまたはオーブンでプレートを加熱すると現れます。
5. 他の試薬は、特定のクラスの化合物の可視化に使用できます。例えば、ニンヒドリン試薬はアミノ酸の可視化に使用され、2,4-ジニトロフェニルヒドラジンはアルデヒドとケトンに使用されます。

6. 分析

1. 遅延係数(R_f)は、化合物がTLCプレートを上る距離と溶媒が移動する距離の比です。これは、ベースラインからスポットの中心までの距離を測定し、その値をベースラインから溶媒前面までの距離で割ることによって決定できます。
   
2. 化合物のR_fは、その物理的特性に特徴的であり、温度、サンプルサイズ、吸着剤の厚さと活性、温度、サンプルサイズなどの要因に依存します。
3. 未知化合物が既知の化合物と同一であることを確認するには、同じTLCプレート上に標準物質を見つける必要があります。同一の物質は、同じ特性R_fを持ちます。

薄層クロマトグラフィー(TLC)は、不揮発性化合物の混合物を分離するために使用されるクロマトグラフィー法であり、有機化学で一般的に使用されています。

TLCは、ガラスまたはプラスチックで裏打ちされたプレートで実行されます。ベースラインは、ラベルとともにプレート上にマークされています。検査対象の混合物と参照化合物を適切な溶媒に溶解し、TLCプレートの下端付近に小さなスポットで塗布します。プレートは瓶に入れられ、溶剤?(移動相)は、各成分の物理的特性に基づいて混合物を分離します。

装置を多用する分離手法はTLCよりも分離能が高いにもかかわらず、TLCがオンザフライの定性分析に魅力的な手法であるのは、その速度と低コストです。このビデオでは、薄層クロマトグラフィーの調製、操作、分析について説明します。

クロマトグラフィー技術には、固定相と移動相があります。TLCでは、固定相はプレートに固定された材料の薄層で構成されています。材料はシリカゲルなどの極性物質です。移動相は、毛細管現象によって吸着剤層を上に移動する非極性液体です。移動相がプレートを上に移動すると、各スポットの成分に沿って引きずられ、その後、極性に基づいて成分が分離されます。

極性の低い化合物は、プレートに引き上げられる移動相でより多くの時間を過ごします。極性が高い化合物は固定相に引き付けられやすいため、プレートをそれほど上に移動しません。

分離は現像コンテナ内で行われます。これらは、蓋付きの瓶またはアルミホイルで覆われたビーカーです。TLCプレートを収納できる最小の容器を使用して、分離をスピードアップします。

移動相(現像中の溶媒)は、良好な分離のために可能な限り無極性である必要があります。ここに示されているのは、シリカゲルの溶離性系列であり、抽出力の増加順に一般的な移動相のリストです。

複数の移動相を同時に試験できます。清潔なプレートの上で、溶解したサンプルを少なくとも2cm離して複数回見つけます。各スポットに十分な移動相を塗布して、直径1〜2 cmの円を形成します。

移動相の移動距離をマークします。移動相が十分に極性でない場合、サンプルは初期スポットの近くに留まります。移動相が極性すぎると、すべてのサンプルが溶媒前面とともに移動します。適切な移動相では、十分に分離されたリングが示され、最も外側のリングは溶媒前面までの距離の約50%になります。

必要に応じて、2つの混和性移動相をさまざまな比率で混合して、目的の特性を得ることができます。ここでは、酢酸エチルとヘキサンの1:1の混合物は極性が高すぎましたが、1:20の混合物は適切に分離されました。

移動相を選択したら、プレートの開発を開始する準備が整いました。

手順を開始するには、市販のTLCプレートを希望のサイズにカットします。プレートにガラスの裏地がある場合は、ガラスカッターで切り込みを入れ、線に沿って慎重に割ります。

鉛筆で、プレートの底から約1cmのところにベースラインをマークします。線に沿ってサンプルが見つかる位置をマークします。スポットが端から少なくとも1 cm離れ、3 mm離れていることを確認してください。適切にラベルを付けます。

固体サンプルは、適切な溶媒に溶解する必要があります。一般的な溶媒には、ヘキサン、酢酸エチル、またはジクロロメタンが含まれます。サンプルを溶解する最も極性の低い溶媒を使用してください。

サンプル/溶媒混合物をガラスキャピラリーで引き上げます。先端をTLCプレートの目的の場所にそっと触れ、すぐに取り外します。固定相を乱さないことが重要です。

スポットをできるだけ小さく保つと、分離が良くなります。より多くのサンプルが必要な場合は、各場所にスポットを連続して適用することができます。アプリケーション間で溶剤を乾燥させます。空気の流れを使用して、揮発性の低い溶剤を乾燥させることができます。

これで、TLCプレートを開発する準備が整いました。瓶の底に濾紙を置き、蒸気圧を上げます。移動相をベースラインに達しない深さに追加します。使用しないときは、溶剤の蒸気が逃げないように瓶に蓋をしてください。

斑点のあるTLCプレートを現像瓶に慎重に置きます。移動相がベースラインを下回っていることを確認してください。ソルベントフロントの進行状況をご覧ください。移動相の最先端?プレートに素早く移動するためです。

移動相がプレートの上端に到達しないように、サンプルバンドが拡散によって拡大し始めます。溶媒の前面が上部に近づいたら、現像チャンバーからプレートを取り外し、溶媒が乾く前に鉛筆で溶媒の前面に印を付けます。

化合物が着色されていない場合は、UVランプを使用してスポットを視覚化できます。この化合物は、プレートのバックグラウンド蛍光をブロックします。ランプを短波設定にし、乾板を点灯させます。鉛筆を使用して、ランプの下に見えるスポットの輪郭を描きます。鉛筆を使用して、ランプの下に見えるスポットの輪郭を描きます。

別の可能な視覚化手法は、酸化剤である過マンガン酸カリウムを使用することです。ピンセットを使用して、プレートを過マンガン酸塩の染色物に浸します。

余分な溶液を取り除き、ペーパータオルで軽くたたきます。ヒュームフード内で、ヒートガンでプレートを慎重に加熱し、スポットを視覚化します。鉛筆を使用して、現れたスポットに印を付けます。

スポットが可視化されたら、ここに示すように、対象物質を標準物質と比較することができます。この例では、未知は有機合成のビルディングブロックである1,3-ジフェニルプロピノンです。バンドを既知の標準物質と、出発物質の1つである塩化ベンゾイルと比較することで、製品を特定できます。

遅延係数(Rf)は、未知の化合物を特定するために使用されます。Rfは、化合物がTLCプレートを上る距離と移動相が移動する距離の比です。係数は、ベースラインからスポットまでの距離を測定し、ベースラインから溶媒フロントまでの距離で割ることによって決定されます。

特定の化合物のRfは、溶媒の選択、吸着剤の厚さと活性、温度、サンプルサイズなど、実験で使用される条件に依存します。これらの因子が実験間で一貫性を保つように注意する必要があります。

薄層クロマトグラフィーにはいくつかの用途があります。

この例では、コウモリの皮脂腺のトリアシルグリセリド含有量を調べました。脂質表面画分は、まずTLCプレート上で極性によって分離されました。次に、トリアシルグリセリドバンドをへらでプレートから取り除きました。シリカ粉末を溶媒と共に微量遠心チューブに移しました。遠心分離後、固定相はチューブの底部に残されましたが、化合物は溶媒に溶解したままでした。次いで、トリアシルグリセリドは、別の物理的特性によってさらに分離された。この場合、分離の2番目の次元は分子サイズでした。

TLCは、化学反応の進行を監視するためにも使用できます。この例では、反応の出発物質を標準として使用し、TLCプレート上で反応溶液と一緒に実行しました。このプロセスは、反応の過程で特定の間隔で繰り返されました。反応が進行するにつれて、出発物質のバンドは減少し、生成物のバンドは拡大しました。バンドに変化がなかったとき、またはすべての出発物質が消費されたとき、反応は完了しました。?

最後に、TLCプレートはバイオアッセイに使用できます。この例では、化合物をTLCでアカツメクサから分離しました。次に、各バンドを寒天プレート上で増殖する細菌に置きました。細菌の増殖を阻害する分子は、その抗菌特性についてさらに分析されました。

JoVEの薄層クロマトグラフィーの紹介をご覧になりました。これで、分離の基礎となる理論、実験に適した移動相の選び方、TLCプレートのセットアップと操作の方法を理解する必要があります。ご覧いただきありがとうございます!