1D薄層クロマトグラフィーの実施

1. TLCプレート

1. TLCの一般的な吸着剤は、シリカゲル、アルミナ、セルロースです。TLCプレートは、さまざまな特性を備えた市販されています。TLCプレートを選択し、適切なサイズにカットします(ほとんどの用途では約5cm×5cmで十分です)。ガラス張りのTLCプレートの場合は、定規とガラスカッターを使用してガラスに切り込みを入れ、線に沿って慎重に割ります。

2. スポッティング

1. サンプルを適切な溶媒に溶解して、約1%の溶液を作ります。可能であれば、溶媒は非極性である必要があります。カラムクロマトグラフィー画分およびその他の希釈溶液は、溶質が0.2%〜2.0%の濃度で存在する場合、希釈せずに使用できます。
2. プレートの底から約1.0cmのところに鉛筆でベースラインに印を付けます。プレートの端から少なくとも1.0cmのところにスポットを配置し、適切にラベルを付けます。
3. スポットは、ガラスキャピラリーを使用して適用できます。TLCプレートを見つけるには、キャピラリーを溶液に浸して少量の液体を吸い込みます。先端をTLCプレートの目的の場所にそっと触れ、すぐに取り外します。
4. あるいは、マイクロリットルのシリンジで、各アプリケーションに対して約1μLの溶液を送達してスポットを塗布します。
5. スポットは、スポッターで吸着剤の表面を乱さないように注意しながら、各場所に連続して塗布することができます。アプリケーションの合間に溶剤を乾燥させます。

3. 現像溶剤の選択

1. 良好な分離のためには、可能な限り極性の低い溶媒を使用することが望ましいです。TLCの一般的な溶媒には、ヘキサン、酢酸エチル、ジクロロメタン、メタノールなどがあります(表1)。
2. 適切な移動相を見つける便利な方法は、サンプルを含むTLCプレートを見つけることです。十分な量の溶媒をスポットに直接塗布して、直径1〜2cmの溶媒の円を形成します。円の円周をマークします。視覚化すると、適切な溶媒は十分に分離されたリングを示し、最も外側のリングは中心から溶媒前面までの距離の約50%になります。
3. 移動相の極性を調整するには、2種類の混和性溶媒を選択し、それらをさまざまな比率で試験する必要があります。一般的な混合物の例としては、ヘキサンと酢酸エチル、ジクロロメタンとメタノールなどがあります。

4. 開発

1. スポットTLCプレートを、適切な現像溶媒を含む現像チャンバーに入れます。溶媒ラインは、TLCプレートにマークされたベースラインより下にある必要があります。
2. 現像室は、蓋付きの瓶、またはアルミホイルまたはプラスチックフィルムで覆われたビーカーであり得る。TLCプレートを収容できる最小の容器を使用してください。
3. 溶剤がプレートの上端に到達しないようにしてください。溶剤の前面(吸着剤の濡れた部分が終わる境界)がプレートの上部から5〜10 mmのところにある場合、TLCプレートを現像チャンバーから取り外し、溶剤が乾く前に溶剤の前面に鉛筆で印を付けます。

5. 視覚化

1. 色付きの斑点はすぐに視覚化され、鉛筆でマークすることができます。多くの場合、スポットは見えないため、他の方法で視覚化する必要があります。
2. 多くの場合、TLC吸着剤には蛍光インジケーターが含まれています。スポットは、ハンドヘルド紫外線(UV)ランプを使用して視覚化できます。蛍光を消光する化合物は、プレートに短波長(254nm)の紫外線を照射するとダークスポットとして現れます。蛍光化合物は、適切な波長の紫外線を照射すると明るいスポットを生成します。各スポットの中央を鉛筆でマークします。
3. スポットは、視覚化試薬または染色剤をTLCプレートに塗布することによっても視覚化できます。可視化試薬は、プレートを試薬に浸すことによって、または非腐食性試薬で飽和させた綿球でプレートを拭くことによって適用することができる。
4. エタノール中のホスホモリブデン酸の20%溶液は、ほとんどの有機化合物の可視化に役立ちます。スポットは、ヒートガンまたはオーブンでプレートを加熱すると現れます。
5. 他の試薬は、特定のクラスの化合物の可視化に使用できます。例えば、ニンヒドリン試薬はアミノ酸の可視化に使用され、2,4-ジニトロフェニルヒドラジンはアルデヒドとケトンに使用されます。

6. 分析

1. 遅延係数(R_f)は、化合物がTLCプレートを上る距離と溶媒が移動する距離の比です。これは、ベースラインからスポットの中心までの距離を測定し、その値をベースラインから溶媒前面までの距離で割ることによって決定できます。
   
2. 化合物のR_fは、その物理的特性に特徴的であり、温度、サンプルサイズ、吸着剤の厚さと活性、温度、サンプルサイズなどの要因に依存します。
3. 未知化合物が既知の化合物と同一であることを確認するには、同じTLCプレート上に標準物質を見つける必要があります。同一の物質は、同じ特性R_fを持ちます。