がん抗原の機構理事T細胞受容体の認識を決定するためにX線結晶学、生物物理学、および機能アッセイを使用して、

この手順の全体的な目標は、生物物理学的および構造的分析に使用するのに十分な品質の可溶性リカンビンT細胞受容体およびペプチドHLAタンパク質を生成することです。この方法は、T細胞免疫学の分野における疑問に答えるのに役立つ可能性があります。例えば、なぜT細胞はがんに対して強く反応しないのでしょうか?

この技術の主な利点は、T細胞受容体がどのように標的を認識し、T細胞を介した免疫応答につながるかを説明する非常に高解像度の機構データが得られることです。この技術の意味は、T細胞がほとんどの免疫応答において極めて重要な役割を果たすため、事実上あらゆるヒト疾患の治療または診断にまで及びます。この方法は、T細胞の免疫応答に関する洞察を得ることができますが、受容体リガンド相互作用によって制御される他のシステムにも適用できます。

一般に、この方法に不慣れな個人は、生物物理学的および構造的実験に十分な品質の可溶性活性タンパク質を生成することが非常に難しいため、苦労するでしょう。10マイルメートルのジチオスレイトールを含む6ミリリットルのグアニジン緩衝液へのペプチドHLAリフォールディング手順を開始するには、30ミリグラムのHLA-A2封入体、30ミリグラムのベータ2-M封入体、および目的のペプチド4ミリグラムを添加します。混合物を摂氏37度で30分間インキュベートします。

次に、混合物を1リットルのHLAリフォールドバッファーで希釈し、摂氏4度に予冷し、その温度で3時間攪拌します。混合物を20リットルの10ミリモルトリス(pH 8.1)に対して2回、それぞれ24時間透析します。.TCRリフォールディング手順を開始するには、10ミリモルのジチオスレイトールを含む6ミリリットルのグアニジン緩衝液に、TCRアルファ鎖とベータ鎖IBをそれぞれ30ミリグラム追加します。

混合物を摂氏37度で30分間インキュベートし、予め冷却したTCRリフォールドバッファー1リットルで混合物を希釈します。希釈したTCRリフォールド混合物を、ペプチドHLA混合物と同じ方法で撹拌し、透析します。透析した両方のリフォールド混合物を0.45マイクロメートルのメンブレンフィルターでろ過します。

次に、ろ過したリフォールド調製物の1つを、pH 8.1の10ミリリットルの10ミリリットルで事前に平衡化した7.9ミリリットルの50マイクロメートル陰イオン交換樹脂カラムにロードします。塩グラジエントバッファーシステムでタンパク質を毎分5ミリリットル溶出します。1ミリリットルのフラクションを採取し、SDS-Pageでフラクションを分析します。

リフォールディングされたタンパク質を含む画分を組み合わせます。タンパク質混合物を10キロダルトンの分子量カットオフ遠心濃縮器に入れます。混合物を20分間、または必要な長さ、4000 gで遠心分離して、混合物を500マイクロリットルに濃縮します。

フロースルーを破棄します。濃縮タンパク質調製物を2ミリリットルの注入ループに成形し、適切なエラッジョンバッファーで事前に平衡化した24ミリリットルサイズの排除クロマトグラフィーカラムにタンパク質を注入します。1カラムのバッファーでタンパク質を1分間0.5ミリリットル溶出します。

1ミリリットルの画分を採取し、SDS-Pageで画分を分析し、目的のタンパク質を含む画分を組み合わせます。特定のTCRペプチドHLA相互作用がわかっている場合はKDの10倍以上から10倍以下の濃度範囲で、TCR溶液の10回の段階希釈液を調製します。それ以外の場合は、200マイクロモルのTCR濃度から開始します。

次に、100ミリモルとN-ヒドロキシスクシンイミドと400ミリモルEDCの混合物をチップ上に1対1の流量で10マイクロリットル/分、摂氏25度で流し、カルボキシメチル化デキストラン被覆センサーチップを活性化します。次に、110マイクロリットル/ミリリットルあたり200マイクログラムのストレプトアビジンと10ミリモルの酢酸pH4.5を4つのフローセルすべてにロードして、チップ表面を機能化します。100マイクロリットルの1モルエタノールアミド塩酸塩で残りの反応基を不活性化します。.

次に、チップメーカー提供のバッファーに約1マイクロモルのペプチドHLAの溶液を、応答ユニット数が500〜600増加するまで、チップの表面に毎分10マイクロリットルで流します。チップの表面を1ミリモルのビオチンと製造用バッファーで60秒間飽和させます。次に、TCR溶液の10段階希釈液を毎分30マイクロリットル、摂氏25度で注入します。

平衡結合定数を計算し、動力学解析を実行します。この方法で一連のSPR実験を行い、TCR希釈液を注入する温度のみを変化させます。各温度の平衡結合定数を決定し、ギブスエネルギーとその他の熱力学的パラメータを計算します。

非線形回帰近似を使用して、ギブス エネルギーを温度に対してプラグします。ペプチドHLA溶液を0.2ミリモルおよび結晶化緩衝液に濃縮し、10キロダルトンの分子量カットオフ遠心濃縮器で3, 000倍gで遠心分離します。共錯体結晶化のために、1対1のTCRとペプチドHLAの0.1ミリモル溶液を調製します。

結晶化ロボットとスクリーニングキットを使用して、96ウェルプレートでシッティングドロップ法を使用して結晶化試験を準備します。各リザーバーには60マイクロリットルの結晶化緩衝液があり、各滴は各200ナノリットルのタンパク質溶液と緩衝液で構成されています。クリスタルを摂氏18度で成長させます。

顕微鏡下での結晶のスコアは、24時間後、48時間後、72時間後、その後は毎週です。十分な品質の単結晶が成長したら、極低温対応ループで単結晶を採取し、結晶を液体窒素に保存します。窒素ガス100ケルビンの流下で放射光X線回折を行い、データを解析し、適切なソフトウェアで構造を解く。

解析された構造からの接触、表面の相補性、および交差角を計算します。これらの方法を用いて、TCRおよびペプチドHLA分子を発現させ、可溶性形態に再折り畳みしました。ペプチドHLA分子の中のペプチドはgp100抗原でした。

SPRを使用して、さまざまな温度での抗原に対するPMEL17 TCRの結合親和性を決定しました。次に、SPRと等温熱量滴定の両方を使用して、タンパク質間相互作用の熱力学的パラメータを決定しました。PMEL17 TCR A2-YLE-9V錯体を結晶化し、シンクロトロンX線回折で評価しました。

TCR CDRループとTCRタンパク質が接触したペプチドHLA残基の両方を同定し、接触の性質を調査しました。ペプチドの変異型を有するペプチドHLA分子も、この方法で精製および結晶化した。TCRとの結合相互作用を妨げる可能性のある構造の違いを調査すること。

第3または第5残基の変異は、プロリン4の位置を有意に変化させることがわかった。これにより、TCR CDR-3αループとの接触の多くが破壊されることになる。この手順を試行する際は、さらなる分析のために最も純度の高いタンパク質のみを選択することが重要です。この手順に続いて、可溶性タンパク質を使用してペプチドHLA四量体染色などの他の方法を実施し、患者の血液から抗原特異的T細胞を分離し、診断およびさらなる分析を行うことができます。

この技術は、その開発後、T細胞免疫学の分野の研究者がTCRペプチドHLAの結合を精緻に探求する道を開き、がんやその他のヒト疾患に対する新薬の開発を可能にしました。このビデオを見れば、生物物理学的および構造的解析を行うのに十分な品質のTCRおよびペプチドHLAタンパク質を生成する方法について十分に理解できるはずです。