Name: がん抗原の機構理事T細胞受容体の認識を決定するためにX線結晶学、生物物理学、および機能アッセイを使用して、 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 学ぶT細胞受容体とがん抗原の相互作用解析法。X線結晶学と表面プラズモン共鳴を用いて、TCR・ペプチドHLAタンパク質の精製と高解像度構造解析を行い、がん免疫療法への応用可能性を示す。

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BMは、癌研究英国の博士課程の学生の身分によってサポートされています。 AGは、生命科学研究ネットワークウェールズ博士課程の学生の身分によってサポートされています。 VBは、がん研究ウェールズ博士課程の学生の身分によってサポートされています。 DKCは、ウェルカムトラスト研究キャリア開発フェロー（WT095767）です。 AKSは、ウェルカムトラストの研究者です。 GHMは、関節生命科学研究ネットワークウェールズとTenovusがん医療の博士課程の学生の身分によって運営されています。私たちは、施設やサポートを提供するためのダイヤモンドライトソースのスタッフに感謝します。

1.タンパク質発現<ol><li>先に詳細に記載されるように、 図17に示すように 、可溶性のTCRとpHLAsの生成のための遺伝子構築物を作る18。 5 &#39;BamH1および3&#39; pGMT7ベクターへの挿入のためのEcoR1制限部位で構成する各設計。 </li><li> 4℃で5分間、 大腸菌の5μLと50-200 ngの/μLのプラスミドの1μLをインキュベートすることにより、目的のタンパク質をコードする配列を含むpGMT7由来のプラスミドベクターで大腸菌ロゼッタ（DE3）pLysS株を変換、42°Cで2分間、そして4℃で5分間、および50 mg / Lのカルベニシリンを補充したLB寒天プレート上で37℃で一晩プレート。 </li><li>個々のコロニーを選択し、37℃、TYPメディア（16グラム/ Lトリプトン、16グラム/ Lの酵母抽出物、および5グラム/ L HK 2 O 4）の30ミリリットルで220 rpmで成長するサスペンションまで、100μMのカルベニシリンを補充しました光学ドに達しますnsity 0.4〜0.6の（OD 600）。 </li><li> 3時間、0.5mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を導入することにより、5mLのアリコート中のタンパク質の産生を誘導します。し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）分析のための誘導なしの懸濁液20μLを維持し、ゲルを染色。 </li><li> 100μMのカルベニシリンを補充したTYP 1Lにスターター培養物を添加し、懸濁液を0.4と0.6の間のOD 600に達するまでステップ1.3で説明したように細胞を増殖させます。 </li><li> 0.5mMのIPTGで3時間、タンパク質の発現を誘導します。 3000×gで20分間、細胞を遠心分離し、上清を注意深く捨てます。 </li><li> 2秒間隔を使用して、60％のパワーで30分間、氷上で超音波処理溶解緩衝液の40ミリリットル（10％グリセロール、10mM塩化マグネシウム、 塩化マグネシウム; 150mMのNaCl、10mMのトリス、pHが8.1）でペレットを溶解0.1g / L DNaseで30分間、室温（RT）でインキュベートします。 </li><li> SUSトリート洗浄緩衝液の100mLの（、50 mMトリス、pHを8.1; 100mMのNaCl、および10mM EDTA、0.5％トリトンX-100）を用いて封入体（IB）の形でタンパク質を含む年金。 </li><li> 4℃で20分間および8000×gでのサンプルを遠心分離し、上清を注意深く捨てます。再懸濁再懸濁バッファー（50 mMトリス、pHが8.1; 100mMのNaCl;および10mM EDTA、pHは8.1）100mL中のペレット、8,000×gで以前のように遠心分離をし、慎重に上清を捨てます。 </li><li>最後に、グアニジン緩衝液10mlにペレットを溶解し（6Mのグアニジン、50mMのトリス、pHが8.1、2mMのEDTA、pHは8.1、および100mMのNaCl）と分光光度計を用いて280nmでのタンパク質濃度を測定します。 </li></ol> 2. pHLAとTCRのリフォールディング<ol><li> pHLAのリフォールドは、（ビオチンタグまたはHLA-A2）、HLA-A2の30 mgの混合のIB、β2MIBSの30mgを、最終体積水浴中で37℃で30分間、ペプチドの4ミリグラム10mMのジチオスレイトールを補っグアニジンバッファーの6ミリリットルの（DTT）。 </li><li>あらかじめ冷却HLAのリフォールディング緩衝液1Lに、前のミックスを希釈することにより、タンパク質のリフォールディングを開始します（50 mMトリス、pHが8.1; 400mMのL-アルギニン、2mMのEDTA、pHが8.1; 6ミリモルのシステアミン;および4mMのシスタミン）。 </li><li> HLAを3時間4℃で攪拌リフォールディングした後、12.4 kDaのMWCO（分子量カットオフ）透析チューブにそれを移し、10 mMトリス、pHが8.1の20 Lに対して24時間透析回残します。 </li><li> TCRをリフォールドするために、10mMのDTTで補充グアニジン緩衝液6 mLの水浴中で37℃で30分間TCRα鎖IBSの30 mgのとTCRβ鎖IBSの30 mgの混合。 </li><li>あらかじめ冷却TCRのリフォールディング緩衝液1Lに変性したTCRの混合物を希釈することにより、タンパク質のリフォールディングを開始します（50 mMトリス、pHが8.1; 2.5 M尿素; 2mMのEDTA、pHが8.1; 6ミリモルのシステアミン;および4mMのシスタミン）3のために時間。 </li><li> 12.4-kDaのMWCO透析チューブにリフォールディングを移し、10 mMトリス、pHが8.1の20 Lに対して24時間、二回透析。 </li><li> pHLAまたはTCR refの両方をフィルタリング精製工程のために0.45μmのメンブレンフィルターを用い歳。 </li></ol>高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）3.精製<ol><li>柔軟かつ直感的なクロマトグラフィーシステム上の10 mMトリス、pHが8.1の20mLで予め平衡化し、7.9 mLの上に50μmの陰イオン交換樹脂カラムをフィルタリング再折り畳み準備（pHLAまたはTCRのいずれか）をロードします。 </li><li> （8カラム体積にわたって、10 mMトリス中の0〜500mMのNaCl、pHは8.1）塩勾配で5ミリリットル/分でタンパク質を溶出し、1-mL画分を収集します。 </li><li> 、SDS-PAGEにより、目的のタンパク質に対応する画分を分析して一緒に目的のタンパク質を含む画分をプールし、4,000×gで20分間の遠心分離によって10-kDaのMWCO 20または10kDaのMWCO 4で500μLにそれらを集中フロースルーを廃棄します。 </li><li>アプリで予め平衡化した24 mLのサイズ排除クロマトグラフィーカラムに2mLの注入ループに濃縮タンパク質製剤をロードropriate溶出緩衝液：リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、HBS（10mMのHEPES、pH7.4中、150mMのNaCl、3.4 mMのEDTA、0.005％界面活性剤）、または結晶バッファー（10 mMトリス、pHが8.1、および10mMのNaCl ）。 </li><li> 0.5mL /分の体積のカラム1オーバーの流量でタンパク質を溶出させます。 SDS-PAGEにより確認対象のタンパク質を含有する1mLの画分を収集します。 YLEPGPVTA（A2-YLE）、YLEPGPVTV（A2-YLE-9V）、ALEPGPVTAとHLA-A * 0201：注：これらのメソッドは、可溶性PMEL17 TCRとのgp100のTCRを生成するために使用されただけでなく、本研究で用いたpHLAsのすべて（A2-YLE-1A）、YLAPGPVTA（A2-YLE-3A）、YLEAGPVTA（A2-YLE-4A）、YLEPAPVTA（A2-YLE-5A）、YLEPGAVTA（A2-YLE-6A）、YLEPGPATA（A2-YLE-図7（a））、またはYLEPGPVAA（A2-YLE-8A）。 </li></ol> 4.表面プラズモン共鳴（SPR）分析<ol><li> CM5センサーチップ19を搭載した分子間相互作用解析システムを用いて平衡結合分析または熱力学解析を実行します。 </li><li> fでCM5チップを活性化させます牛の鳴き声1：10μL/分の流速で、25℃で10分間、100mMのN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）および400mMの1-エチル-3-（3-ジメチルプロピル）-carboiimide（EDC）の1ミックスC. </li><li>すべての4つのフローセルにチップ表面に結合する共有することにより（10mMの酢酸、pH4.5中では200μg/ mLでの110μL）ストレプトアビジンの負荷約5000応答単位（RU）と非アクティブに1 M塩酸エタノールアミンの100μLを使用残りの反応基。 </li><li> （製造業者によって提供される）商業バッファ中〜1μMでpHLAのカップル約500-600 RU、10μL/分の遅い流量でCM5センサーチップにチップ表面に均一な分布を確実にします。 </li><li> 60秒間（メーカーによって提供される）商業バッファ内の1 mMのビオチンとチップ表面を飽和。 </li><li> 25℃で30μL/ minの高流速で、関連するフローセルの上に可溶性TCRの10連続希釈液を注入します。 </li><li>平衡結合定数を計算します（K D（E））は、非線形曲線フィット（Y =（P1xと）/（P2 + x））の20を使用して値を。 注：Y =応答単位で、x =アナ濃度、P1 = R 最大 、P2 = K D。 </li><li> 1と仮定動態分析の実行：結合1ラングミュアおよびソフトウェアパッケージ2内のグローバル適合アルゴリズムを使用してデータをフィット。 </li><li> 5°C、12°C、18°C、25°C、30°C 19：以下の温度では、この方法を繰り返すことにより、熱力学実験を行います。 </li><li>標準的な熱力学の式（ΔG°= -RTlnK D）19を使用して°ΔGを計算するために、異なる温度でSPRによって決定K D値を使用します。 注：R =気体定数、T Kで=温度、LN =自然対数。 </li><li> 19 -ギブス・ヘルムホルツ方程式（TΔS°ΔG°=ΔH）に応じて熱力学的パラメータを計算します。 </李&gt; <li> 3パラメータ方程式（Y =ΔH+ΔCP*（X-298）-x *に適合するように、非線形回帰を使用して、温度（K）に対して、結合自由エネルギー、ΔG°（ΔG°= -RTlnK D）をプロットΔS- X *ΔCP* LN（X / 298））19。 注：X =ΔG°、K中のy =温度。 </li></ol> 5.等温滴定熱量測定（ITC） <ol><li>等温滴定熱量計を用いてITC実験を行います。熱量計セルに30μMpHLAを注入し、シリンジ内に210μMの可溶性TCRをロードします。以下の緩衝液条件を使用する：150mMのNaClを含む20mMのHepes（pH7.4）で。 </li><li> 20 TCR注射、2μLボリュームのそれぞれを実行します。解析用ソフトウェアを用いて、ΔHおよびK Dを計算します。 </li></ol> 6.結晶化、回折データの収集、およびモデル洗練<ol><li>結晶化ロボットを使用して、結晶化試験を行います。 </li><li> VAPにより結晶を成長させますまたは結晶化緩衝液（母液）21の60μLを含むリザーバと、96ウェルプレート中のシッティングドロップ技術を経由して18℃で拡散。 </li><li> 10-kDaの分子量カットオフ遠心濃縮で3000×gで回転させることにより結晶バッファでおよそ10mg / mLの（0.2ミリモル）に可溶性pHLAを集中。 </li><li>およそ10mg / mLの（0.1ミリモル）でタンパク質溶液を得るために：1のモル比共複合体構造については、1でTCRとpHLAを混ぜます。 </li><li>結晶化ロボットを用いた結晶化画面から各リザーバー溶液の200 nLのに、TCRとpHLA 1のモル比の混合物および24時間後に顕微鏡下で結晶に得点、48時間、72：200、単独pHLAのnLの、または1を追加します。時間、およびその後週に一度。 </li><li>手動で顕微鏡下でクライオループでそれらを取り付け、液体窒素（100 K）でそれらを浸漬し、保存することによって、それらをクライオ冷却のHarvest単結晶。 注：ロード結晶がPRACのビットを取りますTICE、およびデータ収集のために十分である結晶決定は経験が付属しています。経験則として、結晶より大きく、より定期的に、より良いです。 </li><li> 100 Kでの窒素ガスのストリーム内のデータを収集します 注：このデータは、ダイヤモンドライトソース（DLS）、英国の国家シンクロトロン科学施設で取得しました。 </li><li> MOSFLM 22とXDSパッケージ23の両方を使用してxia2で反射強度を推定することによって、データを分析し、その後、SCALAや漫然24とCCP4パッケージ25との間でデータをスケーリング。 </li><li> PHASER 26を用いて分子置換を有する構造を解決します。 </li><li> COOT 27でモデルを調整し、REFMAC5 28でモデルを改良。 </li><li> PYMOL 29でグラフィカルな表現を準備します。 </li><li> 「接点」を使用して連絡先を計算しますCCP4パッケージ内のプログラム。ファンデルワールス接触のための4Åカットオフと水素結合と塩橋3.4Åカットオフを使用してください。 </li><li> CCP4パッケージに「SC」のプログラムを用いて表面の相補性を計算します。 </li><li> 30に記載されているように 、TCR-pHLA複合体の交差角度を計算します。 注：この研究のために、反射データと最終モデル座標は、PDBデータベースに寄託した（PMEL17 TCR-A2-YLE-9V PDB：5EU6、A2-YLE PDB：5EU3、A2-YLE-3A PDB：5EU4、およびA2 -YLE-5AのPDB：5EU5）。 </li></ol>

著者には利益相反や競合する金銭的利益はありません。

ここで説明するプロトコルは、任意のヒトの疾患との関連におけるT細胞応答の分子や細胞解剖のためのフレームワークを提供します。癌は、本研究の主な焦点であったが、我々は、32、33、34、35、36、37及び自己免疫38、39、40の間のウイルスに対するT細胞応答を調査するために非常に似たアプローチを使用しています。さらに、我々は、T細胞抗原認識2、19、41、42を支配する分子の原理を理解するために、より広く、これらの技術を使用しています。実際、変更の予測不可能な性質は、残基をペプチドに、偶数のものTCR接触残基の外側に影響T細胞認識は、ヘテロクリティックペプチドの設計のために重要な意味を持ちます。これらの知見は、直接拡張診断45、46、47のと同様に、ペプチドワクチン6、43、および人工的な高親和性のTCR 3、4、5、20、44を含む、新規のT細胞療法の開発に貢献してきました。 プロトコル内の重要なステップ 高純度、機能性タンパク質の生成は、本論文で概説した方法の全てのために不可欠です。 修正およびトラブルシューティング 高純度のタンパク質を生成することの困難は、しばしば高度の発現に関連します-pure、 大腸菌発現系からの不溶性のIB。通常、表現プロトコル（ 例えば、異なる大腸菌株を使用して、異なる光学密度で誘導し、または異なるメディアの形成を使用して）変更すると、これらの問題を解決します。 技術の制限事項 これらの技術は、通常は細胞表面で発現される可溶性タンパク質分子（TCRとpHLA）を使用します。したがって、構造的/生物物理学的所見は生物学的意義を確認するために、携帯のアプローチと一致していることを確認することが重要です。 既存の/代替の方法に対する技術の意義 X線結晶構造解析および機能解析によって実証生物物理学の使用を介して、我々および他癌エピトープのためのTCRの特定は、一般的に低い結合親和48によって特徴付けられることを実証しました。この低TCRの親和性は、T細胞がアーカンソー理由を説明するのに役立つことがあり電子癌をクリアで自然に効果的ではありません。抗がんのTCRと同族腫瘍抗原の間の複合体の高分解能原子構造は、この弱い親和性の分子基盤を明らかにするために始めています。さらに、これらの研究は、将来の改善16を播種し、この問題を克服するために設計された治療的介入の根底にあるメカニズムを決定するために役立ちます。本研究では、gp100ののHLA-A * 0201拘束性メラノーマエピトープとの複合体、天然に存在するαβTCRの第1の構造を調べました。綿密な生物物理学的検査と組み合わせた構造は、相互作用の全体的な結合様式を明らかにしました。我々はまた、（表面プラズモン共鳴を用いて評価）結合TCRを抑止し、CD8 + T細胞認識（官能試験）ペプチドの変異形態で発生し、予期しない分子スイッチを発見しました。 HLA抗原presentatiのこの新しいメカニズムを実証するためにのみ可能でした説明した高解像度の方法を使用して上。 この技術を習得した後、将来のアプリケーションや方向性 堅牢な機能分析と組み合わせたときに全体的に、我々の結果は、X線結晶学および生物物理学的方法の力を発揮します。これらのアプローチを使用して、T細胞抗原認識を支配する正確な分子機構を精査することが可能です。実際、立体構造変化は、抗原識別49、50、51の間に役割を果たすことができる方法を示す、非連結TCRの構造を解明するために、このアプローチを使用することも可能です。 TCR-pHLA相互作用を支える非常に複雑で動的な性質をよりよく理解することは、また、治療設計のための明白な意味を持っています。直接修正が抗原recognitioに持って治療標的とされている分子だけでなく、効果を「見る」ことができることnは、明らかに今後これらの薬の開発が向上します。本研究では、高濃度TCRによって係合していない単一のペプチド残基であっても変化は予測できない順に、飛躍的にT細胞認識を変化させる、HLA結合ペプチドの他の残基に構造変化を送信することができることを示しています。ヒト疾患の幅広い将来の治療法を設計する際に、T細胞の抗原認識時に用いられる分子機構のより完全な理解は、非常に有益であろう。

X線結晶構造解析はされている、および、リガンド - 受容体相互作用の性質を理解するための非常に強力な技術であり続けるだろう。アトミック詳細にこれらの相互作用を可視化することにより、多くの生物学的プロセスを支配する分子メカニズムを漏らすすることが可能であるが、直接治療的利益のための接触界面を変更することも可能であるのみならず。このような表面プラズモン共鳴および等温滴定熱量測定（名ほんの）のような技術を用いて結合され、そのような修飾は、次いで、結合親和性は、相互作用の動力学、及び熱力学に直接影響を評価するための生物物理学的に分析することができます。最後に、関連する細胞型上の官能実験を行うことにより、受容体 - リガンド相互作用の修飾の分子と機能的影響の詳細画像は、非常に具体的なメカニズムの情報を提供し、収集することができます。全体として、これらの方法のこれらのタイプは、抑止を可能にする原子分解能画像を提供します<html>診断および治療の進歩のために付随する意味合いで、どのように動作するか、生物学的システムのmination。 私たちの研究室では、日常的に自己免疫における、および移植の際に、病原体および癌に対するヒトT細胞免疫を仲介する受容体を研究するためにこれらの技術を使用しています。ここでは、T細胞受容体（TCR）とヒト白血球抗原（HLA）拘束性腫瘍由来ペプチド（pHLA）との間の相互作用により媒介される癌に対するヒトCD8 + T細胞応答、に焦点を当てます。 CD8 + T細胞が、癌細胞を標的とすることができるが、我々などが以前の抗癌性TCRが最適にそれらの同族pHLA 1,2に結合することが示されている、ので、これは重要です。したがって、多くの研究室は、TCR 3、4、5またはペプチドリガンド6のいずれかを変更しようとしています免疫原性を増加させるために、より良い標的癌細胞へのクラス= &quot;外部参照&quot;&gt; 7、8。しかしながら、これらのアプローチは、必ずしも有効ではなく、オフターゲット毒性4、9、10を含む重篤な副作用を有することができます。癌抗原のT細胞認識を支配する分子メカニズムを探求さらなる研究は、これらの欠点を克服するために不可欠となります。 本研究では、我々は、最も一般的に* 0201（HLA-Aによって提示された100（gp100の）の糖タンパク質分化メラニン細胞抗原のフラグメントに対して特異的なCD8 + T細胞による自家メラノーマ細胞に対する応答、gp100の280-288、に焦点を当て-expressed人間pHLAクラスI）。この抗原は、メラノーマの免疫療法のために広く研究対象となっているとバリンがアラニンに置き換えられている、いわゆる「ヘテロクリティック」ペプチドとして開発されていますアンカー位置9でpHLA安定性11を向上させることができます。このアプローチは、 インビトロで黒色腫反応性CTLの誘導を増強するために使用され、成功した臨床試験12に使用されています。しかし、ペプチド残基の改変は、臨床6、13で最もheteroliticペプチドの乏しい有効性によって実証T細胞特異性の予測できない効果を有することができます。実際に、ペプチド残基Glu3をAlaに置換されたgp100の280-288の別のヘテロ形態は、gp100の280-288特異的T細胞14,15のポリクローナル集団による認識を廃止しました。我々は以前、ペプチドアンカー残基であっても軽微な変更は、実質的に予測不可能な方法6、16においてT細胞認識を変えることができることを実証しました。したがって、この研究は、構築に焦点を当てCD8 + T細胞がgp100のを認識し、どのようなTCRとpHLAとの間の相互作用の修飾は、この機能に影響を与えることができる方法のより詳細な画像をる。 ここでは、HLA-A * 0201（A2-YLE）によって提示されたgp100 280-288のための特異的な2つのTCRの高純度、可溶性形態、ならびにpHLAの自然と変更されたフォームを生成しました。これらの試薬は、ヘテロA2-YLEの形態、ならびに非連結形態における突然変異pHLAs二との複合体中のヒトTCRの三原子構造を解決するためにタンパク質結晶を生成するために使用しました。我々は、その後に深い生物物理学的実験を行うことでのTCRのペプチドの置換の影響を実証するペプチドスキャン法を用いました。最後に、我々は、様々なペプチドの修飾の生物学的影響を試験するために、機能の実験を行うために、A2-YLE特異的TCRのいずれかを発現するように再プログラムされた、遺伝的に改変されたCD8 + T細胞株を生成しました。これらのデータは、さらにモディことを実証していますficationsは予測できないノックオンTCR結合およびT細胞認識無効に隣接するペプチド残基に影響を与えることができ、TCR結合モチーフの外側にある残基をペプチドに。我々の調査結果は、黒色腫のためのこの重要な治療標的のT細胞認識の基礎となる構造的機構の第1の例を表します。

<table><tbody><tr><td>S.O.C. media</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbi-Safe New Orbit インキュベーター</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>carbenicillin&nbsp;</td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG&nbsp;</td><td>フィッシャークイック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クーマシーステインセーフステイン&nbsp;</td><td>ジェネロン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レジェンド RT 遠心分離機&nbsp;</td><td>ソルヴァル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>・トリス&nbsp;</td><td>フィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム&nbsp;</td><td>アルコス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>フィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グリセロール&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ソノパルス HD 2070&nbsp;</td><td>バンデリン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse&nbsp;</td><td>フィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリトン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>フィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グアニジン&nbsp;</td><td>フィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND1000&nbsp;</td><td>サーモ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペプチドペプチド</td><td>タンパク質研究</td><td></td><td></td></tr><tr><td>用ジチオスレイトール&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-アルギニン&nbsp;</td><td>SAFC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>システアミン&nbsp;</td><td>フィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シスタミン&nbsp;</td><td>フィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透析チューブ&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尿素&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メトリックセル 0.45 &mu;mメンブレンフィルター</td><td>Pall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>POROS 10/100 HQ&nbsp;</td><td>応用バイオシステム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml;KTAピュアFPLCシステム&nbsp;</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 kDa MWCO Vivaspin 20&nbsp;</td><td>ザルトリウス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 kDa MWCO ビバスピン 4&nbsp;</td><td>ザルトリウス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スーパーデックス 200 10/300 GL コラム&nbsp;</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液生理食塩水&nbsp;</td><td>オキソイド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BIAcoreバッファHBS&nbsp;</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス</td><td></td><td></td>ビ</tr><tr><td>オチン化キット</td><td>Avidity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BIAcore T200</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM5チップカップリングキット</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcal VP-ITC&nbsp;</td><td>GEヘルスケア・ライフサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>・ヘペス&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gryphon結晶化ロボット</td><td>Art Robbins InstrumentsIntelli-plate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Art Robbins Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>結晶化スクリーンおよび試薬</td><td>分子寸法</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 flask&nbsp;</td><td>グライナーバイオワン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu;m フィルター</td><td>Miller-GP, Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear 超遠心チューブ&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オプティマ L-100 XP SW28ローター</td>付き <td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD8マイクロビーズ&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗CD3 / CD28ダイナビーズ&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗 PE マイクロビーズ&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CK媒体、PHA</td><td>Alere Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗TCRV&β; mAb&nbsp;</td><td></td><td></td><td>BD</td></tr><tr><td>ダサチニブ&nbsp;</td><td>Axon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MIP-1&beta;およびTNF&alpha;エリサ&nbsp;</td><td>R&Dシステムズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;51Cr&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1450 Microbetaカウンター</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

がん抗原の機構理事t細胞受容体の認識を決定するためにx線結晶学、生物物理学、および機能アッセイを使用して、

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

ヒトCD8+細胞傷害性Tリンパ球(CTL)は、腫瘍制御において重要な役割を果たすことが知られています。この機能を果たすためには、細胞表面発現T細胞受容体(TCR)がヒト白血球抗原(HLA)制限腫瘍由来ペプチド(pHLA)を機能的に認識する必要があります。しかし、私たちや他の人々は、ほとんどのTCRが腫瘍抗原に最適ではない結合を示すことを示しました。この認識の低さを定義する分子メカニズムを明らかにすることは、これらの欠点を回避する新しい標的療法の開発に役立つ可能性があります。実際、この分子的理解を欠いている現在の治療法は、普遍的に効果的ではありません。ここでは、TCRとpHLAの間の相互作用の性質がT細胞の機能をどのように支配しているかを決定するために、研究室で一般的に採用している方法について説明します。これらの方法には、可溶性TCRとpHLAの作製、X線結晶構造解析、生物物理学的分析、およびpHLAマルチマーによる抗原特異的T細胞染色のためのこれらの試薬の使用が含まれます。これらのアプローチを使用し、構造解析に基づいて、TCRとpHLAの間の相互作用を変更し、これらの修飾がT細胞抗原認識にどのように影響するかをテストすることができます。これらの知見は、すでに多くのがん抗原のT細胞認識のメカニズムを明らかにするのに役立ち、新しいがん治療のための改変ペプチドおよび改変TCRの開発を導く可能性があります。

ここでは、ヒト白血球抗原によって提示されるT細胞受容体と腫瘍抗原との間の相互作用の性質がT細胞の機能をどのように支配しているかを決定するために、実験室で一般的に採用している方法を説明します。これらの方法には、タンパク質産生、X線結晶構造解析、生物物理学、および機能的なT細胞実験が含まれます。

がん抗原の機構理事T細胞受容体の認識を決定するためにX線結晶学、生物物理学、および機能アッセイを使用して、

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

この手順の全体的な目標は、生物物理学的および構造的分析に使用するのに十分な品質の可溶性リカンビンT細胞受容体およびペプチドHLAタンパク質を生成することです。この方法は、T細胞免疫学の分野における疑問に答えるのに役立つ可能性があります。例えば、なぜT細胞はがんに対して強く反応しないのでしょうか?この技術の主な利点は、T細胞受容体がどのように標的を認識し、T細胞を介した免疫応答につながるかを説明する非常に高解像度の機構データが得られることです。この技術の意味は、T細胞がほとんどの免疫応答において極めて重要な役割を果たすため、事実上あらゆるヒト疾患の治療または診断にまで及びます。この方法は、T細胞の免疫応答に関する洞察を得ることができますが、受容体リガンド相互作用によって制御される他のシステムにも適用できます。一般に、この方法に不慣れな個人は、生物物理学的および構造的実験に十分な品質の可溶性活性タンパク質を生成することが非常に難しいため、苦労するでしょう。10マイルメートルのジチオスレイトールを含む6ミリリットルのグアニジン緩衝液へのペプチドHLAリフォールディング手順を開始するには、30ミリグラムのHLA-A2封入体、30ミリグラムのベータ2-M封入体、および目的のペプチド4ミリグラムを添加します。混合物を摂氏37度で30分間インキュベートします。次に、混合物を1リットルのHLAリフォールドバッファーで希釈し、摂氏4度に予冷し、その温度で3時間攪拌します。混合物を20リットルの10ミリモルトリス(pH 8.1)に対して2回、それぞれ24時間透析します。.TCRリフォールディング手順を開始するには、10ミリモルのジチオスレイトールを含む6ミリリットルのグアニジン緩衝液に、TCRアルファ鎖とベータ鎖IBをそれぞれ30ミリグラム追加します。混合物を摂氏37度で30分間インキュベートし、予め冷却したTCRリフォールドバッファー1リットルで混合物を希釈します。希釈したTCRリフォールド混合物を、ペプチドHLA混合物と同じ方法で撹拌し、透析します。透析した両方のリフォールド混合物を0.45マイクロメートルのメンブレンフィルターでろ過します。次に、ろ過したリフォールド調製物の1つを、pH 8.1の10ミリリットルの10ミリリットルで事前に平衡化した7.9ミリリットルの50マイクロメートル陰イオン交換樹脂カラムにロードします。塩グラジエントバッファーシステムでタンパク質を毎分5ミリリットル溶出します。1ミリリットルのフラクションを採取し、SDS-Pageでフラクションを分析します。リフォールディングされたタンパク質を含む画分を組み合わせます。タンパク質混合物を10キロダルトンの分子量カットオフ遠心濃縮器に入れます。混合物を20分間、または必要な長さ、4000 gで遠心分離して、混合物を500マイクロリットルに濃縮します。フロースルーを破棄します。濃縮タンパク質調製物を2ミリリットルの注入ループに成形し、適切なエラッジョンバッファーで事前に平衡化した24ミリリットルサイズの排除クロマトグラフィーカラムにタンパク質を注入します。1カラムのバッファーでタンパク質を1分間0.5ミリリットル溶出します。1ミリリットルの画分を採取し、SDS-Pageで画分を分析し、目的のタンパク質を含む画分を組み合わせます。特定のTCRペプチドHLA相互作用がわかっている場合はKDの10倍以上から10倍以下の濃度範囲で、TCR溶液の10回の段階希釈液を調製します。それ以外の場合は、200マイクロモルのTCR濃度から開始します。次に、100ミリモルとN-ヒドロキシスクシンイミドと400ミリモルEDCの混合物をチップ上に1対1の流量で10マイクロリットル/分、摂氏25度で流し、カルボキシメチル化デキストラン被覆センサーチップを活性化します。次に、110マイクロリットル/ミリリットルあたり200マイクログラムのストレプトアビジンと10ミリモルの酢酸pH4.5を4つのフローセルすべてにロードして、チップ表面を機能化します。100マイクロリットルの1モルエタノールアミド塩酸塩で残りの反応基を不活性化します。.次に、チップメーカー提供のバッファーに約1マイクロモルのペプチドHLAの溶液を、応答ユニット数が500〜600増加するまで、チップの表面に毎分10マイクロリットルで流します。チップの表面を1ミリモルのビオチンと製造用バッファーで60秒間飽和させます。次に、TCR溶液の10段階希釈液を毎分30マイクロリットル、摂氏25度で注入します。平衡結合定数を計算し、動力学解析を実行します。この方法で一連のSPR実験を行い、TCR希釈液を注入する温度のみを変化させます。各温度の平衡結合定数を決定し、ギブスエネルギーとその他の熱力学的パラメータを計算します。非線形回帰近似を使用して、ギブス エネルギーを温度に対してプラグします。ペプチドHLA溶液を0.2ミリモルおよび結晶化緩衝液に濃縮し、10キロダルトンの分子量カットオフ遠心濃縮器で3, 000倍gで遠心分離します。共錯体結晶化のために、1対1のTCRとペプチドHLAの0.1ミリモル溶液を調製します。結晶化ロボットとスクリーニングキットを使用して、96ウェルプレートでシッティングドロップ法を使用して結晶化試験を準備します。各リザーバーには60マイクロリットルの結晶化緩衝液があり、各滴は各200ナノリットルのタンパク質溶液と緩衝液で構成されています。クリスタルを摂氏18度で成長させます。顕微鏡下での結晶のスコアは、24時間後、48時間後、72時間後、その後は毎週です。十分な品質の単結晶が成長したら、極低温対応ループで単結晶を採取し、結晶を液体窒素に保存します。窒素ガス100ケルビンの流下で放射光X線回折を行い、データを解析し、適切なソフトウェアで構造を解く。解析された構造からの接触、表面の相補性、および交差角を計算します。これらの方法を用いて、TCRおよびペプチドHLA分子を発現させ、可溶性形態に再折り畳みしました。ペプチドHLA分子の中のペプチドはgp100抗原でした。SPRを使用して、さまざまな温度での抗原に対するPMEL17 TCRの結合親和性を決定しました。次に、SPRと等温熱量滴定の両方を使用して、タンパク質間相互作用の熱力学的パラメータを決定しました。PMEL17 TCR A2-YLE-9V錯体を結晶化し、シンクロトロンX線回折で評価しました。TCR CDRループとTCRタンパク質が接触したペプチドHLA残基の両方を同定し、接触の性質を調査しました。ペプチドの変異型を有するペプチドHLA分子も、この方法で精製および結晶化した。TCRとの結合相互作用を妨げる可能性のある構造の違いを調査すること。第3または第5残基の変異は、プロリン4の位置を有意に変化させることがわかった。これにより、TCR CDR-3αループとの接触の多くが破壊されることになる。この手順を試行する際は、さらなる分析のために最も純度の高いタンパク質のみを選択することが重要です。この手順に続いて、可溶性タンパク質を使用してペプチドHLA四量体染色などの他の方法を実施し、患者の血液から抗原特異的T細胞を分離し、診断およびさらなる分析を行うことができます。この技術は、その開発後、T細胞免疫学の分野の研究者がTCRペプチドHLAの結合を精緻に探求する道を開き、がんやその他のヒト疾患に対する新薬の開発を可能にしました。このビデオを見れば、生物物理学的および構造的解析を行うのに十分な品質のTCRおよびペプチドHLAタンパク質を生成する方法について十分に理解できるはずです。

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