293T細胞の一過性トランスフェクションにより、複製欠損レトロウイルスの生産

この手法は、人間の癌遺伝子をコードし、その後マウスモデルにおける骨髄増殖性疾患の誘発に使用される。複製欠損レトロウイルス株を準備する効率的な方法を示します

私たちは、タフツ・ニューイングランド・メディカル・センターの分子腫瘍学研究所にいます。私の名前はクリスティーナ・レスコで、リック・ヴァン博士の研究室のポスドク研究員です。当研究室では、ヒト免疫原性白血病、CMLおよびCML様疾患の研究に取り組んでいます。

私たちはこのヒトの病気をマウスにモデル化しており、その方法はレトロウイルスベクターを介してヒトのがん遺伝子を導入することです。ですから、このヒトがん遺伝子をマウス細胞に導入するために最初にすべきことは、ウイルス自体を作ることです。次にやるべきことは、実際にウイルスを引き締めることです。

これが私のストックプレート、2 9 3 T細胞です。私はPBSで培地を洗い流す必要があります 2 9 3 T細胞は接着細胞ですが、彼らは超接着性ではないので、すべての動きは非常に穏やかでなければなりません。洗ったら、PBSをトリプシンに置き換えます。

プレートから細胞を取り出すためには、プレートをインキュベーターに約3分間戻す必要があります。つまり、2分後、3分後、細胞は実際には懸濁状態になります。通常の培地をさらに数ml追加します。

これにより、tripsinが中和されます。この時点で、すべての細胞が懸濁液にきれいに収まっていることを確認するために、懸濁液を50mlのチューブに渡し、トリプルブルーの存在下で細胞をカウントし、ヘモサイトメーターを使用して手でカウントします。そこで、計算どおりに希釈を行い、プレートごとに3つの10から6つのセルをプレートします。

4mlの培地では、細胞が十分に播種されていることを確認し、プレートをインキュベーターに16〜18時間、通常は翌朝に戻します。つまり、GFPウイルス感染から48時間後になったのです。クロロキンは、細胞に装着するDNAの取り込みを増やすために使用されます。

培地を細胞からそっと吸い取り、細胞はプレートの側面でプレートに優しく付着しています。この時点で、プレートをインキュベーターに約1時間戻して交換します。一方、ネオマイシン耐性遺伝子を発現している第1層と、実際にGFPIを発現している第1層の細胞に適用するためのDNA混合物をXI DNAを使用して調製し、トランスフェクション全体を制御します。

最後に、塩化カルシウムを加えます。塩化カルシウムを使用すると、トランスフェクション効率が大幅に向上します。私たちは今1時間後です、私たちはクロロキン培地でプレートについて取り、トランスフェクション溶液を追加するつもりです。

私たちがしなければならない最後のステップは、実際にH 2 XHBS溶液を添加しながら、2 x 2滅菌HBSを1 ml追加することです。チューブを同時にボルテックスし、一滴ずつゆっくりと進む必要があります。これは、沈殿を避けるためで、すぐに目的のプレートに1mlの溶液を分配し、それを一滴ずつ繰り返しています。

この時点で、2 9 3 T細胞はかなり感受性があります。なぜなら、私たちが持っているクロロキン媒体のためです。すべての領域をカバーし、プレートをできるだけ動かさないようにし、プレートに貼り付けたコンストラクトでラベルを付け、次のコンストラクトで繰り返す必要があります。

この時点で、インキュベーター内のプレートを7〜11時間交換します。少なくとも7つ、ただし11以下、クロロキンのために細胞が非常に敏感であり、この時間の後に培地を交換する必要があります。現在、取引から約30時間後です。

これがこの時点での最後の培地交換であり、2 9 3 C3 T細胞はコンフルエンスに達しました。繰り返しになりますが、プレートの側面に新しいメディウムを塗布するときは、非常に穏やかでなければなりません。針付きの10mlシリンジを使用しています。

針をフィルターに交換するので、この時点で培地をよく混ぜています。この時点でウイルスを採取し、使用する前に使用するまでマイナス80度に置くことができます。まず最初にやるべきことは、実際にウイルスを引き締めることです。ウイルスを作る際にはいくつかの敏感なステップがあり、そのうちの最初のステップは2 9 3 T細胞の適切な濃度です。

18時間後には約80%のコンフルエントになるため、3つの10から6つのセルプレートでメッキしています。それでもまだ成長する時間が残っているため、トランスフェクションの24時間後には100%コンフルエントになります。これは、優れたウイルス力価にとって非常に重要であることが示されています。

次のステップはクロロキンの使用であり、クロロキンを使用すると実際に2 9 3細胞が感作され、2 9 3 T細胞のシート全体がプレートから浮き上がらないように、培地のすべての交換を非常に穏やかに行う必要があります。最後に、ウイルスを作るために使用しているDNAは、非常にきれいでなければなりません。Cバンド、DNAを使用しています。

ウイルスに感染したら、マイナス80度に保ちます。私たちは通常、ウイルスのタイトさを2回減らす各foによって1回だけそれに従います。したがって、私たちは、ウイルスの実際の力価を行う前に、私たちが行ったウイルスを凍結し、したがって前進させるのが好きです。

ウイルスによっては、実際に感染した細胞を追跡するためにウイルスとGFPを発現させるか、ネオマイシン耐性を持つことができます。そして、実験間や異なる変異体間で一致させるためには、ウイルスを使用する前に実際にウイルスの力価を得ることが非常に重要です。