Name: 293T細胞の一過性トランスフェクションにより、複製欠損レトロウイルスの生産 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-04T04:22:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 学ぶ 293T細胞を用いた一過性トランスフェクションによる複製欠損レトロウイルス製造法。ヒトオncogeneを導入しマウス骨髄増殖性疾患モデルを構築する実験手法を解説します。

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<ol><li>変換前の夕方、3 × 10 6セル/ 6 cmの組織cultureplateでプレート293T細胞。 注：私たちは、トランスフェクションとefficacyasウイルス産生細胞の容易さのために293T細胞を使用する。ヘルパープラスミドが導入されていない限り、これらの細胞は、ウイルスのパッケージングに不足しています。 </li><li>最初の朝、穏やかに培地を除去し、4ミリリットル293T細胞MEDは、25mMのクロロキンを含むと交換してください。 1時間インキュベーターに入れ。 注：プレートは、約80％コンフルエントになるはず。 </li><li>一方、5 mlのチューブに、一度に2枚のためにウイルス意思混合物を準備します。 <ol><li> 2 × 10mgのレトロウイルスプラスミド構築</li><li> 2 × 5 mgのパッケージング構造（EcoPak）、 </li><li> 2 × 62ミリリットルのCaCl </li><li>無菌のddH 2 Oで1 mlに完了 注：レトロウイルスプラスミドは、関心とマーカーの癌遺伝子をコードしている間、EcoPakはギャグ- POL - envをコードしている。一緒に293T細胞で、彼らはエコトロピックマウスの細胞に特異的なレトロウイルス（RV）が、ヒト細胞の感染を生成します。クロロキンおよびCaCl 2の両方は、トランスフェクション効率を高めることが示されている。 </li></ol></li><li> 2倍sterileHBS 1mlの軽くチューブをボルテックスしながら、混合物に滴下を追加。 </li><li>すぐに2プレート、1mlのそれぞれにこのソリューションを追加し、穏やかに、ちょぼちょぼ。 </li><li> 7〜11時間インキュベーターに入れ。 </li><li>夕方（7〜11時間以降）で、静かに培地を除去し、非常に穏やかに5 mlの新鮮な293T培地と交換してください。次の日、正午までインキュベーターに入れて。 注：このステップは、細胞からクロロキンを離陸する必要があるとして、重要である。長期間保管する場合、クロロキンは毒性があります。プレートのソリューションは、トランスフェクション混合物の非常に微細な、ほこりのような析出による、ファジーに見える。 注：これは、細胞がクロロキンによって感作されているように、極端な優しさを持つすべてのメディアの変更を行うことが重要である、と簡単にプレートから切り離すことができます。 </li><li>翌日、18〜24時間。 （正午前後）ウイルスを取得する前に、静かに培地を除去し、非常に穏やかに3ミリリットル新鮮293T培地と交換してください。インキュベーターO / Nに置き換える</li><li>第三朝（18〜24時間以降）は、静かに18 Gの針を備えた10mlの注射器で中程度のフォームプレートを吸い上げる。この上清は、レトロウイルスが含まれています。 </li><li> 、45 mmのシリンジフィルターに針を変更し、溶液を混ぜてシリンジを数回反転させ、フィルターを介して上清を渡して、そしてクリオチューブに分注し 注：代わりに、5 0 mlのコニカルチューブにウイルス、プールの3 +板同じウイルスのすべての上清を作っている。フィルタリングすることにより、クリオチューブにレトロウイルスを含むアリコート上清はその後、よく混ぜる。 </li><li>使用するまで含有するチューブは、ウイルスの完全な上清を-80℃に保存されています。 </li></ol>

<ol><li>DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mutation+in+human+cells+by+using+an+Epstein-Barr+virus+shuttle+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system.</a> Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).</li>
<li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li>
<li>Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kat%3A+A+high-efficiency+retroviral+transduction+system+for+primary+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes.</a> Blood. 83, 43-50 (1994).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70, 5701-5705 (1996).</li>
<li>Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr%2Fabl-transduced+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li>
<li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).</li>
<li>Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+terminal+repeat+sequences+impart+hematopoietic+transformation+properties+to+the+myeloproliferative+sarcoma+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Models of chronic myeloid leukemia.</a> Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+pathogenesis+of+BCR-ABL%2B+leukemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice.</a> Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).</li>
</ol>

4つの重要な点は良いのウイ​​ルス株の成功が保証されます。 <ol><li> 293T産生細胞は、それらは非常に定期的に分割されている意味、非常に健康的である必要は草に覆われたことはなかった、と彼らは密度に到達するように、6 cmの組織培養プレートあたり3.5から5000000の最適化された密度でプレーティングされていますプレートの80％のトランスフェクションの朝に。 </li><li>セルlysozomesを安定化し、核に達するDNAの割合を増加させることにより、5倍に - クロロキンの添加は、約3トランスフェクション効率と、その後のウイルス力価を、向上させます。酪酸ナトリウムは、（別のリソソーム安定剤）もこの目的のために使用されています。クロロキンは、培地7月11日時間を変更している場合には、省略することができます。この時点で、トランスフェクション後は不要です。 </li><li> DNAの品質は非常に重要です。ベクトルおよびパッケージングプラスミドDNAの両方の精製の好ましい方法は、二回塩化セシウム - エチジウムブロマイド浮遊密度遠心法で精製する。我々は、DNAの濃度は少なくとも1 mg / mlのになりたい、とODの280...

トランスフェクションに使用されるすべての試薬 ​​は、滅菌濾過になる（CaCl 2を 、2 × HBS、miliQ H 2 O）と無菌保管しなければなりません。

293t細胞の一過性トランスフェクションにより、複製欠損レトロウイルスの生産

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Bcr - Ablタンパクまたは成長因子受容体由来の癌遺伝子（ZNF198 - FGFR1、BCR -PDGFRα、等）などのがん遺伝子により誘導される私たちの研究室の研究は人間の骨髄増殖性疾患。我々は以前に興味の癌遺伝子を発現するレトロウイルスを感染させた骨髄細胞を移植することにより、私たちのマウスモデルにおける人間のような疾患をモデル化し、勉強することができます。複製欠損レトロウイルスは、ヒトの癌遺伝子をコードするとマーカー（GFP、RFP、抗生物質耐性遺伝子など）は、293T細胞を用いた一過性トランスフェクションプロトコル、アデノウイルスE1A遺伝子産物で形質転換ヒト腎上皮細胞株によって産生される。 293細胞は容易に達成可能な最大50-80％のトランスフェクション効率と、リン酸カルシウム（CAPO 4）による高transfectableという異常な性質を持っている。ここで、我々はそのような単一ゲノムのパッケージングは​​、プラスミドEcoPakこのケースでは、KATまたはPCLを構築する。のようなギャグ- POL - env​​の包装の機能を、表現する関心の癌遺伝子の発現レトロウイルスベクターとプラスミドとの293細胞トランスフェクションのCO最初のトランスフェクションは、さらにクロロキンの使用により改善される。エコトロピックウイルスの株は、培養上清48時間として収集。トランスフェクション後、-80℃で保存し、変換の観点及びin vitro試験セルの行、またはそのようなし私たちのマウスモデルで移植に使用できるマウスの骨髄細胞などの初代培養細胞の感染に使用することができる。

この手法は、人間の癌遺伝子をコードし、その後マウスモデルにおける骨髄増殖性疾患の誘発に使用される。複製欠損レトロウイルス株を準備する効率的な方法を示します

293T細胞の一過性トランスフェクションにより、複製欠損レトロウイルスの生産

当研究室では、Bcr-Ablなどのオンコジーン（癌遺伝子）や、成長因子受容体由来のオンコジーン（ZNF198-FGFR1など）によって誘発されるヒト骨髄増殖性疾患の研究を行っています。

私たちは、タフツ・ニューイングランド医療センターの分子腫瘍学研究所にいます。私はChristina Lescoで、Rick Van博士の研究室の博士研究員です。私たちの研究室では、ヒトの免疫原性白血病、CML、およびCML様疾患の研究に取り組んでいます。私たちは、レトロウイルスベクターを用いてヒトの癌遺伝子を導入することで、このヒト疾患をマウスでモデル化しています。したがって、このヒト癌遺伝子をマウス細胞に導入するために最初に行うべきことは、ウイルス自体を作製することです。次に、実際にウイルスをタイト化（濃縮）します。こちらがストックの2 9 3 T細胞のプレートです。まず、培地をPBSで洗浄します。2 9 3 T細胞は接着性細胞ですが、接着力はそれほど強くないため、あらゆる操作を非常に穏やかに行う必要があります。洗浄後、PBSをトリプシンに置き換えます。細胞をプレートから回収するため、プレートを約3分間インキュベーターに戻します。2〜3分後、細胞は実際に懸濁状態になります。ここに通常の培地をさらに数mL加えます。これによりトリプシンを不活性化します。この時点で、すべての細胞が適切に懸濁していることを確認するために、上下にピペッティングを行います。懸濁液を50 mlチューブに移し、トリパンブルーを用いて細胞数を測定し、血球計数器で手動でカウントします。計算に基づいた希釈を行い、1プレートあたり3×10⁶個の細胞を播種します。4 mLの培地を用い、細胞が適切にプレートに播種されていることを確認した後、プレートをインキュベーターに戻し、通常は翌朝にあたる16〜18時間静置します。これでGFPウイルスの感染から48時間が経過したことになります。クロロキンは、細胞に導入するDNAの取り込み効率を高めるために使用します。プレートの端から静かに培地を吸引し、細胞を除去します。細胞はすでにプレートに接着しています。この後、プレートをインキュベーターに戻し、約1時間静置します。その間に、細胞に導入するためのDNA混合液を調製します。一つはネオマイシン耐性遺伝子を発現するもの、もう一つはGFPを発現するものです。また、トランスフェクション全体のコントロールとしてXI DNAを使用します。最後に、塩化カルシウムを加えます。塩化カルシウムを使用することで、トランスフェクション効率が大幅に向上します。1時間後、クロロキン含有培地を入れたプレートを用意し、ここにトランスフェクション溶液を加えます。最後のステップは、2x sterile HBSを1 ml添加することです。2x HBS溶液を加えながら、同時にチューブをボルテックスし、ゆっくりと1滴ずつ滴下します。これは沈殿を防ぐためです。直ちに、目的のプレートに1 mlの溶液を、同様に1滴ずつ分配します。この時点で、2 9 3 T細胞はかなり感作されています。これは、クロロキンを含む培地を使用しているためです。すべての領域をカバーし、プレートの移動を最小限に抑える必要があります。導入した構築物の名称をプレートに記載し、次の構築物についても同様の手順を繰り返してください。この時点で、プレートをインキュベーターに戻し、7〜11時間静置します。クロロキンによって細胞が非常に感作されているため、また、この時間の後に培地交換を行う必要があるため、7時間以上11時間以内としてください。これで、トランスフェクション後約30時間が経過したことになります。これで培地の交換は最後となります。2 9 3 C3 T 細胞がコンフルエントに達しました。ここでも、新しい培地をプレートの端から添加する際は、非常に慎重に行う必要があります。ここでは、針を付けた 10 ml シリンジを使用しています。針をフィルターに交換します。そのため、この時点で培地をよく混ぜ合わせます。回収したウイルスは、使用するまで-80°Cで保存することが可能です。最初に行うのは、ウイルスのタイターを調整することです。ウイルス作製にはいくつかの繊細な工程があり、その最初のステップが293T細胞の適切な濃度調整です。18時間後に約80%のコンフルエントになるよう、1プレートあたり3×10⁶個の細胞を播種します。これにより細胞がさらに増殖する時間が確保されるため、トランスフェクションから24時間後には100%コンフルエントになります。これは、優れたウイルスタイターを得るために非常に重要であることが示されています。次のステップはクロロキンを使用することです。実際にクロロキンを使用することで2 9 3細胞が感作されます。また、2 9 3 T細胞のシート全体がプレートから剥がれないよう、培地交換はすべて非常に緩やかに行う必要があります。最後に、ウイルス作製に使用するDNAは極めてクリーンである必要があります。本手順では、Cs帯分画されたDNAを使用しています。ウイルスを調製した後、-80°Cで保存します。通常、ウイルスのタイターは凍結融解を繰り返すと2回につき低下するため、実際のタイター測定を行う前に、あらかじめウイルスを凍結保存しておきます。ウイルスによって、実際に感染した細胞を追跡するためのGFP発現を伴うものか、あるいはネオマイシン耐性を持つもののいずれかを使用します。また、実験間や異なる変異体間での条件を合わせるため、使用前にウイルスのタイターを正確に把握しておくことが非常に重要です。

production-replication-defective-retrovirus-transient-transfection

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

レンチウイルスを作成するには、DNAベクターは、ヒト293細胞にトランスフェクトされています。収穫後、上清を濃縮し、ウイルス力価は、フローサイトメーターと蛍光式によって決定されます。...

レンチウイルスの生産

レンチウイルスは、遺伝子機能を探索するための貴重な研究ツールですが、研究者は、既知または疑われる癌遺伝子をコードしてパントロピックレンチウイルスの産生を回避する場合があります。別の方法として、我々はエコトロピック受容体mSlc7a1を表現するように修正ヒト細胞でのエコトロピックレンチウイルスの使用のためのより安全なプロトコルを提示する。...

強化されたバイオセーフティのためのポリマー複合エコトロピックレンチウイルスによるヒト細胞のトランスダクション

このプロトコルでは、生産、精製、およびレンチウイルスベクターの滴定について説明します。我々は初代培養神経細胞やアストロサイトにおけるレンチウイルスベクターによる遺伝子送達の例を示します。私たちの方法は、他の細胞型にも適用される場合があります...

中枢神経系から細胞を変換するためのレンチウイルスベクターの生産

RNA干渉（RNAi）は遺伝子ノックアウトよりも多くの利点を有し、広範に遺伝子機能研究のツールと​​して使用されています。...

癌における遺伝子機能を研究するDNAベクターベースのRNA干渉

ここでは、レトロウイルス形質導入およびテトラサイクリンの不存在下でレンチウイルスベクター（LV）の成分を発現できる細胞株を作成するためのコンカテマートランスフェクションを使用する。このLVは、GFPをコードし、樹状細胞上の受容体に特異的な糖タンパク質、SVGmuと偽されています。...

テトラサイクリン調節細胞株は、具体的に樹状細胞を標的とする高力価レンチウイルスベクターを生成

CRISPR / Cas9システムは、科学界にターゲットを絞ったゲノム編集がアクセス可能で、手頃な価格にする可能性を提供しています。このプロトコルは、CRISPR / Cas9システムを使用して、目的の遺伝子をノックアウトしてから、成体マウスの脳に定位的にそれらを注入するウイルスを作成する方法を実証することを意図しています。...

デザイン、パッケージング、および定位注射を介して高力価CRISPRレトロウイルスおよびレンチウイルスの配信

感染した細胞のゲノムDNAからレトロウイルス統合部位を増幅し、増幅されたウイルス-宿主ジャンクションを配列決定し、次にこれらの配列を参照ゲノムにマッピングするためのプロトコルを記述します。また、BEDToolsを使用して、さまざまなゲノムアノテーションに対する統合部位の分布を定量化する手法についても説明します。...

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

ここでは、Tfap2c、Gata3、Eomes、Ets2の10日間の過剰発現により、マウス胚性線維芽細胞を完全に機能的で安定した栄養膜幹細胞に直接変換するためのプロトコルを紹介します。...

栄養膜幹細胞へのマウス胚性線維芽細胞の直接変換するためのプロトコル

我々は、細胞有効性の注入研究のために十分な数の目的の遺伝子の優れた共発現を有する細胞を得るアカゲザル末梢血単核細胞の導入及び拡張のための9日間のプロトコルを概説する。...

中央記憶表現型の維持による9日間の主要T細胞の導入と拡張

この原稿では、最適化されたヘパリンベースのアフィニティークロマトグラフィー法を使用して、アデノ随伴ウイルスベクターを生成および精製するための詳細なプロトコルについて説明します。シンプルでスケーラブル、かつ費用対効果の高いアプローチを提供し、超遠心分離の必要性を排除します。得られたベクターは、高い純度と生物学的活性を示し、前臨床試験でその価値を証明しています。...

シングルステップおよび半自動ヘパリンアフィニティークロマトグラフィープロトコルによるアデノ随伴ウイルスベクターの単離

学ぶ 293T細胞を用いた一過性トランスフェクションによる複製欠損レトロウイルス製造法。ヒトオncogeneを導入しマウス骨髄増殖性疾患モデルを構築する実験手法を解説します。

293T細胞の一過性トランスフェクションにより、複製欠損レトロウイルスの生産

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