293T細胞の一過性トランスフェクションにより、複製欠損レトロウイルスの生産

私たちは、タフツ・ニューイングランド医療センターの分子腫瘍学研究所にいます。私はChristina Lescoで、Rick Van博士の研究室の博士研究員です。私たちの研究室では、ヒトの免疫原性白血病、CML、およびCML様疾患の研究に取り組んでいます。

私たちは、レトロウイルスベクターを用いてヒトの癌遺伝子を導入することで、このヒト疾患をマウスでモデル化しています。したがって、このヒト癌遺伝子をマウス細胞に導入するために最初に行うべきことは、ウイルス自体を作製することです。次に、実際にウイルスをタイト化（濃縮）します。

こちらがストックの2 9 3 T細胞のプレートです。まず、培地をPBSで洗浄します。2 9 3 T細胞は接着性細胞ですが、接着力はそれほど強くないため、あらゆる操作を非常に穏やかに行う必要があります。洗浄後、PBSをトリプシンに置き換えます。

細胞をプレートから回収するため、プレートを約3分間インキュベーターに戻します。2〜3分後、細胞は実際に懸濁状態になります。ここに通常の培地をさらに数mL加えます。

これによりトリプシンを不活性化します。この時点で、すべての細胞が適切に懸濁していることを確認するために、上下にピペッティングを行います。懸濁液を50 mlチューブに移し、トリパンブルーを用いて細胞数を測定し、血球計数器で手動でカウントします。計算に基づいた希釈を行い、1プレートあたり3×10⁶個の細胞を播種します。

4 mLの培地を用い、細胞が適切にプレートに播種されていることを確認した後、プレートをインキュベーターに戻し、通常は翌朝にあたる16〜18時間静置します。これでGFPウイルスの感染から48時間が経過したことになります。クロロキンは、細胞に導入するDNAの取り込み効率を高めるために使用します。

プレートの端から静かに培地を吸引し、細胞を除去します。細胞はすでにプレートに接着しています。この後、プレートをインキュベーターに戻し、約1時間静置します。その間に、細胞に導入するためのDNA混合液を調製します。一つはネオマイシン耐性遺伝子を発現するもの、もう一つはGFPを発現するものです。また、トランスフェクション全体のコントロールとしてXI DNAを使用します。

最後に、塩化カルシウムを加えます。塩化カルシウムを使用することで、トランスフェクション効率が大幅に向上します。1時間後、クロロキン含有培地を入れたプレートを用意し、ここにトランスフェクション溶液を加えます。

最後のステップは、2x sterile HBSを1 ml添加することです。2x HBS溶液を加えながら、同時にチューブをボルテックスし、ゆっくりと1滴ずつ滴下します。これは沈殿を防ぐためです。直ちに、目的のプレートに1 mlの溶液を、同様に1滴ずつ分配します。

この時点で、2 9 3 T細胞はかなり感作されています。これは、クロロキンを含む培地を使用しているためです。すべての領域をカバーし、プレートの移動を最小限に抑える必要があります。導入した構築物の名称をプレートに記載し、次の構築物についても同様の手順を繰り返してください。

この時点で、プレートをインキュベーターに戻し、7〜11時間静置します。クロロキンによって細胞が非常に感作されているため、また、この時間の後に培地交換を行う必要があるため、7時間以上11時間以内としてください。これで、トランスフェクション後約30時間が経過したことになります。

これで培地の交換は最後となります。2 9 3 C3 T 細胞がコンフルエントに達しました。ここでも、新しい培地をプレートの端から添加する際は、非常に慎重に行う必要があります。ここでは、針を付けた 10 ml シリンジを使用しています。

針をフィルターに交換します。そのため、この時点で培地をよく混ぜ合わせます。回収したウイルスは、使用するまで-80°Cで保存することが可能です。最初に行うのは、ウイルスのタイターを調整することです。ウイルス作製にはいくつかの繊細な工程があり、その最初のステップが293T細胞の適切な濃度調整です。

18時間後に約80%のコンフルエントになるよう、1プレートあたり3×10⁶個の細胞を播種します。これにより細胞がさらに増殖する時間が確保されるため、トランスフェクションから24時間後には100%コンフルエントになります。これは、優れたウイルスタイターを得るために非常に重要であることが示されています。

次のステップはクロロキンを使用することです。実際にクロロキンを使用することで2 9 3細胞が感作されます。また、2 9 3 T細胞のシート全体がプレートから剥がれないよう、培地交換はすべて非常に緩やかに行う必要があります。最後に、ウイルス作製に使用するDNAは極めてクリーンである必要があります。本手順では、Cs帯分画されたDNAを使用しています。

ウイルスを調製した後、-80°Cで保存します。通常、ウイルスのタイターは凍結融解を繰り返すと2回につき低下するため、実際のタイター測定を行う前に、あらかじめウイルスを凍結保存しておきます。

ウイルスによって、実際に感染した細胞を追跡するためのGFP発現を伴うものか、あるいはネオマイシン耐性を持つもののいずれかを使用します。また、実験間や異なる変異体間での条件を合わせるため、使用前にウイルスのタイターを正確に把握しておくことが非常に重要です。