ショウジョウバエの調製と光コヒーレンス顕微鏡を用いてin vivoで心機能の縦イメージング（OCM）

この手順の全体的な目標は、光コヒーレンス顕微鏡技術を使用して、ショウジョウバエの心臓機能をin vivoで縦方向にイメージングすることです。この方法は、ショウジョウバエの心臓の直径、心拍数、ショウジョウバエの変態中の心臓活動期間の変化などの指標を提供することにより、ショウジョウバエの心臓の構造的および機能的発達の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、光コヒーレンス顕微鏡が、高い空間的および時間的分解能で小動物の心臓を非侵襲的にイメージングできることです。

この技術は、ヒトの心臓病のメカニズムと、ショウジョウバエと脊椎動物の間に存在する遺伝的類似性による心臓発生との関係を明らかにするのに役立つ可能性があります。この方法は、動物モデルでペースメーカー機能の低下を研究または治療するための光遺伝学的ペーシングなど、他のシステムにも適用できます。この実験のためにハエを作製するときは、生殖親のハエが交尾し、新鮮なバイアルに8時間卵を産むのを待ちます。

したがって、産まれた卵のクラッチは、同様の年齢のハエに成長します。OCMイメージング用の幼虫をマウントするには、まず両面テープできれいな面を準備します。テープの下に閉じ込められた気泡を押し出します。

次に、柔らかいブラシを使用して、バイアルから適切なサイズの幼虫を取り出します。幼虫をきれいなティッシュの上に置きます。湿らせたブラシで付着した食品を取り除き、乾かします。

次に、広視野顕微鏡で、幼虫の発育段階を確認します。次に、背側を上に向けて幼虫を配置して取り付けます。次に、粘着性のあるスライドを幼虫の上に下げ、適度な圧力でテープに固定します。

取り付けられた幼虫を、背側を上に向けて、y横方向に沿ってOCMシステムの調整可能なステージに置きます。ステージの小さな穴は、幼虫がステージ平面に接触するのを防ぎます。心臓管の広い内腔は、セグメントA5からA8まで見られます。コンピューター上のリアルタイム画像を使用して、心臓管の後部領域を見つけ、A7セグメントが表示されるまでステージを前方に移動します。

次に、画像取得のパラメータを設定します。B-スキャンごとに100回のA-スキャンを使用し、100回のB-スキャンを使用します。次に、スキャナーの電圧をx方向に約0.28ミリメートルをカバーするように設定し、y方向に0ボルトに設定します。

次に、サンプルビームの経路を暗い布でブロックし、ソフトウェアの開始ボタンをクリックして、バックグラウンド減算用のバックグラウンドノイズデータを取得します。横方向のMモード画像を収集するには、パラメータをBスキャンごとに128 Aスキャンに調整し、4, 096 Bスキャンを使用します。次に、電圧を再調整して、前と同じようにx方向に0.28ミリメートル、y方向に0ボルトをカバーします。

次に、ハエ心臓管のA7セグメントの横方向Mモードで画像を取得します。データ保存プロセスでは、サンプル試料への光の露出を最小限に抑えるために、イメージングビームを暗い布でブロックします。心臓を5回画像化して、心臓機能の信頼性の高い測定値を取得します。

3次元画像を収集するには、Bスキャンごとに400回のAスキャン、800回のBスキャンを使用し、x横で1.7ミリメートル、y横で約4ミリメートルの電圧を使用します。次に、顕微鏡ステージを動かしてフライ全体を観察し、ピントを調整して鮮明な画像を表示します。幼虫を取り除くには、濡れた柔らかいブラシを使用して、生鮮食品を入れた新しいバイアルに移し、継続的な発育と縦断的研究を行います。

心臓管の広い内腔は、蛹期PD1のセグメントA5からA8に残ります。PD1では、L2およびL3ステージの幼虫で行われたように、A7セグメントをイメージングするよう努めます。PD1蛹期は、白い蛹によって識別されます。

この時間枠は、透明度が高いため、OCMイメージングの光透過性が高くなるため、初期の蛹の光学イメージングを実行するのに理想的です。体に食べ物が付着している場合は、ブラシで蛹をきれいにします。濡れたブラシを使用して、蛹を小さなスライドガラスに取り付け、背側を上に向けておきます。

スライドは、それ自体の部屋で動物の発達を維持するためにフライチューブに収まるべきです。蛹から余分な水分を乾かし、蛹を上に向けてステージに置き、幼虫の場合と同様にA7セグメントの画像化に進みます。イメージング後、蛹と一緒にスライドガラスをチューブに移し、連続培養を行います。

PD1段階の後、PD2から始まり、A1セグメントとA4セグメントの間に円錐形のチャンバーが発達し始めます。蛹は徐々に不透明になるため、イメージングシステムの浸透深さは減少します。PD2では、蛹の殻が黄色っぽくなり、PD1よりも体の透明度が低くなります。

PD3では、蛹の色はPD2ステージの色よりも少し暗いです。PD4の段階では、シェルの内側に黒い縞模様が観察できます。一部のPD4は成体に成長し、他のPD4はPD5の段階に入ります。

PD5の段階では、黒い縞模様がさらに目立ちます。ピンセットを使用してPD2の蛹を拾い上げ、スライドに取り付けます。OCMシステムでは、心臓管の前端を見つけ、次に後部に向かって約50ミクロン移動して、心臓管のA1セグメントを見つけます。

PD2段階では、心臓の円錐形の心室は非常に小さく、まだ鼓動していない可能性があることに注意してください。前述のようにイメージングを続行します。PD3、PD4、およびPD5ステージでショウジョウバエをイメージングする場合も同じ手順を繰り返します。

まず、成虫のハエを約45ミリリットルの容量の空のバイアルに移します。次に、綿のアプリケーターを麻酔溶液に浸し、綿の先端を綿のストッパーのすぐ下にして、ワンドをバイアルに入れます。3 分間待ちます。

成虫のハエは、そのサイズにもよりますが、2分半から3分半の間麻酔されます。次に、両面テープでスライドガラスを準備します。次に、柔らかいブラシを使用して、麻酔をかけたフライを背側を上に向けてスライドガラスの上に移動します。

広視野顕微鏡でピンセットで翼を分離し、テープに貼り付けて、イメージングのために心臓領域を露出させます。次に、前述のイメージング技術を使用して、心臓のA1セグメントをイメージングし、実験の最後にハエを犠牲にします。縦断的心臓イメージングは、24B-GAL4ドライバーの1つのコピーを持つストレインフライを使用して実施されました。

幼虫期では、心臓管は後腹部領域A8から始まり、内腔が広くなり、直径が狭い前背側セグメントA1で終わります。PD2の後半、A1からA4のセグメントで円錐形のチャンバーが発達し始めました。フライの心拍数は、横方向のMモードOCM画像から定量化されました。

不思議なことに、蛹の段階では、心臓の鼓動が時々止まりました。全体として、心拍は幼虫期から蛹期にかけて大幅に遅くなり、その後、蛹から成虫にかけて大幅に増加しました。この開発以来、この技術は、発生心臓病学の分野の研究者に、ショウジョウバエモデルの心臓発達に対するさまざまな遺伝子の影響を調査するための新しいツールを提供しました。

この手順を試みる際には、各発達段階で画像を作成するために、ショウジョウバエの発達を注意深く追跡することが重要です。