Name: 定量的トランスクリプトーム解析に使用するための種子から高度に精製されたRNAの単離のための効率的な方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: 学ぶ スピンカラム法を改良した植物種子からの高純度RNA抽出法。油脂・ポリフェノールを含む試料から定量トランスクリプトーム解析に適したRNAを単離し、シリアル生物学における遺伝子発現研究を支援します。

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私たちは、ゲノム機能施設と分光とバイオイメージング施設、基生研中核研究施設、およびモデル植物研究施設、基生研バイオリソースセンターのスタッフに感謝します。

植物の種子からの全RNAの1の抽出<ol><li>バッファセット、スピンカラム、1.5および2.0 mLのポリプロピレンチューブ、およびヌクレアーゼフリー1.5 mLのポリプロピレンチューブを準備します。 </li><li> RNA抽出、激しくボルテックスするための溶解緩衝液をセルに（以下、PVPという）分子生物学グレードのポリビニルピロリドン（w / v）の1％を加えます。完全に溶解するために25℃で20分間インキュベートします。 20分間のインキュベーション後、気泡の形成を防止するために逆さまにチューブを回転させることによって穏やかにバッファーを混合します。使用前に室温（15~25℃）で保管してください。 </li><li>氷上で1.5 mLのポリプロピレンチューブ中のシロイヌナズナと場所から収穫果物。アルミプレート上に果物を置き、4℃で維持し、実体顕微鏡下で果実から種子を分離します。 <ol><li>氷の上にアルミラックに格納され、直ちに液体窒素中にチューブを配置された1.5 mLのポリプロピレンチューブに分離された種子（約200種を）置きますitrogen。 </li></ol></li><li>液体窒素からチューブを外して、氷の上にアルミニウムラックに戻します。 4℃で千×gで1分間、1％のPVPと遠心分離機を含む緩衝液100μLを加えます。 </li><li>氷の上にアルミラックにチューブを保持したまま60秒間モーターグラインダーを使用して、ステンレス製の乳棒でサンプルをホモジナイズします。 </li><li> 1％のPVPを含有する緩衝液550μLを加える逆さまチューブを回して穏やかにバッファーを混合し、25℃で10分間インキュベートします。 </li><li> 25℃で8000×gで5分間遠心し、新しい1.5 mLのポリプロピレンチューブに上清550μLを移します。 </li><li> 25°C 10,000×gで5分間遠心し、新しい1.5 mLのポリプロピレンチューブに上清450μLを移します。 </li><li> RNA抽出のための細胞溶解液として上清を使用してください。以下では、市販のキットには、メーカーの説明書に記載の手順に従ってください。 </li><li>溶出低レベルの転写物の発現パターンをモニターするためのRNAの十分に高い濃度を確実にするために、溶出緩衝液の最小量を使用してRNA。使用するまでディープフリーザーでRNAを保管してください。 </li></ol> RNAの品質の2.確認<ol><li> 、全RNAを解凍穏やかなタッピングによって混合し、氷上でアルミラックにチューブを配置します。 </li><li>微量分光光度計を用いてRNA濃度、A260 / A280比、およびA260 / A230比を測定します。 </li><li> 70 ngの/μLの最終濃度になるようにRNaseフリー水で全RNAを希釈します。 </li></ol>種子からの全RNAの3逆転写<ol><li>市販のキットから全RNAおよびバッファセットを解凍します。穏やかなタッピングした後、氷上でキットからの酵素を保管してください。ヌクレアーゼフリー0.2 mlのポリプロピレンチューブを準備します。 </li><li> 0.2 mLのpolypropyに全RNAの5μL、オリゴdTプライマーの1μL（50μM）、およびランダム6量体の1μM（50μM）を追加氷上のレンチューブ。 </li><li> 37ºCで15分間インキュベートし、氷上に置きます。 </li><li>以下は、逆転写PCRキットで、製造業者の説明書に記載されている手順に従ってください。 </li><li>使用前に氷上で逆転写産物を置きます。 </li></ol> 4.定量的リアルタイムPCR解析<ol><li>製造業者のプロトコルを使用して、標的遺伝子配列を保有するプラスミドを構築します。 </li><li>標準曲線のためのDNAテンプレートの100-500,000コピー/μLに濃度を調整します。 </li><li>蒸留水で：（100 1）のcDNAのソリューションを希釈します。 </li><li>定量的リアルタイムPCRキットからマスターミックスに希釈したcDNA溶液及び標準曲線のためのプラスミドの2μLを追加します。 </li><li> 35秒30秒95℃をした後、5秒、95℃で40サイクル、60℃：以下のサイクリング条件を用いてリアルタイムPCRを設定します。 </li><li>男に従ってコピー数を分析リアルタイムPCRシステム用のufacturerの指示。 </li></ol>

<ol><li>Hills, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+storage-product+synthesis+in+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of storage-product synthesis in seeds.</a> Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).</li>
<li>Li-Beisson, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acyl-lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Acyl-lipid metabolism.</a> Arabidopsis Book. 11, e0161(2013).</li>
<li>Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+pathways+in+seed+oil+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical pathways in seed oil synthesis.</a> Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).</li>
<li>Santos-Mendoza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+gene+regulatory+networks+that+control+seed+development+and+maturation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis.</a> Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).</li>
<li>Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+triacylglycerols+as+feedstocks+for+the+production+of+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).</li>
<li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Plastidic+DEAD-box+RNA+helicase+22%2C+HS3%2C+is+essential+for+plastid+functions+both+in+seed+development+and+in+seedling+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth.</a> Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).</li>
<li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+oil+biosynthesis+during+the+mid-phase+of+seed+development+enhances+oil+content+in+Arabidopsis+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds.</a> Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).</li>
<li>Dekkers, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+reference+genes+for+RT-qPCR+expression+analysis+in+Arabidopsis+and+tomato+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds.</a> Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).</li>
<li>Salzman, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+RNA+isolation+method+for+plant+tissues+containing+high+levels+of+phenolic+compounds+or+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates.</a> Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).</li>
<li>Vicient, C. M., Delseny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+total+RNA+from+Arabidopsis+thaliana+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds.</a> Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).</li>
<li>Wang, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high+quality+RNA+from+cereal+seeds+containing+high+levels+of+starch%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem+Analysis%22%5BJournal%5D)">Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch.</a> Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).</li>
<li>Birtic, S., Kranner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-quality+RNA+from+polyphenol-%2C+polysaccharide-+and+lipid-rich+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem+Analysis%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds.</a> Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

遺伝子発現プロファイルは、植物生理学の我々の理解に貢献します。従って、特定のRNAの単離方法は、各サンプル条件9-12のために開発されています。我々は、種子からのRNA単離の間に抑制されたプロセスを調査し、RNAをシリカ膜への結合が厳しく抑制されたことがわかりました。油、タンパク質、およびポリフェノールの大量のRNA単離を阻害します。我々は、RNAはシリカ膜に結合する工程の前に、溶解溶液でこれらの化合物を除去するために、RNA抽出過程を改変しました。重要な修飾は、1％のPVP（ステップ1.2）、遠心分離、溶解液からの上清の収集（1.7、1.8ステップ）の添加を含みました。 1％のPVPの添加の目的は、ポリフェノールを除去することです。我々が使用するPVPの最も効果的な濃度を検討し、1％のPVPがこのプロセスのための最も有効な濃度であることが確認されました。遠心分離した溶解液から上清を収集する目的油およびタンパク質を除去することです。上清は、上清中の油層とチューブ内のペレットを保持しないように注意してください収集する必要があります。これらの2つの簡単な修正が大幅に中央で種子や開発の後期段階（ 表1）<...

植物は、次の世代を生じる種子を生産します。種子は、ポスト発芽成長のために、そのような油、炭水化物、およびタンパク質などの貯蔵物質、大量に蓄積します。人間は食品や動物飼料の供給源として種子貯蔵準備金を活用し、ひいては植物の種子は、世界的に食用有機物の主要なサプライヤの一つです。種子の収量を増加させると、植物科学における重要な課題です。 種子貯蔵物質が食品や工業材料の商業的に価値のある情報源であるため、これらの引当金の代謝の調節の根底にある分子メカニズムは、広く1-6を検討されています。さらに、これらのメカニズムを解明することは、作物種子収量を増加させるために有用であろう。種子は受精後植物卵巣で開発し、それらは発達段階1,6,7の一連の成熟します。さらに分子機構根底にある種子の開発を理解することは、詳細が必要です種子を開発する一連の正確な遺伝子発現プロファイルが生成されます。しかし、油、タンパク質、炭水化物、および植物種子中のポリフェノールの高い量は、それが困難な遺伝子発現の正確なプロファイリングを排除する高度に精製されたRNAを単離することを可能にします。 ここでは、油、タンパク質、およびポリフェノールを多く含む油糧種子からのRNAの単離のための効率的な方法を紹介します。この方法を使用して、研究者らは、高度に精製されたRNAを調製することができるであろう。このようなRNAは、開発および成熟脂肪種子における種子貯蔵物質の代謝調節を制御する重要な遺伝子で転写変化をモニタリングするために有用であろう。

<table><tbody><tr><td>RNeasy Plant Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>polyvinylpyrrolidone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5288-100G</td><td></td></tr><tr><td>ホモジナイザー S-303</td><td>AS ONE</td><td>1-1133-02</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Lite</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-NDL-US-CAN</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)</td><td>TAKARA</td><td>RR037A</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR高速リアルタイムqPCRキット</td><td>Kapa biosystems</td><td>KK4601</td><td></td></tr></tbody></table>

定量的トランスクリプトーム解析に使用するための種子から高度に精製されたrnaの単離のための効率的な方法

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

植物の種子は、生分解性の有機物を含む大量の貯蔵蓄えを蓄積します。人間は、食料や工業材料として種子貯蔵庫に依存しています。遺伝子発現プロファイルは、植物細胞の代謝制御を研究するための強力なツールです。そのため、作物の育種には、種子開発における詳細で正確な遺伝子発現プロファイルが必要です。これらのプロファイルを作成するためには、高度に精製されたRNAを取得することが不可欠です。高度に精製されたRNAを種子から単離するには、効率的な方法が必要です。ここでは、高純度RNAの単離に阻害効果を持つ油脂、タンパク質、ポリフェノールを多く含むシーズからRNAを単離する方法について述べます。私たちの方法は、フェノール、クロロホルム、またはRNA精製のための追加のプロセスを使用せずに、種子から高度に精製されたRNAを得ることを可能にします。この方法は、シロイヌナズナ、菜種、および大豆種子に適用できます。本手法は、発生中の種子や成熟した種子における低レベル転写産物の発現パターンのモニタリングに役立ちます。

我々は最初のシロイヌナズナ完熟種子を用いて、PVPの最適濃度を調べました。全RNAを、0％、0.25％、0.5％、1.0％または2.0％のPVPを含有する細胞溶解緩衝液を用いて、上記のプロトコルに従って約1,000種から単離しました。油層と種子の破片（ 図1A）を回避しながら、ホモジナイズし、遠心分離後、上清を回収しました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55008/55008fig1.jpg" /> 図1： 細胞溶解緩衝液中で最適なポリビニルピロリドン濃度の推定。総RNAは、PVPの異なる濃度を含有する細胞溶解緩衝液で抽出しました。 （A）ホモジナイズし、遠心分離後の種子の写真。 （B）各サンプルについて、波長...

高純度のRNA単離に対する阻害効果を持つ油分、タンパク質、ポリフェノールを多く含む植物種子からのRNA単離方法を確立することに成功しました。私たちの方法は、シード中の低レベルの転写産物を持つ遺伝子の発現を監視するのに適しています。

定量的トランスクリプトーム解析に使用するための種子から高度に精製されたRNAの単離のための効率的な方法

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

この手順の全体的な目標は、植物の種子から高純度のRNAを抽出することです。この方法は、種子に元の転写産物を含む遺伝子プロファイルの理解など、穀物生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、研究者がスピンカラムベースの方法にわずかな変更を加えて高精製RNAを調製できることです。一般に、この方法に不慣れな人は、フロントシーブに大量の油、タンパク質、炭水化物、ポリフェノールが含まれているため、高度に精製されたRNAを分離するのが困難になるため、苦労するでしょう。その手順を実演していただくのは、当研究室の技術者である引野和美さんです。実験を開始するには、RNA抽出用の細胞溶解バッファーに分子生物学グレードのPVPを1体積あたり1%の重量を加え、混合物を激しくボルテックスします。PVPを摂氏25度で20分間インキュベートして、完全に溶解します。20分間のインキュベーション後、気泡が形成されないようにチューブを逆さまにして緩やかに混合します。シロイヌナズナの植物から果実を収穫し、氷上の1.5mmポリプロピレンチューブ2本に入れ、摂氏4度に保たれたアルミニウム板に果実を置き、実体顕微鏡で果実から種子を分離します。次に、分離された約200個の種子を、以前に氷上のアルミニウムラックに保管していた1.5ミリリットルのポリプロピレンチューブに入れ、すぐにチューブを液体窒素に入れます。液体窒素からチューブを取り外し、氷の上のアルミニウムラックに戻します。1%のPVPバッファーを各チューブに100マイクロリットル加え、チューブをGの1000倍、摂氏4度で1分間遠心分離します。遠心分離後、チューブを氷上のアルミニウムラックに保ちながら、モーターグラインダーを使用してステンレス鋼の乳棒でサンプルを60秒間均質化します。次に、550マイクロリットルの100%PVPバッファーを追加し、チューブを静かに逆さまにしてチューブを混合してインキュベートします。インキュベーション後、溶液を遠心分離し、上清550マイクロリットルを新しい1.5ミリメートルポリプロピレンチューブに移し、上清を遠心分離します。上清の450マイクロリットルを新しい1.5ミリメートルポリプロピレンチューブに移します。上清を細胞溶解物として、市販のキットを用いてRNA抽出を行います。氷の上にアルミニウム製のラックを用意し、全RNAミックスを軽くたたいて解凍し、チューブをラックの上に置きます。微量分光光度計を使用してRNA濃度を測定します。次に、全RNAをRNaseフリー水で希釈します。市販のキットから全RNAとバッファーセットを解凍し、軽くたたいた後、キットの酵素を氷上に保ちます。滅菌したヌクレアーゼフリーの0.2ミリリットルポリプロピレンチューブを調製し、その後の分析に備えます。氷上で、5マイクロリットルの全RNA、1マイクロリットルまたは50マイクロモルのオリゴDTプライマー、および1マイクロリットルまたは50マイクロモルのランダム6量体を0.2ミリリットルのポリプロピレンチューブに組み合わせます。混合物を摂氏37度で15分間インキュベートし、次にチューブを氷の上に置きます。DNAテンプレートのプラスミド濃度を標準曲線に合わせて調整します。次に、CDNA溶液を蒸留水で1〜100に希釈し、希釈したCDNA溶液と事前に調製した標準曲線用のプラスミドを2マイクロリットルで、定量リアルタイムPCRキットのマスターミックスに加えます。最後に、リアルタイムPCRをセットアップし、サンプルを挿入します。全RNAは、さまざまな濃度の細胞溶解バッファーPVPを使用して、約1,000シードから単離されました。単離されたRNAの量と純度は、1.0%PVPがシードから大量の精製RNAを単離するのに最も効果的な濃度であることを示しています。200種子から単離されたRNAの濃度、A260およびA280比、およびA260 A230比は、この方法が開花後8日および12日後の高度に精製されたRNA、またはDAF種子を単離するのに最も適していることを示しました。シワのあるものと糖依存性の転写産物の量は、発育中の種子では比較的少ないですが、リアルタイムPCRを介して、異なる発生段階での種子間の発現変化を検出することができました。この方法は、この表に示すように、他の油糧種子にも適しています。この技術は、その開発後、植物生物学の分野の研究者が、種子や果実などの高濃度の保存された埋蔵量での遺伝子発現プロファイルを探索する道を開きました。

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