定量的トランスクリプトーム解析に使用するための種子から高度に精製されたRNAの単離のための効率的な方法

この手順の全体的な目標は、植物の種子から高純度のRNAを抽出することです。この方法は、種子に元の転写産物を含む遺伝子プロファイルの理解など、穀物生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、研究者がスピンカラムベースの方法にわずかな変更を加えて高精製RNAを調製できることです。

一般に、この方法に不慣れな人は、フロントシーブに大量の油、タンパク質、炭水化物、ポリフェノールが含まれているため、高度に精製されたRNAを分離するのが困難になるため、苦労するでしょう。その手順を実演していただくのは、当研究室の技術者である引野和美さんです。実験を開始するには、RNA抽出用の細胞溶解バッファーに分子生物学グレードのPVPを1体積あたり1%の重量を加え、混合物を激しくボルテックスします。PVPを摂氏25度で20分間インキュベートして、完全に溶解します。

20分間のインキュベーション後、気泡が形成されないようにチューブを逆さまにして緩やかに混合します。シロイヌナズナの植物から果実を収穫し、氷上の1.5mmポリプロピレンチューブ2本に入れ、摂氏4度に保たれたアルミニウム板に果実を置き、実体顕微鏡で果実から種子を分離します。次に、分離された約200個の種子を、以前に氷上のアルミニウムラックに保管していた1.5ミリリットルのポリプロピレンチューブに入れ、すぐにチューブを液体窒素に入れます。

液体窒素からチューブを取り外し、氷の上のアルミニウムラックに戻します。1%のPVPバッファーを各チューブに100マイクロリットル加え、チューブをGの1000倍、摂氏4度で1分間遠心分離します。遠心分離後、チューブを氷上のアルミニウムラックに保ちながら、モーターグラインダーを使用してステンレス鋼の乳棒でサンプルを60秒間均質化します。次に、550マイクロリットルの100%PVPバッファーを追加し、チューブを静かに逆さまにしてチューブを混合してインキュベートします。

インキュベーション後、溶液を遠心分離し、上清550マイクロリットルを新しい1.5ミリメートルポリプロピレンチューブに移し、上清を遠心分離します。上清の450マイクロリットルを新しい1.5ミリメートルポリプロピレンチューブに移します。上清を細胞溶解物として、市販のキットを用いてRNA抽出を行います。

氷の上にアルミニウム製のラックを用意し、全RNAミックスを軽くたたいて解凍し、チューブをラックの上に置きます。微量分光光度計を使用してRNA濃度を測定します。次に、全RNAをRNaseフリー水で希釈します。

市販のキットから全RNAとバッファーセットを解凍し、軽くたたいた後、キットの酵素を氷上に保ちます。滅菌したヌクレアーゼフリーの0.2ミリリットルポリプロピレンチューブを調製し、その後の分析に備えます。氷上で、5マイクロリットルの全RNA、1マイクロリットルまたは50マイクロモルのオリゴDTプライマー、および1マイクロリットルまたは50マイクロモルのランダム6量体を0.2ミリリットルのポリプロピレンチューブに組み合わせます。

混合物を摂氏37度で15分間インキュベートし、次にチューブを氷の上に置きます。DNAテンプレートのプラスミド濃度を標準曲線に合わせて調整します。次に、CDNA溶液を蒸留水で1〜100に希釈し、希釈したCDNA溶液と事前に調製した標準曲線用のプラスミドを2マイクロリットルで、定量リアルタイムPCRキットのマスターミックスに加えます。

最後に、リアルタイムPCRをセットアップし、サンプルを挿入します。全RNAは、さまざまな濃度の細胞溶解バッファーPVPを使用して、約1,000シードから単離されました。単離されたRNAの量と純度は、1.0%PVPがシードから大量の精製RNAを単離するのに最も効果的な濃度であることを示しています。

200種子から単離されたRNAの濃度、A260およびA280比、およびA260 A230比は、この方法が開花後8日および12日後の高度に精製されたRNA、またはDAF種子を単離するのに最も適していることを示しました。シワのあるものと糖依存性の転写産物の量は、発育中の種子では比較的少ないですが、リアルタイムPCRを介して、異なる発生段階での種子間の発現変化を検出することができました。この方法は、この表に示すように、他の油糧種子にも適しています。この技術は、その開発後、植物生物学の分野の研究者が、種子や果実などの高濃度の保存された埋蔵量での遺伝子発現プロファイルを探索する道を開きました。