CyVerseリソースの活用デ・ノヴォ保存されていない（非モデル）生物の比較トランスクリプトーム

この手順の全体的な目標は、生のFASTQファイルから開始して、De Novoトランスクリプトミクスを通じて差次的遺伝子発現を評価、アセンブル、アノテーション、比較することです。この方法は、どの転写産物が生物の内部にあるのか、それらの転写産物がそれらの生物の内部で何をしているのか、実験条件間の違いは何かなど、比較生物学および分子生物学の質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、対話型環境を提供することです。

オンデマンドの計算リソースを提供し、研究者はRNA-Seqデータの解析をすぐに開始できます。この方法は、複数の組織、条件、時点を含む単一の生物内の実験を比較して、生物学的システムがどのように変化するかを理解する研究者に特に役立ちます。この方法は、ゲノムを持たない非モデル生物に焦点を当てていますが、ゲノムアセンブリが利用可能な生物、さらにはそのアセンブリに数万または数十万の足場を持つ生物にも適用できます。

まず、ディスカバリー環境でアトモスフィアにアクセスします。登録ページに移動して、無料のCyVerseアカウントをリクエストします。機関の電子メールを使用して、アカウントに登録します。

次に、[アプリとサービス] タブに移動し、Atmosphere へのアクセスをリクエストします。Discovery Environment へのアクセスは自動的に付与されます。Discovery Environment(DEと略記)にログインします。次に、[データ] タブを選択して、データ ストア内のすべてのフォルダーを含むメニューを表示します。

プロジェクトに関連付けられたすべてのデータを格納するメイン プロジェクト フォルダーを作成します。データ ウィンドウの上部にあるツールバーを見つけて、[ファイル]、[新しいフォルダー] の順に選択します。フォルダ名や入力出力ファイル名には、スペースや特殊文字を使用しないでください。

代わりに、必要に応じてアンダースコアまたはダッシュを使用します。生のFASTQシーケンスファイルとフォルダ1_Raw_SequenceをFolder A_Raw_Readsというタイトルのサブフォルダにアップロードします。2 ギガビット未満のファイルの場合は、データ ストアの簡易アップロード機能を使用して、メインの DE デスクトップの [データ] ボタンをクリックしてデータ ウィンドウ ツールバーに移動します。

[アップロード]、[デスクトップからの簡易アップロード] の順に選択します。次に、[参照] ボタンを選択して、ローカル コンピューター上の生の FASTQ シーケンシング ファイルに移動します。DEのFastQCアプリを使用して、アップロードされた生シーケンシングリードを評価します。メインの DE デスクトップの [アプリ] ボタンを選択して、DE で使用可能なすべての分析アプリを含むウィンドウを開きます。ウィンドウ上部の検索ツールバーでFastQCツールを検索します。

FASTQファイルが複数ある場合は、マルチファイルバージョンを開きます。[ファイル] を選択して新しいフォルダーを作成し、このフォルダーを出力フォルダーとして選択します。FASTQ で読み取ったファイルを [Select Input Data] というツール ウィンドウに読み込み、[Launch Analysis] を選択します。

DEでプログラム可能なTrimmomaticアプリを検索して開きます。FASTQの生のリードファイルのフォルダを設定セクションにアップロードします。シーケンシングファイルがシングルエンドかペアエンドかを選択します。

[参照] ボタンを選択し、ファイル パスを表示ボックスに貼り付けることで、提供されている標準の制御ファイルを使用します。Trimmomatic制御ファイルを選択し、解析を開始します。高品質のトリミングシーケンスリードを得るには、DEでSickleアプリを検索して開きます。トリミングされた FASTQ リードを入力リードとして選択し、出力ファイルの名前を変更します。

オプションに品質設定を含めます。Wiki ページに移動して、最新バージョンの Atmosphere インスタンスを開きます。最新バージョンの Trinity と Trinotate の画像のリンクを選択します。

[Launch にログイン] ボタンを選択し、Atmosphere インスタンスに名前を付けます。インスタンスサイズとして medium3 または large3 を選択します。インスタンスを起動し、ビルドされるまで待ちます。

Atmosphere イメージのスピンアップに失敗した場合は、より小さなインスタンスに申請するか、Jetstream により多くの割り当てを申請してみてください。すべての詳細は、コンパニオンウィキにあります。Trinity 出力ファイルを DE 内の 3_Assembly フォルダーに移動し、フォルダーに A_Trinity_de_novo_assembly というラベルを付けます。

Trinityを実行するには、コマンドラインの知識と、大規模な分析を完了するために数日または場合によっては数週間が必要です。コマンドラインを理解するのに役立つウィキにリンクされている無料のリソースがあります。組み立てられた各トランスクリプトームに、A_Trinity_de_novo_assemblyフォルダ内のサブフォルダを与えます。

各トランスクリプトームに関連付けられた生物や処理の学名を含む一意の名前を使用してから、3_AssemblyフォルダにフォルダB_rnaQUAT_Outputという別のサブフォルダを作成します。De Novo rnaQUASTというタイトルのアプリを開きます。解析に名前を付け、出力フォルダとして [フォルダ B_rnaQUAST_Output] を選択します。

トランスクリプトデコーダを検索し、Discovery EnvironmentのDe Novo Trinity Assembly出力fastaファイルでトランスデコーダを実行します。解析 DE.Name で deseq2 アプリを開き、出力フォルダーとして 4_Differential_Expresssion を選択します。[入力] セクションで、Trinity Assembly の実行から counts テーブル ファイルを選択します。

また、contig 名が見つかる列を選択します。カウントデータテーブルファイルの列ヘッダーを入力して、比較する列を決定します。各条件の間にはカンマを含めます。

contig 名を含む最初の列ヘッダーは含めないでください。反復の場合は、同じ名前を繰り返します。2 行目に、比較する 2 つの条件の名前を入力します。

最初の行に指定された列ヘッダー名と一致します。ここに示されているのは、各前処理ステップ後のシーケンシングリードの系統的な比較です。トリミング後、読み取りの GC コンテンツとシーケンス コンテンツの歪みが少なくなり、高品質スコアの読み取りに対する割合が高くなります。

De Novoトランスクリプトームを組み立てるには、高品質のリードが必要です。高速QCの結果は、シーケンシングされる生物とサンプルによって異なります。下流で比較されるすべてのサンプルの均一性が、リードの前処理の主な目標です。

rnaQUAST は、ブーストコードを活用して、分類学的クレードの既知のコア遺伝子に基づくアセンブリに関する要約統計を生成します。アセンブラーの精度は、転写産物あたりのミスマッチの数と、標準的な遺伝子に一致する転写産物の数によって明らかになります。ここで示す最後の 4 つのサブプロットは、コンティグとアイソフォームの長さの要約統計量、および予想されるアイソフォームのカバレッジを提供します。

NAxは、y軸の長さよりも長いコンティグの割合を表します。アセンブルフラクションは、最も長い単一のアセンブルされたトランスクリプトをその長さで割ったものです。ここで、カバーされている分率は、BUSCOのコア原核生物または真核生物遺伝子によって期待される、完全に組み立てられた転写産物のアイソフォームの割合です。

このビデオを見れば、トランスクリプトームの組み立て方法と入力方法についてよく理解できるはずです。さらに、このプロトコルでは、2つの条件間での遺伝子発現の差を検出することができます。一般的に、バイオインフォマティクスパッケージは非常に多く、それらに関連する設定や変数が多く、通常は実際に実行するにはコマンドラインの知識が必要であるため、個人はバイオインフォマティクスパッケージに苦労しています。

データ入力と分析出力にラベルを付けて整理し、他の研究者が何をしたのかを理解できるようにすることが重要です。完了した注文手順、プログラムのバージョン、サンプル情報を含める必要があります。また、フォルダ名やファイル名のスペースは省略してください。

新しいツールと新しいバージョンのツールは常に統合されていますが、古いバージョンのツールも保持されています。すべての変更は、コンパニオンウィキに記録されます。この手順に続いて、ネットワーク解析、GOエンリッチメント、代謝経路の同定などの他のバイオインフォマティクス手法を実行して、表現型の変動、発現プロファイルを変化させる条件、機能ゲノミクスの関心のある遺伝子の同定などの質問に答えることができます。