キャピラリーフィーダーアッセイにおいて食物摂取を測定しますキイロショウジョウバエ
March 17th, 2017
CApillary FEeder (CAFE) assayは、食物摂取の根底にあるメカニズムを調査するためのシンプルで予算にやさしい、信頼性の高い方法です。汎用性の高い遺伝子モデル生物であるショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)と併用することで、食物摂取の調節メカニズムについて新たな知見を得るための強力な手段となります。
キャピラリーFEederアッセイの全体的な目標は、成虫の液体食物摂取量を観察し、測定することです。この方法は、実際の摂食行動がどのように開始され、食物消費がどのように終了するかなど、代謝研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、使いやすく、信頼性が高いことです。
一貫した結果を得るためには、いくつかの準備ステップを慎重に実行する必要があるため、メソッドの視覚的なデモンストレーションが重要です。実験を開始するには、ショウジョウバエメラノガスター培養プラスチックバイアルを入手し、Oリングを含む製造されたプレキシガラス蓋で密封します。5マイクロリットルのマイクロキャピラリーと1マイクロリットルのマークを使用して、液体食品を提示します。
2〜20マイクロリットルのピペットチップの上部を切り取り、チップを蓋全体に挿入して、キャピラリーを円錐形の開口部に配置します。ハエが逃げるのを防ぐために、カットされていない2〜20マイクロリットルのピペットチップを同じ開口部に挿入します。トラップまたはブローパイプで蓋の中央の開口部に8匹または20匹のフライをロードし、スポンジバンで穴を閉じます。
次に、準備した複数のバイアルを格子状のインレイが付いたプラスチックの箱に入れて、安全に取り扱います。繁殖条件を制御するために、各実験グループごとに35匹の処女の雌と15匹の雄を、50ミリリットルのフライフードが入ったプラスチック製の培養バイアルに入れます。ハエが最初の3日間卵を産むのを待ってから、成虫のハエを生鮮食品のバイアルに移し、さらに2日間卵を産ませます。
2日後、転送を繰り返します。7日目に、成虫のハエを捨てます。次に、生後2〜3日の成虫ハエにCO2パッドを使用して麻酔をかけ、1.5ミリリットルのプラスチックチューブに性別ごとに選別されたハエを100匹集めます。
標準的な実験室のスケールで体重を測定します。性別で分類された少なくとも4つの独立したハエグループの湿重量を決定し、その重量を使用してミリグラムのハエあたりのマイクロリットルの食物消費量を計算します。3時間のアッセイでは、2つの充填されたキャピラリーに20匹のフライを使用します。
長期的な実験では、8匹のハエのグループを使用し、4つの充填された毛細血管を供給します。最大10本の毛細血管に、事前に調製した着色食品溶液を同時に充填します。キャピラリーを食品溶液に挿入し、45度の角度に傾けて充填を加速します。
液体が毛細管の上部5マイクロリットルマークに達したら停止します。毛細血管の外側と内側の余分な溶液をティッシュペーパーで取り除きます。外側の開口部の1つを塞いでいるピペットチップを慎重に取り外し、最初に充填されたガラスキャピラリーの下端を挿入します。
ピペットチップをキャピラリーの隣に戻して、キャピラリーを固定します。テストしたすべての食品溶液について、この手順を繰り返します。次に、キャピラリーの端を蓋から3〜4センチメートルの同じ高さにあるすべてのバイアルの内側に配置します。
キャピラリーが漏れないように、濾紙の間にはある程度の距離を空けてください。マーカーペンを使用して、色付きの液体の上端にラベルを付けます。ストライプコードを使用して個別にラベル付けし、さまざまな毛細血管を識別できるようにします。
調製したCAFEアッセイを、格子状のインレイが付いたプラスチックの箱に入れます。スポンジブンを使用して、24時間ごとに100マイクロリットルの真水を適用し、アッセイ内の湿度を一定に保ちます。30 mL の再蒸留 H2O を充填した 4 つのバイアルを湿度デバイスとして使用し、プラスチックボックス内の CAFE アッセイの隣に置きます。
実験中は、プラスチックの箱を覆って湿度が制御された環境を作り出します。実験期間中、ボックスを温度、光、湿度が制御された気候チャンバー内の安全な位置に移します。各24時間間隔の前に、死んだハエをメモし、生きたハエの数を使用して、次の期間のフライあたりの消費量を計算します。
アッセイの終了後、キャピラリーを交換する前に、CAFEアッセイを直立位置に保ちます。蓋を外したり、毛細血管の下部半月板に印をつけたりしないでください。マークの終了が最初のマークより下にない場合は、データを破棄します。
使用済みのキャピラリーを、24時間ごとに長期間の実験用に充填したばかりのキャピラリーと交換します。半月板の衰退を測定し、古い毛細血管を廃棄します。次に、キャピラリーをアッセイから慎重に取り外し、データ収集のために保管します。
キャピラリー内の液体が下端に達したか確認してください。キャピラリー内の液体が下端に達しなかった場合は、データを廃棄します。実験後、セットアップを分解し、バイアル、蓋、スポンジ栓を石鹸浴で洗います。
その後、室温で一晩乾燥させてさらに使用します。同じ遺伝子型で少なくとも3日間、実験を繰り返します。キャリパーを使用して、キャピラリーのマーク開始とマーク終了の間の距離を測定します。
最後に、測定後に毛細血管を廃棄します。1モルのスクロース溶液と15%エタノールを含む1モルのスクロース溶液の2つの食品の選択肢が提供されました。腹部の目視検査は、ハエが両方の溶液を食べていることを示しています。
ただし、フライあたりの食物消費量は、エタノールを含む溶液の方がほぼ2倍多くなります。エタノールの好みは、8匹のハエのグループが4日間同様の食物源にアクセスした長期実験でも観察されました。また、CApillary FEederアッセイでは、オスとメスのハエは、低いショ糖濃度よりも高いショ糖濃度を好むことも明らかになっています。
また、オスのハエは、メスのハエよりも高ショ糖濃度を大幅に多く消費します。この手順を試行する際には、制御された方法でアッセイを実施し、少なくとも3日間同じ遺伝子型で実験を繰り返すことを忘れないでください。さらに、突然変異したハエをテストするときは、ハエが食物源を送ったり、毛細血管を上り下りしたりするなど、食物を得るために必要なタスクを実際に実行できるかどうかを考慮することが重要です。
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概要
毛細管フィード（CAFE）アッセイは、ショウジョウバエの食物摂取メカニズムを研究するための信頼性が高く、費用対効果の高い方法です。この技術により、研究者は摂食行動の調節プロセスについての洞察を得ることができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 代謝研究
- 行動研究
背景
- CAFEアッセイは成体のショウジョウバエの液体食品摂取を測定します。
- 摂食の開始と終了に関する重要な質問に対応します。
- この方法は使いやすく、信頼性の高い結果を生み出します。
- この技術の適切な実行には、視覚的なデモンストレーションが不可欠です。
研究の目的
- ショウジョウバエの食物摂取を観察し、定量化する。
- 摂食行動を調節するメカニズムを探索する。
- 代謝研究のためのプラットフォームを提供する。
使用された方法
- プレキシガラスの蓋で密閉されたショウジョウバエ培養プラスチックバイアルの利用。
- 液体食品の提示のための5マイクロリットルマイクロカピラリーの適用。
- カピラリー上の1マイクロリットルマークを使用して食物摂取を測定。
- 一貫した結果を得るための準備段階の慎重な実行。
主な結果
- CAFEアッセイは効果的にショウジョウバエの液体食品摂取を測定します。
- 摂食行動の開始と終了に関する洞察を提供します。
- 結果は代謝研究のためのこの方法の信頼性を示しています。
- 視覚的な補助が技術の理解と実行を強化します。
結論
- CAFEアッセイは食物摂取メカニズムを研究するための貴重なツールです。
- 代謝研究の研究者にとって、簡単なアプローチを提供します。
- 将来の研究は、この方法を基にさらなる調節メカニズムを探索することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The CAFE assay enables quantitative measurement of liquid food intake in Drosophila melanogaster, supporting target validation in metabolic and neurobehavioral research. By providing reproducible, scalable readouts of feeding behavior, it aids in mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses related to energy homeostasis and reward pathways. This assay enhances predictive confidence in early discovery by linking genetic or pharmacological manipulations to measurable phenotypic outputs in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring changes in food intake as a functional readout of neuronal or metabolic pathway modulation.
- Operational Value: Enables rapid, low-cost screening of genetic or compound effects on feeding behavior in a genetically tractable model.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating feeding phenotypes with known regulators of energy balance and reward.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, time-resolved data on food consumption that can be normalized to fly weight and sex for comparative analysis.
- Operational Value: Uses simple measurement tools (capillary meniscus tracking) to enable high-throughput compatible workflows with minimal instrumentation.
- Assay Readiness: Supports replication across experimental days and genotypes, ensuring data reliability for lead identification campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system for studying conserved feeding regulatory mechanisms, facilitating translational biomarker exploration.
- Operational Value: Allows longitudinal assessment of food intake over hours to days, supporting chronic dosing and adaptation studies.
- Risk Mitigation: Helps distinguish central from peripheral effects of compounds by isolating food intake as a behavioral endpoint.
Pipeline & Workflow Integration
The CAFE assay fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, offering a behavioral phenotype that bridges molecular mechanism and organismal physiology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring food intake as an output of neuronal circuit or metabolic pathway activity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs that enable comparison across conditions, genotypes, or treatment groups.
- Analytics: Provides measurable decline in capillary meniscus as a direct readout of consumption, enabling statistical analysis of intake per fly per hour.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling conserved feeding regulation pathways relevant to metabolic disorders.
- Enterprise Reuse: Represents a standardized, low-maintenance platform applicable across multiple projects in metabolic and behavioral neuroscience.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking genetic or pharmacological interventions to quantifiable changes in feeding behavior.
- Operational Value: Ensures standardization through simple setup, minimal reagent needs, and compatibility with environmental controls (humidity, temperature, light).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early phenotypic data on compounds affecting appetite, satiety, or reward.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on behavioral efficacy in a validated disease-relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, sex sorting, and anesthetic techniques (e.g., CO2) for consistent experimental groups.
- Depends on capillary preparation, meniscus tracking, and environmental controls (humidity via water chambers, temperature/light cycles) for data integrity.
- Necessitates cross-team standardization in fly age, genotype, and assay duration to ensure reproducibility across laboratories or sites.
- Involves adaptation considerations when testing mutants with impaired mobility or feeding ability, as capillary access may confound results.
- Includes practical limitations such as evaporation control, capillary clogging, and the need to validate that observed changes reflect true intake rather than assay artifacts.
