Name: 単離された血管の血管拡張およびタイト皮膚マウスの細胞外マトリックスの単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 学ぶ心臓細胞外マトリックスの単離と血管拡張測定法。マウス血管を用いてIRF5阻害ペプチド治療効果を評価し、心血管疾患の進行メカニズム解明に役立つ実験手法を習得できます。

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この作業は、NIHの助成金HL-089779 (DW)、HL-112270 (KAP)、HL-102836 (KAP)、Cimphoni Life Sciences(DW給与の一部)によって支援されました。著者は、原稿を編集してくれたMeghann Sytsmaに感謝します。

<ol><li>Bi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+interferon+regulatory+factor+5+%28IRF5%29+expression+in+human+ductal+carcinoma+correlates+with+disease+stage+and+contributes+to+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Loss of interferon regulatory factor 5 (IRF5) expression in human ductal carcinoma correlates with disease stage and contributes to metastasis.</a> Breast Cancer Res. 13 (6), 111(2011).</li>
<li>Dideberg, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insertion-deletion+polymorphism+in+the+interferon+regulatory+Factor+5+%28IRF5%29+gene+confers+risk+of+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">An insertion-deletion polymorphism in the interferon regulatory Factor 5 (IRF5) gene confers risk of inflammatory bowel diseases.</a> Hum Mol Genet. 16 (24), 3008-3016 (2007).</li>
<li>Graham, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+haplotype+of+interferon+regulatory+factor+5+%28IRF5%29+regulates+splicing+and+expression+and+is+associated+with+increased+risk+of+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Genet%22%5BJournal%5D)">A common haplotype of interferon regulatory factor 5 (IRF5) regulates splicing and expression and is associated with increased risk of systemic lupus erythematosus.</a> Nat.Genet. 38 (5), 550-555 (2006).</li>
<li>Krausgruber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF5+promotes+inflammatory+macrophage+polarization+and+TH1-TH17+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IRF5 promotes inflammatory macrophage polarization and TH1-TH17 responses.</a> Nat. Immunol. 12 (3), 231-238 (2011).</li>
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<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4F+decreases+IRF5+expression+and+activation+in+hearts+of+tight-skin+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">4F decreases IRF5 expression and activation in hearts of tight-skin mice.</a> PLoS One. 7 (12), 52046(2012).</li>
<li>Steen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heart+in+systemic+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Rheumatol.Rep%22%5BJournal%5D)">The heart in systemic sclerosis.</a> Curr.Rheumatol.Rep. 6 (2), 137-140 (2004).</li>
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<li>Concepcion, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+biomolecular+interactions+using+biolayer+interferometry+for+kinetic+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Comb+Chem+High+Throughput+Screen%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization.</a> Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).</li>
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<li>Doppelt-Azeroual, O., Moriaud, F., Adcock, S. A., Delfaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+MED-SuMo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Disord+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">A review of MED-SuMo applications.</a> Infect Disord Drug Targets. 9 (3), 344-357 (2009).</li>
<li>Kim, S., Jang, J., Yu, J., Chang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+mucosal+immunization+of+recombinant+adenovirus-based+vaccine+expressing+F1+protein+fragment+induces+protective+mucosal+immunity+against+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Single mucosal immunization of recombinant adenovirus-based vaccine expressing F1 protein fragment induces protective mucosal immunity against respiratory syncytial virus infection.</a> Vaccine. 28 (22), 3801-3808 (2010).</li>
<li>Frenzel, D., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Titration+Series+with+Biolayer+Interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Kinetic Titration Series with Biolayer Interferometry.</a> PloS one. 9 (9), 106882(2014).</li>
<li>Ou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-4F%2C+an+apolipoprotein+A-1+mimetic%2C+dramatically+improves+vasodilation+in+hypercholesterolemia+and+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease.</a> Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal.Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Bauer, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+phosphorylation+and+protein-protein+interactions+revealed+by+loss+of+function+and+gain+of+function+mutants+of+multiple+serine+phosphorylation+sites+in+endothelial+nitric-oxide+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Compensatory phosphorylation and protein-protein interactions revealed by loss of function and gain of function mutants of multiple serine phosphorylation sites in endothelial nitric-oxide synthase.</a> J.Biol.Chem. 278 (17), 14841-14849 (2003).</li>
<li>Weihrauch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+IRF5+Decoy+Peptide+Reduces+Myocardial+Inflammation+and+Fibrosis+and+Improves+Endothelial+Cell+Function+in+Tight-Skin+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An IRF5 Decoy Peptide Reduces Myocardial Inflammation and Fibrosis and Improves Endothelial Cell Function in Tight-Skin Mice.</a> PLoS One. 11 (4), 0151999(2016).</li>
<li>Hoogenboom, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+phage+display+technology+and+its+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotechnology%22%5BJournal%5D)">Antibody phage display technology and its applications.</a> Immunotechnology. 4 (1), 1-20 (1998).</li>
<li>Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+colorimetric+assay+for+cell+proliferation+and+viability+utilizing+the+tetrazolium+salt+XTT%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT.</a> J Immunol Methods. 142 (2), 257-265 (1991).</li>
<li>Van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+the+3-%284%2C+5-dimethylthiazol-2-yl%29-2%2C+5-diphenyl-2H-tetrazolium+bromide+%28MTT%29+assay+when+compared+to+three+commonly+used+cell+enumeration+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Limitations of the 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays.</a> BMC Res Notes. 8 (1), 1(2015).</li>
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<li>Weihrauch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+D-4F+on+vasodilation%2C+oxidative+stress%2C+angiostatin%2C+myocardial+inflammation%2C+and+angiogenic+potential+in+tight-skin+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of D-4F on vasodilation, oxidative stress, angiostatin, myocardial inflammation, and angiogenic potential in tight-skin mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), 1432-1441 (2007).</li>
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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

目標は、TSK / +マウスの心臓の炎症、線維症、および血管機能にIRF5の役割を解明するためにIRF5阻害剤を設計することでした。知見はIRF5Dの増殖またはアポトーシスを誘導しなかったことです。また、炎症を低減し、血管機能を改善しました。これらのデータは、IRF5はTSK / +マウスの中心部に炎症や線維症の発症に重要な機構的な役割を果たしていることを示唆し、それが治療標的として機能する可能性を持っていること。 最初のステップは、阻害剤を設計することでした。ペプチドを設計する際に、いくつかの点を考慮しなければならない：配列の長さ、二次構造、酸化しやすい残基、アミノ酸組成、アミド化およびキャッピング、N末端およびアミノ酸でのアミノ酸C末端で、そして、リガンドアタッチメント。理想的な配列の長さは最高の全体的な収率、より少ない不純物、及び低コスト化を確実にするために、10〜15残基の間です。それはimporですベータシート形成のような二次構造の注意すべきタント。 βシート形成が削除された配列の高度をもたらすことができます。ペプチドの有効性に影響を与える可能性が副反応につながることがで...

<html>細胞増殖と細胞死の免疫応答の調節は、インターフェロン調節因子の転写因子ファミリーの役割の中心です。 IRF5は、タイプ1の間の免疫応答の調節、炎症促進応答および2型、免疫応答のターゲット組織修復のために重要であると強調表示されます。 IRF5癌1、及び自己免疫2、3、4、5のキーです。 タイト皮膚マウス（TSK / +）は、組織線維症とフィブリリン1遺伝子における重複変異に起因する強皮症のモデルです。タイト皮膚および結合組織の増加でこの変異は結果。これらのマウスは、心筋の炎症、線維化および最終的に心不全5、6、7を開発します&gt; 8,9。強皮症は、米国6で約15万人の患者に影響を与える自己免疫線維性疾患です。この疾患の特徴は、心臓7、8、9、10、11を含む内臓の線維症です。 研究の性質は、阻害ペプチドの設計を要求しました。ソフトウェアアプローチは、ファージディスプレイを使用する従来のアプローチを介して選択しました。ソフトウェアのアプローチが容易になり、より少ない時間のかかるものです。 RCSBのデータバンクは、適切な結合部位12を同定するために使用されます。組換えタンパク質で新たに設計したペプチドの相互作用を研究し、結合パラメーターに焦点を当てて、干渉生物層と呼ばれる技術を使用しました。生物層の干渉は、バイオセンサベースのtechniqですバイオセンサーと結合サンプルを使用して結合親和性、会合及び解離を決定するUE。バイオセンサーは、蛍光、ルミネセンス、放射量および比色標識することができます。測定は、質量付加または枯渇が会合及び解離13、14に似ているに基づいています。本研究の目的は、心筋の炎症や線維症におけるIRF5の役割を理解することでした。目標は、組織線維症および強皮症の開発にIRF5の役割への洞察を得ることでした。

<table><tbody><tr><td>&nbsp;Triton X 100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100- 100ml</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488標識ヤギ抗マウスIgG抗体&nbsp;</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーA11001</td><td></td></tr><tr><td>バードフォード試薬</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー23200</td><td>ピアス&nbsp;</td></tr><tr><td>バイオセンサー</td><td>Forte-Bio</td><td>MR18-0009</td><td></td></tr><tr><td>CD64 (H-250)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-15364</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent Caspase-3/7 Substrate</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>C10427</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit</td><td>Promega</td><td>G3580</td><td>Promega</td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-diamidino-2-phenylindole)</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーD-1306</td> PBSロバ抗ラットAlexa 488で<td>1:1,000希釈</td></tr><tr><td></td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーA-21208</td><td>PBS</td></tr><tr><td>ECLと</td><td>GEヘルスケア/アマシャム</td><td>RPN2133で</td>1:1,000希釈 多くの<td>試行錯誤の後、私たちはこの1つに戻りました</td></tr><tr><td>EZ C1レーザースキャンソフトウェアを備えたエクリプスTE200-U顕微鏡</td>ニ<td>コン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヤギアンチウサギアレクサ488</td>サー<td>モフィッシャー</td><td>A-11008</td><td>1:1,000 dilution in PBS</td></tr><tr><td>HRP&nbsp; anti-goat</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-516086</td><td>!:10,000 dilution in TBS</td></tr><tr><td>HRP donkey anti mouse</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-2315</td><td>1:10,000 dilution in TBS</td></tr><tr><td>ICAM-1 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-1511</td><td>1:200 dilution in PBS</td></tr><tr><td>IRF5 antibody (H56)</td><td>Santa Cruzバイオテクノロジー</td>ズ <td>sc-98651</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー Elx800</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIMP 好中球マーカー</td><td>サンタクルーズ バイオテクノロジー</td>ズ <td>sc-133821</td><td>1:200 PBS</td></tr><tr><td>Octet RED</td><td>Forte Bio</td><td></td><td>タンパク質-タンパク質結合</td></tr><tr><td>ペプチドデザイン&nbsp;Medit SAソフトウェア</td><td>RCSB.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>組換えIRF5タンパク質合成</td><td>TopGene Technologies</td><td></td><td>タンパク質発現、合成サービス</td></tr><tr><td>ドデシルリン酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>436143</td><td>洗剤</td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>薬局</td><td></td><td>スケジュールIII規制物質、要予約&nbsp;</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>MedVet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5X-45X グースネックLEDライト付き三眼解剖ズーム実体顕微鏡</td><td>Am Scope</td><td>SKU: SM-1TSX-L6W</td><td></td></tr><tr><td>Zeba 脱塩カラム</td><td>サーモフィッシャー</td><td>2161515</td><td></td></tr><tr><td>内皮基礎メディア EBM ブレットキット</td><td>ロンザ</td><td>CC-3124</td><td>キットには成長サプリメットが含まれています</td></tr><tr><td>VIA-100K</td><td>&nbsp;Boeckeler Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 - 15% TGX gel</td><td>Bio-Rad</td><td>5671081</td><td></td></tr><tr><td>MedSuMo software</td><td>Medit, Palaiseau, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

単離された血管の血管拡張およびタイト皮膚マウスの細胞外マトリックスの単離

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

インターフェロン制御因子5(IRF5)は、細胞が炎症誘発性または抗炎症性の方法で反応するかどうかを決定するために重要です。IRF5は、細胞をある経路から別の経路に切り替える能力があり、治療標的として非常に魅力的です。低分子やペプチドを設計するための分子モデリングソフトウェアを用いて、デコイペプチドIRF5Dを設計しました。
IRF5Dは、タイトスキンマウス(Tsk/+)において、IRF5を阻害し、細胞外マトリックスの変化を減少させ、内皮血管拡張を改善しました。組換えIRF5のIRF5DのKdは、バイオレイヤー干渉実験を用いた結合実験により、3.72 ± 0.74 x 10-6 Mです。内皮細胞(EC)の増殖およびアポトーシスは、IRF5Dの濃度の増加(0〜100μg/mL、24時間)を使用して変化しなかった。Tsk/+マウスをIRF5D(1 mg/kg/d皮下投与、21 d)で治療した。IRF5D治療後、IRF5およびICAMの発現が減少した。IRF5Dで治療されたTsk/+マウスの顔面筋動脈の血管拡張によって評価されたように、IRF5D治療を受けていないTsk/+マウスと比較して、内皮機能は改善されました。転写因子として、IRF5は細胞質から核に輸送されます。転座は、異なる心臓細胞外マトリックス上で培養された心筋細胞の免疫組織化学によって評価されました。Tsk/+マウスのIRF5D処理は、IRF5D処理を行わない動物と比較して、IRF5陽性核の数が減少しました(50μg/mL、24時間)。これらの知見は、Tsk/+マウスの炎症と線維化においてIRF5が果たす重要な役割を示しています。

図1で実証結果は、ペプチドを設計する方法を示しています。 図1、左上には、多くのキナーゼによってリン酸化されるIRF5中の領域（2黄色の矢印の間、アミノ酸（AA）425から436）を示しています。 図1、右上は、IRF5のリン酸化されたドメインが結合黄色の楕円形を示しています。 3DSHの二量体構造は、ヘリックス2（aa303-312）の左に裂け目や谷を観察するために回転させました。 IRF5のホスホテイルドメインはホモ二量体とその仮定生物学的に活性な状態を形成し、（ すなわち 、セリンのリン酸化）、それが完全に活性化されたときにバインドすることになっている場所です。 図2において、生物層干渉法によって測定された結合活性が示されています。デコイペプチドIRF5Dは毒性がないことを決定するために、増...

私たちは、C57Bl/6Jコントロールマウス、タイトスキンマウス、およびIRF5阻害ペプチドで処理したタイトスキンマウスからの心臓細胞外マトリックスの分離について説明します。また、C57Bl/6Jから単離された血管、タイトスキンマウス、およびIRF5阻害ペプチドで処理されたタイトスキンマウスの血管拡張研究についても説明します。

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

細胞外マトリックスの単離およびex vivo血管拡張に関するこれらの一連の手順の全体的な目的は、げっ歯類におけるIRF5抑制ペプチド治療について研究することです。この手法は、細胞外マトリックスの変化が疾患の進行をどのように増強または減衰させるかを解明するのに役立ちます。血管拡張研究の主な利点は、すべてのシグナル伝達成分を考慮することなく、in vivoのプロセスに関する洞察を得られることです。心臓細胞外マトリックスの単離は、後肢や肺などの他の臓器にも適用可能です。私たちがこの手法に着目したのは、tight skinマウスにおけるfibrillin oneの重複に焦点を当て始めた際で、細胞外マトリックスの変容と細胞挙動への影響を認識したことがきっかけでした。マウスを麻酔し、手術の準備を整えた後、はさみを用いて皮膚を切開します。胸部から顎骨の外側にかけて切り込みを入れますが、顎の前方にある下層組織を傷つけないよう注意してください。次に、周囲の軟組織を除去して顔面動脈を剥離します。この操作を行う際は、動脈を損傷させないよう細心の注意を払ってください。露出した組織をMOPS緩衝液に浸し、組織の状態を維持します。顔面動脈が完全に露出したら、動脈を切断する部位から遠位側にある最初の分枝の近位側で顔面動脈を把持します。次に、親動脈から切り離し、ピンセットで顔面動脈を保持します。fascialisから分かれている2本の枝を切断し、周囲の組織との結合を切り離しながら血管をそっと持ち上げ、分叉点まで到達させます。分叉点で両方の娘動脈を切断して血管を遊離させ、必要になるまで水分を保持できるようMOPS緩衝液が入ったディッシュに移します。血管拡張を測定するために、まず血管のカニュレーションの準備を行います。先端径が125〜175ミクロンのガラスピペットにMOPS緩衝液を満たします。同様に、溶液リザーバーにもMOPSを満たします。次に、単離した血管にカニュレーションを行います。眼科用縫合糸を用いて、これらをガラスピペットに結びつけます。この際、ピペット内に気泡が入らないように注意してください。次に、ビデオカメラアタッチメントを備えた倒立顕微鏡に血管チャンバーを設置します。ビデオキャリパー測定システムを使用してビデオを再生し、画面上で血管の測定を行います。次に、2段階のプロセスを用いて血管を加圧します。まず、MOPS充填リザーバーを血管より上の高さまで上げ、20 mmHgの圧力をかけます。mopsと容器を繋ぐラインを開きます。容器が加圧される際、結束バンド周辺および容器の長手方向に沿って漏れの兆候がないか確認してください。漏れが見られない場合は、リザーバーを上げて60 mmHgの圧力を発生させます。その後、再び血管に漏れがないか確認します。漏れがなく圧力が維持されたら、この圧力で30分間、血管を平衡化させます。平衡化した後、目的の化合物に対する血管拡張反応を測定します。まず、U46619を添加して、血管を2分の1から4分の3まで収縮させます。溶液で血管を6分間浸し、安定させます。その後、アセチルコリンなどの試験化合物をバス溶液に徐々に添加します。2分ごとに、試験溶液の浴槽内濃度を0.000001 Mから開始し、0.001 Mまで10倍ずつ上昇させます。血管拡張の変化はシグナリングに関する疑問を提起しましたが、本研究の焦点は心臓にあります。動物の使用量を削減するため、私たちは外部から開始されるシグナル伝達に焦点を当てるべく、心臓細胞外マトリックスを単離する方法を選択しました。まず、麻酔をかけたマウスから心臓を摘出します。それを、1%高張ドデシル硫酸ナトリウム溶液15 millilitersを入れたビーカーに移します。スターラーを用いて、室温で18時間、溶液を緩やかに攪拌し続けます。翌日、溶液を5% triton X100 15 millilitersに交換して30分間置き、続いてPBS 15 millilitersに交換して15分間置きます。その後、ECMを1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに入れ、液体窒素で急冷します。凍結後、組織をあらかじめ冷却した乳鉢と乳棒に移し、粉末状になるまですり潰します。この粉末を、抗生物質を1:100の濃度で添加したPBSに懸濁させ、粘性溶液にします。この懸濁液を、氷バス中で高出力の超音波処理設定にて30〜60秒間ソニケーションします。ECMタンパク質が単離されました。このタンパク質は低温で保持する必要があります。タンパク質を使用する前に、ブラッドフォード法を用いてその濃度を測定してください。IRF5Dペプチドは、通常のIRF5とは大きく異なる抑制性ペプチドです。IRF5Dはわずか17個のアミノ酸からなり、IRF5のリン酸化部位に結合します。これによりリン酸化とホモ二量体化が抑制され、その結果、IRF5の活性状態への移行が妨げられます。ヘテロ接合体のタイトスキンマウスに、IRF5Dを3週間にわたって皮下投与しました。免疫組織化学により、1視野あたりの染色細胞の平均数を測定した結果、好中球およびCD64の数が減少していました。IRF5D投与群のヘテロ接合体タイトスキンマウスでは、リン酸緩衝液投与群と比較して、アセチルコリン誘発性の顔面動脈血管拡張が改善されました。トランスジェニックマウスの心臓組織由来の培養筋細胞において、タイトスキンヘテロ接合体マウス由来の培養物では、対照マウスよりもIRF5陽性細胞が多く認められました。いずれの培養細胞にIRF5Dを処理したところ、IRF5陽性核の減少が認められました。このビデオを視聴することで、心臓の脱細胞化の方法について十分に理解できたはずです。この技術を習得すれば、多くの臓器に応用することができ、さまざまな疑問の解決に役立ちます。また、マトリックスを過剰に消化しないことが重要である点に注意してください。また、fascialis arteryの剥離および吊り上げ方法についても十分に理解しておく必要があります。この技術を習得すれば、所要時間は約60分となり、ほぼあらゆる血管床に適用可能です。内皮細胞は非常に脆弱であるため、剥離の際は細心の注意を払って進めることが重要です。健全な平滑筋と損傷した内皮が共存することは珍しくありません。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々は、ネイティブ、そのまま微小血管内皮にカルシウムシグナル伝達を可視化して操作するための準備を提示する。内皮チューブは新鮮に、骨格筋、隣接セル内との間で、生体内の形態および動的なシグナリングに保持供給マウス抵抗動脈から単離した。内皮チューブは、他の組織および器官の微小血管から調製することができる。...

マウス抵抗動脈から毛細血管内皮の管の隔離

細胞外マトリックスは、創傷治癒、炎症や腫瘍形成の間に、実質的なリモデリングを受ける。我々は、線維性のダイナミクスならびにエピ蛍光または二光子顕微鏡を用いて、高い空間分解能と時間分解能を有する網目状のマトリックス成分を可視化する新規な生体免疫蛍光顕微鏡法を提示する。...

落射蛍光による組織マトリックスのコンポーネントと二光子顕微鏡の長期生体内免疫蛍光イメージング

提示されたマウス背側皮下脂肪チャンバーのウィンドウには、筋皮弁の急性永続的虚血のゾーンを可視化する。微小血管系および血行動態の定量化の直接的かつ反復的な評価のための生体エピ蛍光顕微鏡許す。形態学的および血行動態の結果は、さらに組織学的および分子解析と相関させることができる。...

マウスの背部皮脂商工における虚血性組織損傷：皮膚弁モデル急性永続虚血を調査する

このプロトコルの目的は、冠循環からマウスの一次血管平滑筋細胞（VSMC）の単離および培養技術を実証することです。たVSMCが単離されたら、それらは、多くの標準的な培養技術のために使用することができます。...

マウス冠動脈血管平滑筋細胞の単離

私たちは、マトリックスゲルプラグ血管新生アッセイの変動を用いて、マウスにおけるヒト内皮 - 周皮細胞の相互作用を研究するためのプロトコルを提示します。...

マウスにおけるマトリックスゲルプラグアッセイを用いたヒト内皮-周皮細胞の相互作用のin vivo研究で

ここで体内のクローン解析運命マッピング、大動脈植と単離平滑筋細胞の詳細を使用して萌芽期および周産期のマウス大動脈を勉強するためのプロトコル。これらの多様なアプローチは、通常開発の萌芽期および周産期の大動脈の疾患の病態形成の調査を促進します。...

体内と組織や細胞植アプローチを使用して形態形成と胚および周産期の大動脈の病因を研究するには

ここでは、マウスの皮膚に透過性促進剤の皮内投与により血管漏出を測定するためのプロトコルを提案する.この手法は、促進、あるいは血管漏れを抑制または血管の透過性を調節する分子機構を研究する分子の能力を決定する使用できます。...

マイル アッセイで皮膚の血管の血管誘導剤の評価

本稿では、電気生理学的、カルシウム...

Ex Vivo細胞生理学研究のため網膜細動脈の隔離

ここでは、一次線維芽細胞を用いてインビトロスクラッチアッセイを行い、マウスにおける生体内皮膚創傷治癒アッセイに関するプロトコルを提示する。両方のアッセイは、インビトロおよびインビボ創傷治癒を評価するための簡単な方法です。...

インビトロおよび創傷治癒の生体内分析のためのスクラッチ移行アッセイとドーサルスキンフォールドチャンバー

このプロトコルの目的は、長期的な培養のためのアクセス可能で簡単な技術を使用して、血管化されたヒトの皮膚同等物の生成および体積分析を記述することです。可能な限り、ステップの根拠は、研究者が研究ニーズに基づいてカスタマイズする能力を可能にするために記述されています。...

自己組み立て型血管化ヒト皮膚等価物の生成

脳実質細動脈からの無傷のマウス脳内皮「チューブ」の集中的な調製は、脳血流調節を研究するために例示される。さらに、我々は、細胞内[Ca2+]および膜電位の変化を含む重要な細胞シグナル伝達経路の蛍光イメージングおよび電気生理学的測定のためのこの内皮研究モデルの実験的強みを実証する。...

マウス脳実質の動脈内皮の単離と機能解析

学ぶ心臓細胞外マトリックスの単離と血管拡張測定法。マウス血管を用いてIRF5阻害ペプチド治療効果を評価し、心血管疾患の進行メカニズム解明に役立つ実験手法を習得できます。

単離された血管の血管拡張およびタイト皮膚マウスの細胞外マトリックスの単離

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