単離された血管の血管拡張およびタイト皮膚マウスの細胞外マトリックスの単離

細胞外マトリックスの単離およびex vivo血管拡張のためのこれらの手順の全体的な目標は、げっ歯類のIRF5阻害ペプチド治療を研究することです。この方法は、細胞外マトリックスの変化が疾患の進行をどのように増加させるか、または軽減するかを明らかにするのに役立ちます。血管拡張研究の主な利点は、すべてのシグナル伝達成分を考慮に入れることなく、in vivoプロセスに関する洞察を提供できることです。

心臓の細胞外マトリックスの分離は、後肢や肺などの他の臓器に適用できます。私たちが最初にアイデアを思いついたのは、タイトスキンマウスでのフィブリリン1の重複に焦点を当て始め、細胞外マトリックスと細胞挙動の変化の影響を認識したときでした。マウスに麻酔をかけ、手術の準備をした後、ハサミで皮膚を開きます。

胸部から顎骨の外側まで、顎の前面に向かって下にある組織を乱さないように注意して切断します。次に、筋膜動脈の周りの軟部組織を切除して、筋膜動脈を解剖します。これを行うときは、動脈を損傷しないように注意してください。

露出した組織をモップバッファーに浸して、健康を保ちます。筋膜動脈が完全に露出したら、動脈が切断される場所の遠位にある最初の分岐部の近位にある筋膜をつかみます。次に、親動脈から切り取り、鉗子で筋膜動脈をつかみます。

筋膜から出ている2つの枝を切り取り、分岐部に達するまで周囲の組織への接続を切断しながら血管を静かに持ち上げます。分岐部で、両方の娘動脈を切断して血管を解放し、モップバッファーの皿に移し、必要になるまで水分を補給します。血管拡張を測定するには、まず血管にカニューレを通す準備をします。

端子径125〜175ミクロンのガラスピペットにモップバッファーを充填します。また、溶液リザーバーをモップで満たします。次に、孤立した血管をカニューレに挿入します。

眼球縫合糸を使用してガラスピペットに結び付けます。ピペット内に気泡が入らないように注意してください。次に、ビデオカメラアタッチメントを使用して、容器チャンバーを倒立顕微鏡に取り付けます。

ビデオキャリパー測定システムにビデオを通し、船舶の画面上で測定します。次に、2段階のプロセスを使用して容器を加圧します。まず、モップで満たされたリザーバーを容器の上の高さで20ミリメートルの水銀柱の圧力で持ち上げます。

モップで船へのラインを開きます。船が加圧されるにつれて、タイの周りや船の長さに漏れる兆候を探します。漏れが見つからない場合は、リザーバーを上げて60ミリメートルの水銀柱を生成します。

次に、容器に漏れがないか再度検査します。圧力が漏れなく維持されたら、この圧力で容器を30分間平衡化します。平衡化した後、目的の化合物に応答して血管拡張を測定します。

まず、U46619を追加して、船を半分から4分の3に縮小します。溶液を容器に6分間浸して安定させます。次に、アセチルコリンなどの浴溶液に試験化合物を徐々に加えます。

2分ごとに、バス内の試験溶液の濃度を000001モルから始まり001モルまで10ずつ増やします。.血管拡張の変化は、シグナル伝達について疑問を提起しました。しかし、私たちの焦点は心にあります。

動物の使用を減らすために、外部から開始されるシグナル伝達に焦点を当てるために、心臓の細胞外マトリックスを分離することを選択しました。麻酔をかけたマウスから心臓を採取することから始めます。それを15ミリリットルの高張性1パーセントドデシル硫酸ナトリウムを充填したビーカーに移します。

溶液を室温の攪拌板で18時間穏やかに攪拌し続けます。翌日、溶液を15ミリリットルの5%トリトンX100に30分間、続いて15ミリリットルのPBSに15分間変更します。次に、ECMと液体窒素を1.5ミリリットルの微量遠心チューブでスナップフリーズします。

凍結したら、組織を予冷した乳鉢と乳棒に移し、粉末に粉砕します。粘性溶液中に1:100の濃度で抗生物質を添加したPBSに粉末を懸濁します。懸濁液を高超音波処理設定の氷浴中で30〜60秒間超音波処理します。

ECMタンパク質は現在単離されており、冷たく保たれなければなりません。タンパク質を使用する前に、Bradford Assayを使用してその濃度を測定してください。IRF5Dペプチドは、正常なIRF5とは大きく異なる阻害ペプチドです。

IRF5Dはわずか17個のアミノ酸を持ち、IRF5のリン酸化部位に結合します。これにより、リン酸化とホモ二量体化が防止され、IRF5活性状態の形成が妨げられます。ヘテロ接合性のタイトスキンマウスをIRF5Dで3週間皮下治療しました。

好中球およびCD64の数は、視野当たりの染色細胞の平均数における免疫組織化学によって決定されるように減少した。IRF5D治療は、リン酸緩衝液で治療されたものと比較して、IRF5Dで治療されたヘテロ接合性のタイトスキンマウスの筋膜動脈のアセチルコリン誘発血管拡張を改善しました。トランスジェニックマウスの心臓組織に由来する培養筋細胞では、対照マウスよりも皮膚のタイトなヘテロ接合体マウスの培養物にIRF5陽性細胞が多く存在しました。

いずれかの培養物をIRF5Dで処理すると、IRF5陽性核が減少しました。このビデオを見た後、心臓の脱細胞化の方法についてよく理解しているはずです。習得すると、このテクニックは多くの臓器に移調でき、さまざまな質問に答えるのに役立ちます そして、マトリックスを過剰に消化しないことが重要であることを忘れないでください。

また、筋膜動脈を解剖して吊るす方法についてもよく理解している必要があります。このテクニックを習得すると、約60分かかり、ほぼすべての血管床で使用できます。内皮がどれほど壊れやすいかを覚えておくことが重要であり、解剖中は注意して進めてください。

健康な平滑筋と損傷した内皮があることは珍しくありません。