サポートされている脂質二重層中のリガンドナノクラスター配列

この技術の全体的な目標は、支持された脂質二重層に一連のタンパク質ナノクラスターを作製することであり、これは細胞生物学アプリケーションのための高感度表面顕微鏡技術に適合します。この方法は、細胞生物物理学の分野における重要な問題、特にリガンドのナノクラスタリングがT細胞の活性化と接着にどのように影響するかという質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、標準的な生物物理学研究室で容易に再現できることと、TIRFやRICMなどの高度な表面感度顕微鏡法と互換性があることです。

この手法は免疫学への洞察を提供するように設計されていますが、細胞生物学、腫瘍学、組織工学への応用が期待できる他の細胞タイプにも適用できます。この手順を開始するには、テキストプロトコルに概説されているように、ガラスカバースライドと観察室を清掃します。次に、70マイクロリットルの2%シリカビーズ懸濁液を15度の傾斜で保持されたカバースライドに一滴ずつ堆積させます。

懸濁液が乾くまで、15秒ごとにガラスを90度ひっくり返します。ビーズの密集した単層を作成し、多層膜とオイルクラスターの形成を回避することが重要です。そのため、ビーズ溶液の濃度と体積、およびスライドの親水性を最適化する必要があります。

液体が蒸発したら、スライドを高周波マグナトロンスパッタリング装置の中に入れ、アルミニウムシリコンターゲットから105mm離れた回転テーブルに置きます。この後、ターボ分子ポンプを使用して、堆積チャンバー内の圧力を負の4番目のパスカルの10の2.6倍に下げます。毎分10標準立方センチメートルのフラックスと0.8パスカルの圧力で純粋なアルゴン雰囲気を導入します。

次に、無線周波数発電機のスイッチを入れます。プラズマが安定した後、シャッターを閉めたまま2分間スパッタリングを行い、ターゲット表面から不純物の可能性があるものを取り除きます。シャッターを開け、スパッタリングを60分間続けて、スライド上に厚さ200ナノメートルのアルミニウム層を堆積させます。

次に、アルゴンの流れを遮断します。ゲートバルブを閉じて、ターボ分子ポンプを蒸着チャンバーから隔離します。この後、チャンバーをきれいな窒素で排出して周囲圧力に到達します。

アルミニウムコーティングされたスライドをチャンバーから回収します。回収したスライドを室温の超純水に浸し、50ワットと50ヘルツで30秒間超音波処理します。次に、デシケーターの底に0.5ミリリットルのAPTESを堆積させます。

スライドガラスをセラミックグリッドの上に置きます。グリッドをデシケーターに配置します。デシケーターをメンブレンポンプに接続します。

次に、ポンプを最大出力で30分間運転して、低真空を生成します。デシケーターのバルブを閉じ、ポンプのスイッチを切ります。50°Cに1時間加熱します。

この後、デシケーターを開き、スライドを収集します。収集したスライドをPTFEサポートの上に置きます。PBSに溶解した2ミリリットルあたり25マイクログラムのビオチンを沈殿させます。

スライドを室温で30分間休ませます。次に、PBSで10回すすいでください。スライドを水酸化ナトリウムとPBSの溶液で室温で一晩インキュベートします。

この後、スライドを超純水で10回すすぎます。ラングミュアトラフを清掃した後、PTFEトレイをトラフのPTFEエンクロージャーに置きます。次に、超純水で満たします。

測定された圧力を 0 ミリニュートン/メートルに設定します。気密性ガラス金属シリンジを使用して、1ミリメートルあたり1ミリグラムのDOPCとクロロホルム溶液を30マイクロリットル水面に堆積させます。脂質単分子膜を圧縮するために、27ミリニュートン/メートルの所望の圧力に達するまでPTFEバリアを閉じます。

次に、電動クランプを使用して、準備したスライドガラスをPTFEエンクロージャーに浸します。スライドをクランプに保持しますamp 空気と水の界面に対して垂直に。27ミリニュートン/メートルの一定の圧力を維持しながら、毎分15ミリメートルの速度で界面を介してスライドを上昇させます。

次に、スライドガラスをPTFEトレイの上の水面に水平に置きます。次に、金属製のピンセットを使用して、スライドをPTFEトレイに押し下げ、超純水に浸します。ピンセットを使用して、スライドが入ったPTFEトレイを超純水で満たされた晶析装置に移します。

コーティングされたスライドを水中で観察チャンバーに移します。この後、チャンバーを閉じ、約1ミリリットルの水が内部に閉じ込められることを確認します。もう一つの繊細なステップは、サンプルチャンバーを水中で組み立てることです。

また、堆積した二重層の空気との接触を絶対に避けるべきであるため、これを確実にするためには大量の水を使用し、組み立てプロセス全体が水中で行われるようにする必要があります。組み立てたチャンバーを水から取り出し、チャンバーが水密で漏れがないことを確認します。500マイクロリットルのPBSを追加し、次にチャンバーから500マイクロリットルの液体を取り除きます。

このプロセスを10回繰り返して、チャンバー内の1ミリリットルの超純水を完全にPBSに置き換えます。次に、100マイクログラム/ミリリットルのウシ血清卵白を観察チャンバーに導入します。室温で30分間インキュベートします。

この後、チャンバーから500マイクロリットルを10回取り外して追加することにより、二重層をすすぎます。次に、リガンドで官能基化し、細胞を沈着させ、テキストプロトコルで概説されているように、プロテオリピッドナノパターンとSLBの流動性を観察します。このプロトコルでは、ビーズマスクを使用して、アルミニウムの制御された堆積によって二次金属マスクを作成します。

次に、ビードマスクを取り外し、穴の開いたアルミニウムの層を残します。次に、APTESと呼ばれる有機アミノシリンが気相で沈殿し、続いてBSA-ビオチンが水相で沈殿します。その後、アルミニウムが除去され、ナノメートルのタンパク質パッチが現れます。

最後に、ドット間スペースは、支持された脂質二重層で埋め戻されます。次に、ナノドットと担持脂質二重層のエピフルオレッセンス画像を撮影します。複合画像は、タンパク質ドットの周囲に一意に堆積した脂質二重層との完全な相補性を示していますが、タンパク質ドット上には存在しません。

新たに堆積した担持脂質二重層のエピフルオレッセンス画像では、タンパク質ドットは脂質の明るい海に暗いスポットとして現れます。しかし、50秒間連続して光漂白した後、画像はフィールドダイアフラムで区切られた領域内にハローを示し、脂質が移動性であることを示しています。磁場ダイアフラムの端に沿った平均強度プロファイルと、漂白プロセス中のこの強度の経時的な減衰を分析すると、拡散定数は毎秒5マイクロメートル二乗であることが明らかになりました。

この手法は、適切に実行すれば2日で実行できます。アルミニウムの蒸着中は非常にきれいな状態を維持し、蒸着曲線を慎重に校正することが重要です。この手順に従うと、パターン化されたスライドをさらに機能化することができます。

例えば、二重層に別の生体分子を添加することによって。これを使用して抗原植物を食べる細胞を模倣し、T細胞の活性化を研究します。したがって、その開発後、この手法は多様な視聴者の興味を引くはずです。

例えば、組織工学者は人工組織を成長させるための足場として利用したいと考えるかもしれませんし、腫瘍医はがん細胞の追加について根本的な疑問を提起するためのプラットフォームとして利用したいと考えるかもしれません。このビデオを見れば、高度な顕微鏡技術に適合した担持脂質二重膜にタンパク質ナノクラスターの領域を作製する方法を十分に理解できるはずです。私たちはこれをT細胞の研究に利用していますが、この基質は、あらゆる種類の細胞と制御されたパターンのプロテオリピド膜との相互作用を研究するためのプラットフォームとして選ばれる可能性があると考えています。