デキストランは、マウスとヒト NK 細胞のレンチ ウイルスの伝達効率を向上します。

このプロトコルの全般的な目的は、初代ナチュラルキラー細胞において遺伝子導入を成功させるための技術を確立することです。この手法は、ナチュラルキラー（NK）細胞などのエフェクターリンパ球に遺伝子改変が及ぼす影響など、免疫療法分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、初代マウスまたはヒトNK細胞において、目的遺伝子を効率的に発現させることができる点にあります。

テキストプロトコルに従ってレンチウイルスベクターを調製およびタイターした後、単細胞脾臓懸濁液をナイロンウールカラムに通して、B細胞およびマクロファージからなる接着細胞集団を除去し、マウス一次NK細胞を精製します。NK細胞を含む非接着細胞集団の培養には、RPMI1640完全培地に1,000 units/mLのInterleukin-2を用いてください。培養4日目に、20 mLのRPMI1640完全培地と1,000 units/mLのIL-2を用いて培地を交換し、非接着のT細胞およびNKT細胞を除去します。

7日目に、MK細胞特異的マーカーを用いてフローサイトメトリーによりマウスNK細胞の純度を確認し、CD3陰性かつNK1.1陽性の集団が95%を超える調製物を使用します。末梢血単核細胞（PBMC）を単離するために、50 mLコニカルチューブに15 mLの密度勾配液を入れ、その上に半分に希釈した細胞35 mLを慎重に重層します。スイングローターを用い、400 ×g、20 °Cで30分間、ブレーキなしで遠心分離します。

テキストのプロトコルに従ってヒト一次NK細胞を精製した後、2 $\mu\text{g/mL}$ のanti-CD3抗体および2 $\mu\text{g/mL}$ のanti-CD56抗体を添加し、細胞の純度を測定します。細胞を4 °Cで20分間インキュベートします。PBSを用いて細胞を2回洗浄してください。

次に、フローサイトメトリーで細胞を分析します。NK細胞集団は、細胞表面でCD56陽性かつCD3陰性となります。マウスまたはヒトの一次NK細胞を、GFPレンチウイルス上清と共に、培地 1 mLあたり0.5 × 10⁵ 個の密度で24ウェルプレートのウェルに懸濁し、MOIを5、10、20に設定します。

次に、ポリブレン、プロタミン硫酸塩、またはデキストランの存在下で、プレートを1,000 ×gで60分間遠心分離します。その後、上清を捨てずに、5.2% 二酸化炭素を満たした37 °Cのインキュベーターで細胞を一晩培養します。

細胞を10 mLのPBSで洗浄した後、IL-2を含む2 mLのRPMI1640培地を用いて細胞を再懸濁します。細胞を回収する前日に、96ウェルの高タンパク質吸着ポリスチレンプレートを2.5 µg/mLの抗MKG2Dモノクローナル抗体でコートし、室温または冷蔵庫内で一晩インキュベートします。

翌日、100 µLのPBSを用いて各ウェルを3回洗浄します。プレートを軽くタッピングして導入後のNK細胞を回収し、96ウェルプレートの各ウェルに細胞を100 µLずつ分注します。活性化から16〜18時間後、マルチチャンネルピペットを用いて上清を回収します。

次に、ELISAキットに含まれる組換えサイトカインを用いて標準曲線を作成し、上清中のInterferon Gammaなどのサイトカイン量を定量します。NK細胞の生存率を試験するため、導入から4日後に、冷PBS 10 millilitersで細胞を2回洗浄します。その後、細胞を回収し、XM5 7-aminoactinomycin Dを用いて染色します。

フローサイトメトリーを用いて、形質導入されたNK細胞における壊死細胞の割合を決定し、テキストプロトコルに従ってデータを解析します。この図は、リコンビナントIL-2で培養した後、GFPレンチウイルスを導入したヒトNK細胞において、ポリブレンまたはプロタミン硫酸塩を添加した場合と比較して、デキストランを培養液に添加したときにより高い導入効率が得られ、ウイルス力価が向上したことを示しています。ここで示されているように、マウスNK細胞においても同様の結果が得られており、ポリブレンやプロタミン硫酸塩と比較して、デキストランがレンチウイルスベクターの効率を増強させました。

本実験では、標的細胞としてK562およびYAC-1を用い、CR放出試験により、導入された一次NK細胞の細胞毒性能を検討しました。デキストランによるNK細胞の導入は、非導入のNK細胞と比較して、形質転換されたNK細胞の殺傷能に悪影響を及ぼしません。ここでは、導入されたヒト一次NK細胞をK562と24時間共培養し、上清を回収してインターフェロンガンマを測定しました。

結果は、デキストランが形質導入されたNK細胞のサイトカイン産生能に影響を与えないことを示しています。さらに、独立した検証により、プレート結合抗NKG2D A10モノクローナル抗体で活性化したデキストラン処理NK細胞が、依然としてサイトカインであるインターフェロンガンマを産生できることが示されました。この手順を行う際は、形質導入した細胞を遠心分離することを忘れないでください。

本手順に続き、遺伝子導入の効率改善方法など、さらなる疑問を解決するために、トランスフェクションなどの他の手法を用いることが有効です。この技術の開発により、免疫学分野の研究者がNK細胞における遺伝子操作を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、NK細胞への導入方法について十分な理解が得られるはずです。