免疫担当げっ歯類で堅牢な肺炎モデルはに対して抗菌有効性を評価するために S。ニューモニエ、 H。インフルエンザ、 K。ニューモニエ、 P。緑膿菌または A。バウマニ

この非外科的気管支内感染手順の全体的な目標は、免疫適格なげっ歯類で強力な細菌性肺炎を確立することです。この方法は、重症肺炎の免疫適格モデルで潜在的な治療法の有効性を評価できるようにすることで、抗菌薬の発見と開発に付加価値をもたらします。この技術の主な利点は、動物が好中球減少症であることが一般的に必要とされるものや、他の方法では生存可能な感染を引き起こさない分離株を含む多くの分離株で堅牢で再現性のある肺感染症を確立することです。

一般的に、この手順に不慣れな人は苦労します。適切な挿管は、食道の代わりに気管に挿管するための正しい感触を学ぶ必要がある盲目の手順です。適切な挿管は科学者ごとに異なります。

カニューレの正確な角度は、すべての人にとって同じではないかもしれません。気管の隆起を感じることが鍵です。この手法を実演するのは、私たちの研究室の科学者であるシンディ・マイニングです。

まず、テキストプロトコールに示されているように、一晩のブロス培養物から生理食塩水細菌懸濁液を調製するか、ここに示されているように寒天プレートから調製します。寒天プレートから一晩で成長を収穫し、滅菌ループを使用して表面からコロニーをこすり落とします。採取した材料を5ミリリットルの滅菌生理食塩水に移し、濁った不透明な懸濁液が得られるまで、培養物を均一になるまで穏やかにボルテックスします。

その後、連続希釈し、テキストプロトコルに従って各希釈液からアリコートをプレートします。寒天を準備し、感染プロセスに必要なツールを組み立てた後、テキストプロトコルに従って、9ミリリットルの寒天を滅菌チューブに分注し、寒天が摂氏約42度に平衡化するまでチューブを水浴に入れます。以前に調製した生理食塩水細菌懸濁液を1ミリリットルを寒天のチューブに加える。

次に、チューブを数回反転させて混合し、水に戻します。水浴の近くの作業面に清潔な使い捨てマットを置きます。作業面と挿管装置を準備するには、まず金属製のカニューレとポリエチレンチューブをテキストプロトコルに従って滅菌し、次にガラス製の収納チューブに入れて作業面に移します。

次に、保存チューブからキャップを取り外し、カニューレのハンドル端をチューブの開放端にスライドさせます。滅菌鉗子を使用して、ビーカーからポリエチレンチューブの1つを取り外し、滅菌金属カニューレの内側に挿入して、自由に動くことを確認します。消えないペンで所定の場所にガイドマークを置きます。

次に、滅菌済みの使い捨て25ゲージ針をポリエチレンチューブの自由端に取り付けます。次に、滅菌生理食塩水を使用して、新鮮な使い捨ての1ミリリットル注射器を充填します。ポリエチレンチューブに取り付けた針にシリンジを取り付け、チューブを通して生理食塩水の全量を洗い流します。

使用済みのシリンジを鋭利物容器に捨てます。次に、新しい滅菌使い捨て1ミリリットル注射器に、水浴からの寒天ベースの接種物を入れます。25ゲージの針とチューブを再度取り付け、チューブが寒天で完全に満たされるまでプランジャーを押し下げて、寒天をチューブに通します。

テキストプロトコルに従ってラットに麻酔をかけた後、頭を右に、尾を左に向けて、動物を使い捨てマットの上に仰臥位に置きます。次に、金属製のカニューレの自由端を動物の口に挿入します。自由端が上向きに角度がつくようにカニューレを回し、わずかにねじる動きで喉頭構造を慎重に迂回しながら、カニューレを気管内にゆっくりと進めます。

食道ではなく気管への挿入を確認するには、左人差し指で気管リングを触診しながら、カニューレを少し前後に数回ゆっくりとスライドさせます。食道ではなく気管への挿管を確実にするには、カニューレを少し前後に動かして、隆起を感じます。カニューレが喉をスムーズに滑り落ち、隆起が感じられない場合は、デバイスを取り外して再試行してください。

カニューレが気管が左右の気管支に分かれる分岐点に到達したら、動物の左側に向かってわずかにねじる動きをして、カニューレが左気管支に挿入されるようにします。よくある間違いは、接種物を肺の奥深くに配置していないため、気道が塞がれ、呼吸が阻害される可能性があることです。カニューレを適切な角度に回すと、カニューレは左気管支に簡単に滑り込み、適切な深さまでスムーズに進むはずです。

金属製のカニューレを、端が左肺の半分から4分の3まで下がるまで進め、前に配置したガイドマークを使用して適切な深さに達したことを確認します。金属製のカニューレを所定の位置に取り付けた状態で、チューブに以前に配置されたガイドマークを使用してポリエチレンチューブを数ミリメートル前進させ、金属製のカニューレの端から出るのに十分な距離だけ前進させ、肺に穴を開けないようにします。両方のカニューレを所定の位置に設置した状態で、付属のシリンジを使用して、100マイクロリットルの寒天懸濁液を左肺の大葉の奥深くに注入します。

チューブを数ミリメートル引き抜き、無傷の挿管デバイスをそっと取り外します。それをガラス製の収納チューブに戻し、動物を新しいケージに移して回復させます。作業面とカニューレは、ラットの場合と同様に、マウス用の適切なサイズの機器を使用して準備します。

滅菌済みの使い捨て1ミリリットルシリンジと滅菌済みの25ゲージ針を使用して、ガラスマイクロインジェクションシリンジに滅菌生理食塩水を充填します。次に、再組み立てした装置を通して生理食塩水を洗い流します。次に、新しい滅菌使い捨て1ミリリットルシリンジと滅菌25ゲージ針を使用して、マイクロインジェクションシリンジに寒天接種物を充填します。

次に、デバイスを再度組み立て、チューブが寒天で完全に満たされるまで、チューブを通して寒天を洗い流します。テキストプロトコルに従ってマウスに麻酔をかけた後、ラットで示されたのと同じ向きに動物を配置し、ラットと同様の方法で気管を挿管するために安定した、しかし穏やかな圧力を使用します。力を加えることは避けてください、なぜならこの技術はマウスでより繊細です。

気管リングを感じて、カニューレが気管に挿入されていることを確認します。カニューレを少し回して左気管支に進め、前に配置したガイドマークを使用して肺の奥深くに挿入します。金属カニューレを所定の位置に置き、ポリエチレンチューブを数ミリメートル前進させ、20マイクロリットルの寒天懸濁液を注入します。

ここに示されているのは、肺ホモジネートサンプルの段階希釈および三重プレーティング後の寒天プレート上で増殖するコロニーの代表的な例です。このグラフでS.pneumoniaeで示されているように、感染した肺では、感染後96時間でも、ほとんどの細菌分離株でベースラインコントロールを数log base ten CFU上回る細菌負荷の増加が通常観察され、動物間のばらつきは低いです。この実験では、2つの化合物をS.pneumoniaeのキノロン感受性またはキノロン耐性分離株に対して評価し、この肺感染モデルがリード化学シリーズの最適化中に構造活性相関をサポートするために使用できることを示しました。

各記号は、1匹のラットの肺から決定されたCFUを表しています。ここに示されているのは、肺炎球菌またはインフルエンザ菌の分離株で肺に感染した免疫適格マウスの用量範囲有効性データを使用して作成されたE maxモデルであり、新規ポリペプチドデホルミラーゼ阻害剤の薬物動態学的、薬力学的標的を決定します。円は、さまざまな用量の化合物で治療されたグループあたり4〜5匹のマウスの平均細菌量を表しています。

白丸は曲線の下の自由領域を表し、塗りつぶされた円は最小阻害濃度を超える濃度時間曲線の下の領域を表します。この技術を習得すると、1匹あたり約30秒で完了し、注射器1杯の寒天接種物につき最大5〜6匹の動物に接種することができます。このビデオを見た後、この非外科的気管支内感染法の実行方法を十分に理解し、多くの異なる細菌分離株による肺感染症を確立するためにそれを利用できるようになるはずです。

エネルギッシュなインストルメトナル