Name: 脳転移のマウスモデルを生成するために頸動脈内癌細胞注入 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 学ぶマウス頸動脈内癌細胞注入法による脳転移モデル作成技術。高い再現性と低い変動性で新規治療法の評価を可能にし、脳転移研究の信頼性向上に貢献する。

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倫理の声明：すべての動物実験は、テキサス大学MDアンダーソンがんセンターの施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。 1.注射用癌細胞を準備します<ol><li> 1日か2日の注入前に癌細胞をシード。特殊媒体は、特定の細胞株について、文献に示されない限り、10％FBSを補充したDMEM / F12培地は、使用します。 </li><li> 37℃で2分 - 1のためのトリプシン処理（0.25％）の前に一回無血清培地との最初の洗浄により80％コンフルエンス - 手術の日に、収穫細胞は、彼らが70に到達したとき。 DMEM / F12培地をFBSを含有する10％が0.25％トリプシンをクエンチするために細胞に加えます。 </li><li> 3分間80×gで細胞を遠心分離します。細胞株に応じて、5×10 6細胞/ ml -無血清培地で洗浄細胞を2回1にハンクス平衡塩溶液（HBSS）で、残存血清を除去し、血球計で細胞を計数し、再懸濁します。氷の上に保管してください注射時まで。 注：MDA-MB-231乳癌細胞およびK1735メラノーマ細胞を本研究に使用した、両方の細胞株は、/ mlの濃度が2×10 6個の細胞で使用しました。過剰治療は転移アッセイの成果に影響を与える可能性があるとして、できるだけ短いトリプシン処理時間をおいてください。 </li></ol> 2.腫瘍細胞注射のためにマウスを準備<ol><li>腹腔内ケタミン/キシラジンのカクテルの（IP）注射（ケタミンを100mg / kgを、キシラジン10mg / kgの）によってマウスを麻酔。 </li><li>動物の足をつまんで完全に麻酔を確認し、応答の欠如を観察します。 </li><li> （タンパク質ゲルを鋳造するために使用される）ガラス板上にマウスを置き、ゴムバンドで固定します。 </li><li>必要に応じて、シェービングや脱毛製品の少量を適用し、紙タオルで髪を拭き取ることにより、首の毛を取り除きます。注：彼らは体毛を持っていないとして、ヌードマウスを使用している場合は、このステップをスキップします。 </li><li>適用することにより、首の皮膚をきれいにしてくださいポビドンヨードおよび70％のアルコール。 </li><li>解剖顕微鏡のステージ上にマウスを置き、 </li><li>手術用メスで約1センチの皮膚を切開してください。 </li><li>ぶっきらぼう下に頸動脈を露出させるために歯付き鉗子で筋肉を解剖。 </li><li>手術用鉗子で隣接する迷走神経から頸動脈を分離します。 </li><li>手術用鉗子を使用して、より小さなコットンボールに、綿球からいくつかの綿を分離湿らせ、そしてファッション。注射の意図された部位の頸動脈の下にこのバッファ湿コットンボールを置きます。 </li><li>コットンボールに縫合糸の遠位端と近位を置き、緩い結び目を作ります。注射部位への血流を遮断するために、近位結び目を締めます。 </li><li>コットンボールに頚動脈が新鮮な赤い血と完全に加圧された表示された場合は、癌細胞の注射に進みます。 </li></ol>頚動脈に3癌細胞注入<ol><li>ボルテックスし、100μlのOを描きますシリンジにF癌細胞。 </li><li>解剖顕微鏡下で、ゆっくりとコットンボールの上に座って頸動脈の内腔に（ベベルを上にして）31 G針を挿入します。 </li><li>ゆっくりと頸動脈に注射器から細胞を注入します。緩衝癌細胞が循環中に押し込まれたときに成功した注射は、近くの血管や筋肉組織の変色によって、顕微鏡下で観察することができます。 </li><li>ボリューム全体の注入が完了すると、逆流を防止するために穏やかに遠位頚動脈を持ち上げます。 </li><li>素早く注入プロセスを完了するために、遠位の結び目を締めます。 </li><li>注入が完了した後、合字を締めし、解剖顕微鏡下でマイクロはさみで余分な絹縫合糸をトリミング。創傷部位をカバーするために分離された筋肉を戻します。 2つのステープルで皮膚を閉じます。 </li></ol> 4.外科回復<ol><li>加熱パッド上に操作動物を移動します回復のため。動物が意識を回復するために60分 - それは30を取ることができます。一方で、術後の鎮痛などの皮下注射を介して、ブプレノルフィン（0.05ミリグラム/キログラム）を管理。注：鎮痛はIACUCプロトコルを承認し、ローカルに応じて提供されるべきです。 </li><li>動物が目覚めると、自分の通常の動作を再開したら、彼らの住宅の場所にマウスを返します。数日後に手術のためのゲル食品でマウスを提供します。外科的な記録を維持し、部屋に保管してください。 </li></ol> 5. in vivoイメージング非侵襲的<ol><li>ルシフェラーゼレポーター構築物で標識された細胞は、in vivoイメージングシステム14 に用いた癌細胞の注入効率を測定します。 注：イメージングは​​、研究動物に過度なストレスを回避するために、注射の日に実行されません。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

癌細胞の成功した頸動脈注射のための最も重要な手順は次のとおりです。手術の準備のために、マウスの1）深い麻酔。 2）綿のサポートの上に頸動脈の安定した配置。成功した注入後の頸動脈の3）タイト結紮。 30分〜の深い麻酔を解剖顕微鏡下での安定した外科的なパフォーマンスのために通常必要です。我々は、マウスの麻酔のために商業的にすぐに使用できるケタミン/キシラジンのカクテルを使用します。麻酔のために使用される音量を調整する際に柔軟性を提供するために生理食塩水で2：1または1：潜在的な過剰摂取を避けるために、ケタミン/キシラジンのカクテルを1に希釈されてもよいです。あるいは、非制御薬物トリブロモエタノールで麻酔薬としても使用され得ます。しかし、我々は分解するトリブロモエタノールの傾向は、ケタミン/キシラジンのカクテルよりも効果的な麻酔薬などの物質が少なく信頼性を向上させていることを発見しました。 A着実に配置され、完全に加圧された頸動脈を大幅に癌細胞の注入を容易に。したがって、我々は非常に慎重に顕微鏡下ではなく次善の条件で注入を進める...

中枢神経系（CNS）への癌の転移は壊滅的な疾患であり、脳実質または軟膜（「脳転移が「この資料の両方を意味する）のいずれかを含むことができます。 1 1、2：それは&gt; 10で一次神経膠腫をより多かっ、支配的な頭蓋内悪性腫瘍です。肺癌、乳癌、および黒色腫は脳転移3,4の高い発生率を生成トップ三大腫瘍性疾患です。近年では、新たな癌治療中の印象的な進歩は劇的に生存を延長し、多くの癌患者の生活の質を改善しています。しかし、再発時に、脳転移の発生率が急速に上昇しています。例えば、抗HER2抗体トラスツズマブ（ハーセプチン）は、HER2 +乳癌患者で有意な臨床効果を示しました。まだ不穏な傾向が出てきましたこれらの患者における：その頭蓋外全身性疾患最初に、後に脳転移5、6、7を開発トラスツズマブ治療の恩恵を受けたものの1/3まで。悲しいことに、脳転移を有する患者は、通常、生活の質の外傷性劣化を経験し、ほとんどすべての現在の治療に対して難治性であり、診断後の彼らの1年生存率はわずか〜20％8です。 （ステロイド、頭蓋放射線療法、および選択された患者における外科的切除を含む）脳転移のための現在の治療は、単に9治癒的ではなく、姑息されています。そのため、脳転移は、新規癌治療のこの時代の次の印象的な課題として浮上しています。患者が診療所に日々直面している満たされていない課題を解決するために、我々は早急に優れた脳転移の根底にあるメカニズムを理解し、新しい治療法を開発するためにこの知識を使用する必要があります。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;転移性癌細胞による脳の成功したコロニー形成は、血液脳関門（BBB）のバイパスのような複数の生物学的な選手の複雑な相互作用によって媒介される一連の機能の性能を必要とし、脳の固有から逃れますex vivoでまたはin vitroシステムで再現されているいずれも免疫防御的なメカニズム10、。したがって、in vivoモデル適切かつ忠実な脳転移の研究のために重要です。従来のインビボ転移アッセイは、肺から取り出すときにひっかかるする細胞の大部分をリードし、尾静脈注射を介してがん細胞を紹介します。脳転移病巣はほとんど肺11内の腫瘍負荷によって引き起こされる、動物の死を前に、これらのモデルで生産されていません。癌細胞の直接脳内注射は、CNSにおける一貫した腫瘍の成長を生じ、一次神経膠腫の研究で広く用いられています。しかし、SUCH注射は、BBBを損なうし、このモデルの生理的関連性についての懸念の両方の主要なポイント、注射部位の外傷性損傷を引き起こします。別の頻繁に使用される癌細胞の導入路、心臓内注射、管理し、CNSへの実験的転移を生み出すん簡単です。しかし、CNS以外の臓器サイトへの同時転移は常に生成され、動物の死亡率11を引き起こす可能性があります 。従って、このモデルの可変性の高い、動物の限られた数の生物学的機構又は治療薬の定量的評価のために、それは不適切になります。 ここでは、総頸動脈への癌細胞の注射を介して実験的脳転移を生成する手順を説明します。我々は、脳転移の転移カスケードに個々の遺伝子の貢献を分析し、治療的介入の有効性を評価するために、このアプローチを使用していますS 12、13。このアプローチの主な利点は、再現性の変動の低度の高度です。主な欠点は、顕微手術を実行するために必要な精巧さと器用さです。

<table><tbody><tr><td>ケタミン塩酸塩/キシラジン塩酸塩溶液</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>K113</td><td></td></tr><tr><td>ルーチン実体顕微鏡 ライカM50</td><td>ライカ</td><td>M50</td><td>顕微鏡はモジュール式で、特定のスペース要件に合わせて高度に構成可能です。</td></tr><tr><td>皮膚を切開するための</td><td>外科用使い捨てスケープル</td><td>Integra Miltex</td><td>4-410</td></tr><tr><td>組織鉗子 - 1 x 2 歯</td><td>Fine Science Tools</td><td>11021-12</td> 筋肉を<td>鈍く解剖する</td></tr><tr><td>Dumont #5 - 鏡面仕上げ鉗子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-23</td><td>頸動脈を分離して注射用に準備する</td></tr><tr><td>Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15025-10</td><td>縫合糸を切断する</td></tr><tr><td>EZクリップキット</td><td>Stoelting</td><td>59020</td><td>創傷閉鎖</td></tr><tr><td>用 BDインスリン注射器</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td></td><td>細胞注射用</td></tr><tr><td>328438 IVIS Spectrum In Vivo イメージングシステム</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td></td></tr></tbody></table>

脳転移のマウスモデルを生成するために頸動脈内癌細胞注入

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

転移は、患者の体内の二次部位での広がりと悪性細胞の増殖は、癌関連死亡率の&gt; 90％を占めます。最近、新しい治療法で印象的な進歩は飛躍的に多くの癌患者の生存および生活の質の向上を延長しています。悲しいことに、脳転移再発の発生率が急上昇して、すべての現在の治療は、単なる姑息です。したがって、良好な実験動物モデルが緊急疾患生物学の詳細な研究を容易にし、前臨床評価のための新規な治療法を評価するために必要とされます。しかし、癌細胞の尾静脈注射を介して、 インビボ転移アッセイにおける標準は、主に肺転移病変を生成します。動物は通常、脳転移のいずれかの意味の伸長前に肺腫瘍負荷に屈します。腫瘍細胞の心臓内注射は、脳を含む複数の器官部位への転移病変を生成します。しかし、variabiこのモデルを用いて製造腫瘍増殖のリティは、治療効果を評価する際に、その有用性を減衰大きいです。脳転移の研究のための信頼性と一貫性の動物モデルを生成するには、ここでは、腫瘍細胞の頸動脈内注射を介して家のマウス（ ハツカネズミ ）における実験的脳転移を製造するための手順について説明します。このアプローチは、このように基本的な生物学的メカニズムを研究し、新規治療薬を評価するために研究努力を促進する、いずれかの同様の増殖率および死亡率の特性を有する脳転移担持マウスの大量生産を可能にします。

注射の質を評価することができる2つのポイントがあります。最初の可能性は、注入の間、血管の色を変化させる操作者の観察によるものです。貧しい注射からの漏れが簡単に解剖顕微鏡下で観察することができます。サポートコットンボールにマウス本体（ 図1A）とその頸動脈（ 図1B）の安定的かつ安全な配置は、頸動脈への円滑かつ成功した注射のための重要な要因です。注射の質を評価するための第二の点は、手術後の非侵襲的イメージングです。この目的のために、癌細胞は、典型的には、注射前に、ルシフェラーゼレポーターエクスビボで標識されます。 インビボイメージングにおいて 、動物のストレスを最小限に抑えるために、通常、24時間のポスト噴射を行います。強力な頭蓋内癌細胞の負荷、およびマウスの頭の中で成功した注射の結果が正のsの唯一の地域でありますignals（ 図2A）。 <p class="jove_content" fo:keep-toge...

脳転移は、治療の選択肢が緩和的に残っているが、その発生率が増加しているとして緊急に満たされていない医療ニーズとなっています。癌細胞の頸動脈内動脈注射を介して脳転移の実験動物モデルを作成することは、疾患の生物学および新規介入計画の評価の機構研究を容易にします。

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

頸動脈を介した癌細胞の微小外科的注入の全体的な目的は、マウスにおいて一貫したin vivo実験的脳転移モデルを作製することです。これにより、新しい治療薬が脳転移の治療に有効であるかなど、脳転移分野における重要な疑問への解答を得ることが可能になります。したがって、本手法の主な利点は、再現性が高く個体差の少ないin vivo実験的脳転移を作製できることです。一般的に、この手法に慣れていない人は、顕微鏡下でマウスの頸動脈にがん細胞を注入するために、手を安定させるためのかなりの練習が必要であるため、最初は苦労します。この手順は、10% FPSを添加したDMEM F12培地を用いてがん細胞を播種し、注入前に1〜2日間培養することから始めてください。手術当日、細胞をインキュベーターから取り出し、細胞密度が70%から80%に達したところで、無血清培地で洗浄して回収します。次に、細胞を0.25%トリプシンとともに37°Cで1〜2分間インキュベートします。その後、インキュベーターから取り出し、トリプシン反応を停止させるため、DMEM F12培地を含む10%FBSを細胞に加えます。細胞を80 ×gで3分間遠心分離します。次に、培地を除去し、残留血清を取り除くために無血清で細胞を2回洗浄します。続いて、血球計数計で細胞数を数え、HBSSに再懸濁します。その後、注入時まで細胞を氷上で保持します。この手順では、ケタミン/キシラジンカクテルを腹腔内投与してマウスを麻酔させます。動物の足をつねり、反応がないことを確認して完全な麻酔状態であることを確かめてください。次に、シェービングまたは少量の除毛剤を用いて、頸部の被毛を除去します。次に、マウスをガラスプレートの上に置き、ゴムバンドで固定します。ポビドンヨードを含む 70%alcohol で皮膚を清浄します。その後、外科用メスを用いて、皮膚に約 1 cm の切開を加えます。次に、外科用ピンセットを用いて筋肉を鈍的に剥離し、下にある頸動脈を露出させます。外科用ピンセットで、頸動脈を隣接する迷走神経から分離します。その後、2か所に縫合糸をかけます。1つを遠位に、もう1つをコットンボールの近位に結び、緩い結び目を作ります。近位の結び目を締め、注入部位への血流を遮断します。その後、小さなコットンボールを緩衝液で湿らせ、予定の注入部位の頸動脈の下に配置します。その後、綿球上の頸動脈に新鮮な赤色の血液が十分に充満していることが確認できれば、がん細胞の注入に進みます。このステップでは、がん細胞をボルテックスし、100 µLをシリンジに吸引します。解剖顕微鏡下で、綿球の上に位置する頸動脈の腔内に、31Gの針を面取り部を上にしてゆっくりと挿入します。シリンジを用いて、細胞を頸動脈内にゆっくりと注入します。緩衝液で希釈したがん細胞が血流に入ると、周囲の血管や

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頭蓋内同所性モデル:マウス脳にがん細胞を移植する手技

このビデオは、蛍光標識された癌細胞の頸動脈内注射による脳転移マウスモデルの確立を示しています。マウスモデルは、新しい治療法の効果とその基礎となる生理学的メカニズムを研究するために使用できます。...

脳転移マウスモデル:頸動脈内がん細胞注入による脳転移マウスモデル作製法

出典:Lim, M., et al.がん細胞の内部頸動脈注射による脳転移のモデリング。J. Vis.

がん細胞の内部頸動脈注入による脳腫瘍転移のモデリング

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縦MRIが続く乳がんの脳転移のマウスモデルを開発するために、超音波画像誘導心臓内注射

頭蓋内脳転移のモデル化は、腫瘍の大きさと治療に対する反応を正確かつタイムリーな方法で監視できないことによって複雑になる。提示された方法論は、磁気共鳴画像分析と頭蓋内腫瘍注射を組み合わせ、これを組み合わせると、正確で一貫した注射、強化された動物モニタリング、および正確な腫瘍体積測定を育成する。...

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脳転移は、癌患者の重度の罹患率と死亡率の原因です。ほとんどの脳転移マウスモデルは、死亡率および治療介入結果の交絡分析を混乱させる全身性転移によって複雑になります。ここに提示されるのは、最小限の全身腫瘍で一貫した頭蓋内腫瘍を生成する癌細胞の内部頸動脈注射のためのプロトコルです。...

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中枢神経系(CNS)腫瘍は、小児のがん関連死の主な原因であり、局所免疫ベースの治療法は、臨床試験で患者に対してますますテストされています。このプロトコルは、CNS腫瘍を標的とする免疫療法注入の前臨床評価のためのマウスへの局所カニューレ移植の方法を記載しています。...

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学ぶマウス頸動脈内癌細胞注入法による脳転移モデル作成技術。高い再現性と低い変動性で新規治療法の評価を可能にし、脳転移研究の信頼性向上に貢献する。

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