エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成

この手順の全体的な目標は、非共和性エピソームベクターを使用して、成人ヒト末梢血単核細胞からiPS細胞を生成することです。このプロトコールは、疾患モニタリング、薬物スクリーニング、および定期的なラジオ医療のためのiPS細胞の生成を希望する幹細胞分野の科学者に役立ちます。当社のリプログラミングプロトコルは非常にシンプルでありながら、非常に効率的です。

この手順に従うと、血球のリプログラミングの技術を簡単に習得できます。血漿の品質は、リプログラミングを成功させるために重要です。汚染物質はリプログラミング効率を低下させる可能性があるため、エピソームプラスミドの精製にはEndofreeキットの使用をお勧めします。

iPS細胞は他の細胞に比べて壊れやすい細胞です。遺伝子の通過中に複数の細胞を調製すると、特に初期の継代で大量の細胞死が誘発される可能性があります。この手順を開始するには、添付の原稿に従って必要なすべての培地を準備します。

次に、10 mLの新鮮なPBサンプルと10 mLのPBSバッファーを50 mLのチューブに混ぜ合わせ、よく混合します。PBSを室温または摂氏37度に戻してから使用してください。次に、チューブの底に10mLのフィコールを加えます。

このプロセスは、フィコール層がPBと混ざらないようにゆっくりと実行する必要があります。混合物を400 x gで30分間、低加速および低減速で遠心分離します。遠心分離後、PB MNCはPBプラズマとフィコールの間に位置する白い層にあります。10 mLのPB血漿をバフフィコール層を乱さずにゆっくりと吸引します。.

次に、白い層を新しい50mLチューブに慎重に回収します。白色層から採取した細胞の総量は、約3〜6mLであるべきである。その後、PBSを加えて総容量を30mLにし、よく混ぜます。

次に、サンプルを400 x gで10分間遠心分離します。10分後、上清を取り除き、細胞ペレットを20 mLの培地に再懸濁します。よく混合し、サンプルを400 x gで5分間遠心分離して、血小板の大部分を除去します。

その後、上清を除去し、細胞ペレットを1〜2mLのIMDMに再懸濁します。細胞は、すぐに培養するために使用することも、後で使用するために凍結することもできます。凍結保存のために、同量の凍結保存培地を追加します。

細胞をクライオバイアルに分注し、すぐに摂氏80度の冷凍庫に移します。この手順では、15 mLのチューブに5 mLのIMDM培地を調製します。凍結したPB MNCを摂氏37度のウォーターバスですばやく解凍してから、IMDM培地でチューブに移します。

サンプルを400 x gで5〜10分間遠心分離します。その後、上清を取り除き、細胞ペレットを赤血球培地に再懸濁します。次に、血球計算盤を使用して顕微鏡で細胞をカウントします。

続いて、非組織培養でPB MNCを培養し、5%二酸化炭素加湿インキュベーターで37°Cでウェルあたり2mLの培地で6ウェルプレートを処理しました。3日目と5日目に、培地を変更せずに、1 mLの新鮮な赤血球培地を各ウェルに直接加えます。6日目に、ヌクレオフェクションのためにPB MNCを収穫します。

ヌクレオフェクションの1日前に、組織培養物を処理した6ウェルプレートを摂氏37度で0.1%ゼラチンで20分間プレコートします。不活化したMEFフィーダー細胞を摂氏37度の水浴で解凍し、すぐに5 mLのMEF培地を含む15 mLのチューブに移します。次に、400 x gで5分間遠心分離し、上清を取り除きます。

次に、ゼラチンを6ウェルプレートから取り出し、細胞ペレットをMEF培地に再懸濁します。その後、不活化MEF細胞をゼラチン前処理した6ウェルプレートの各ウェルの2mLのMEF培地に播種し、5%二酸化炭素加湿インキュベーターで摂氏37度で培養します。ヌクレオフェクションの日に、MEF培地を吸引し、1mLの赤血球培地と交換します。

次に、5%二酸化炭素加湿インキュベーターで37°Cで10〜30分間、培養プレートを事前に平衡化します。2マイクログラムのPEV OCT4をSox2に加え、1マイクログラムのPEV MYC、1マイクログラムのPEV KLF4、および0.5マイクログラムのPEV Bcl-XLを1.5mLの滅菌チューブに入れます。.チューブを50°Cで5分間加熱して汚染を防ぎ、室温まで冷却します。

その後、57マイクロリットルのヌクレオフェクションバッファーと13マイクロリットルのサプリメントバッファーをサンプルに加えます。200 x gで7分間遠心分離することにより、5 mLチューブに10〜6回培養PBMNCを2回10回回収します。その後、上清を取り除き、プラスミドとヌクレオフェクションバッファーの混合物を細胞ペレットに加えます。

その後、チューブを指でフリックしてよく混ぜます。次に、細胞懸濁液中のDNAをキットが提供するキュベットに移し、キュベットにキャップをします。ヌクレオフェクションデバイス上のプログラムU-008を選択します。

続いて、キュベットをホルダーに挿入し、[OK]を押します。その後、キュベットをホルダーから取り出します。0.5〜1 mLの予熱赤血球培地を各キュベットに加え、細胞を事前に平衡化したMEFプレートに直ちに移します。一部のサンプルでは、1ミルの血液から数千のコロニーが得られる場合があります。

さらなる培養のために単一のコロニーを選択したい場合は、わずか100万個の細胞で1つの追加のウェルを播種する必要があるかもしれません。低酸素チャンバーをインキュベーターに入れる直前に、チャンバーを数回静かに揺さぶって、培養ウェル内の細胞が均一に分布するようにします。次に、プレートを低酸素チャンバーに移します。

混合ガスでチャンバーを1〜2分間、毎分20リットルの速度で洗い流します。その後、チャンバーを密閉し、サンプルを摂氏37度で培養します。ヌクレオフェクション後2日目に、2 mLのiPSC培地を各ウェルに直接加えます。

ヌクレオフェクション後4日目に、培地3 mLを取り出し、新鮮なiPSC培地を2 mL追加します。この段階では、ほとんどの生細胞がフィーダー層に付着しています。ヌクレオフェクション後6日目以降、500マイクロリットルの使用済み培地を残し、14〜18日目まで0.25ミリモルの酪酸ナトリウムを補充した新鮮なE8培地2mLを追加して、2日ごとに培地を交換します。

ここに示されているのは、末梢血細胞を再プログラミングするためのプロトコルの概略図です。この画像はボウルに立っているAPを示しており、この画像はPB MNCの核形成後14日目の典型的なESC様iPSCコロニーを示しています。以下は、TRA-1-60またはSSEA4を発現する5番通路におけるiPSCの代表的なFACS図です。

以下は、NANOGとOCT4を発現するiPS細胞コロニーの代表的な共焦点画像です。ここの画像は、3つの細菌層すべてを含むテラトーマのH&E染色を示しています。このビデオを見れば、ヒト末梢血単核細胞からインテグレーションフリーiPS細胞を生成する方法についてよく理解できるはずです。

使いこなせば、3週間で大量のiPS細胞を作れるので、手がける時間は3時間未満です。私たちは、効率的な血球リプログラミングのためのシンプルなエピソームベクターシステムを開発しました。この手頃な価格のシステムは、特にリソースが限られている小規模なラボで簡単に採用できると考えています。

人間の血液や血漿を扱う作業は危険な場合があり、この手順を実行する際には手袋や白衣を着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。