Name: エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学ぶ エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリーiPSC生成法。非統合型ベクターで安全かつ効率的に多能性幹細胞を作製し、疾患モデリングや創薬研究に応用する技術を習得できます。

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この作業は、中国科学技術部(2015CB964902、2013CB966902、2012CB966601)、中国国家自然科学基金会(81500148、81570164、81421002)、ロマリンダ大学医学部GCAT助成金(2015)、遠隔医療および先端技術研究センター(W81XWH-08-1-0697)の支援を受けました。

人間のPBサンプルのすべてが地元の研究倫理委員会の承認を得て、天津血液センターから入手可能な無識別情報と匿名の成人ドナーから得ました。 1.遠藤フリープラスミドの調製<ol><li>製造業者のプロトコルに従って大腸菌からエピソームベクターを抽出するために商業的なプラスミド精製マキシキットを使用してください。最後のステップでは、DNAペレットを溶解するためにエンドトキシンフリー滅菌水でTE緩衝液に置き換えてください。 </li><li>商業UV /可視分光光度計を用いてDNA濃度を測定します。濃度は、それぞれ1.8と2.0、より大きいA260 / A280およびA260 / A230比で、1μgの/μLよりも通常大きいです。 </li></ol> 2.文化メディア<ol><li>赤血球培地を調製：100ng / mlのヒト幹細胞因子（SCF）、10ng / mLのインターロイキン3（IL3）、2 U / mLのエリスロポエチン（Eを補充した造血幹細胞増殖培地PO）、20 ngの/ mLのインスリン成長因子1（IGF1）、1μMのデキサメタゾンおよび0.2mMの1-チオグリセロール。 0.22μmのシリンジフィルターで滅菌フィルター。赤血球媒体は最大1ヶ月間4℃で保存することができます。 </li><li> IPSC媒体を準備：1×L-グルタミン、1×ペニシリン/ストレプトマイシン、1×非必須アミノ酸溶液、50 ngの/ mLの線維芽細胞増殖因子2（FGF2を添加したDMEM / F12培地（ダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物F-12） ）、1×インスリン - トランスフェリン - セレンサプリメント（ITS）、および50mg / mLのアスコルビン酸。 0.22μmのシリンジフィルターで滅菌フィルター。 IPSC媒体は、1ヶ月まで4℃で保存することができます。 </li><li> ; 1×ペニシリン/ストレプトマイシン及び10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（高グルコースDMEM）：MEF培地を準備します。 0.22μmのシリンジフィルターで滅菌フィルター。 MEF培地は、1ヶ月まで4℃で保存するか、あるいは使用前に新たに1×L-グルタミンを追加することができます。 </li><li> Prepare IPSC凍結保存培地（2回）：37℃の水浴中に滅菌水30mL中のD-トレハロース5gを溶解します。 4℃に温度を持参した後、FBS 10mLのジメチルスルホキシド10mLの（DMSO）を追加します。 0.22μmのシリンジフィルターで滅菌フィルター。 3ヶ月まで24、4℃で保管してください。 </li></ol>末梢血単核細胞の単離3（PBのMNC） <ol><li> 50 mLのチューブに10 mLの新鮮なPBサンプルと10 mLのPBS緩衝液を合わせ、よく混ぜます。使用前にRTまたは37℃にPBSを持参してください。 注：約1から3×10 6のMNC（新鮮または凍結保存した）は、PBの1ミリリットルから得ることができます。培養中に成熟した細胞の死による1×10 6総細胞-培養6日後、0.5を持っていることを期待しています。約1×10 7細胞を、新鮮なPBの10ミリリットルから得ることができます。 </li><li>長い針に取り付けた10 mLの注射器を使用して、チューブの底に10mLのフィコールを追加します。このプロセスは、フィコール層はPBと混合しないことを確実にするために、ゆっくりと行うべきです。 </li><li>低加速と減速の速度で30分間、400×gで遠心分離します。遠心分離した後、PBの多国籍企業は、PBプラズマとフィコールの間に位置する白層（軟膜）です。 </li><li>ゆっくりとバフィーコート層を乱すことなく〜10mLのPBプラズマを吸引除去します。慎重に新しい50mLのチューブに1 mLのピペットチップを用いた白色層を収穫。 6 mLの - 白層から採取した細胞の総容積は3の間であろう。 </li><li> 30 mLまで全量を10 mLのピペットでよく混合するためにPBSを追加します。 10分間400×gで遠心分離します。 </li><li>上清を除去し、20 mLの培養液中で細胞ペレットを再懸濁（ すなわちイスコフ改変ダルベッコ培地、IMDM）とよく混ぜます。血小板の大部分を除去するために10分間、400×gで遠心分離します。 </li><li>上清を除去し、1で細胞ペレットを再懸濁 - 2 mLのIMDM。細胞は、fを使用することができますまたは即時文化、または後で使用するために凍結ダウン。凍結保存のために、凍結保存培地の同量を追加します。クライオバイアル中のアリコートの細胞（0.5 - 1バイアルあたり1mL）および転送は直ちに-80℃の冷凍庫にクライオバイアル。 PBの多国籍企業は、数週間のために-80℃の冷凍庫に保存されている、または長期保存のために液体窒素タンクに移すことができます。 注：凍結細胞を解凍する場合、当社の凍結保存培地は、細胞の生存率を維持することができるが、細胞数は、解凍処理中により細胞死を減少させることができます。 10×10 7個の細胞を各バイアル中で凍結されます- 1がすることをお勧めします。 </li></ol>赤血球中でのPBの多国籍企業の4拡大<ol><li> 15 mLチューブに5 mLのIMDM培地を準備します。すぐに37℃の水浴中で凍結したPBの多国籍企業を解凍した後、IMDM培地をチューブに移します。 注：水浴中で時間の長さは、凍結保存細胞の体積およびクライオバイアルのuに依存しますSED。通常、凍結した細胞は、1分以内に解凍します。 </li><li> 10分 - 5用の400×gで遠心分離します。上清を除去し、赤血球培地中で細胞ペレットを再懸濁します。 10μLの細胞懸濁液を10μLのトリパンブルー溶液を加え、よく混ぜます。 3分 - トリパンブルーが1以内に死細胞を染色します。血球計数器を用いて、顕微鏡下で細胞を数えます。 </li><li>非組織培養（非TC）で培養PBの多国籍企業は、5％のCO 2中、37℃で約5×10 6細胞/ mLの細胞密度で、ウェルあたり2mLの培地で6ウェルプレートに扱わ加湿インキュベーター。 </li><li> D 3と5で培地を変更することなく、各ウェルに直接1 mLの新鮮な赤血球媒体を追加します。 </li><li> D 6では、ヌクレオのためのPBの多国籍企業を収穫。 </li></ol> 5. PB MNCヌクレオとリプログラミング<ol><li>一日20分間、37℃で0.1％ゼラチンとヌクレオ、プレコートTC処理した6ウェルプレートの前に。解凍不活性化されたマウス胚性ファイブロ37℃の水浴中で爆発（MEF）フィーダー細胞と直ちにMEF培地5mlを含む15 mLチューブに移します。 </li><li> 5分間400×gで遠心分離し、上清を除去します。 、6ウェルプレートのゼラチンを除去MEF培地中で細胞ペレットを再懸濁し、そしてゼラチン前処理6ウェルプレートに移します。各ウェルに、シード2 - 4×10 5、2 mLのMEF培地中に懸濁MEF細胞を不活性化。 </li><li> 5％CO 2の加湿インキュベーター中で37℃で培養MEFフィーダー細胞。 </li><li>ヌクレオの日に、MEF培地を吸引し、1 mLの赤血球培地に交換してください。 5％CO 2の加湿インキュベーター中、37℃で30分間- 10培養プレートを予め平衡化。 </li><li> 1.5 mLの滅菌したエッペンドルフチューブに2μgのPEV-OCT4-2A-SOX2、1μgのPEV-MYC、1μgのPEV-KLF4、および0.5μgのPEV-BCL-XLを追加します。汚染を防止し、RTまで冷却し、5分間50℃でチューブを加熱します。加えます57μLの緩衝液および13μLサプリメントヌクレオ。 </li><li>収穫7分間、200×gで遠心分離することにより、5 mLチューブに2×10 6培養PBの多国籍企業。上清を除去し、細胞ペレットにプラスミド及びヌクレオバッファーミックスを追加します。指でチューブをフリックでよく混和します。 注：2×10 5細胞できるだけ低くはヌクレオのために使用することができるが、より低い初期化の効率も同様に期待されるべきです。 </li><li>キットで提供キュベットにDNAや細胞懸濁液を移し、キュベットキャップ。ヌクレオデバイス上でプログラムU-008を選択します。ホルダーにキュベットを挿入し、U-008プログラムを適用するには、[OK]を押します。 </li><li>すぐに予め平衡化MEFプレートに1mLの予め温めておいた赤血球各キュベット内のメディア、および転送細胞 - ホルダーのうちキュベットを取り、0.5を追加します。高い再プログラミング効率とドナーの変動による、1-10×10 5細胞のpの範囲のセルの異なる数を播種えーも非常に奨励されています。 </li><li>低酸素室にプレートを転送し、そして1について、92％のN 2、5％CO 2および3％O 2の混合ガスをチャンバーをフラッシュ- 20 L /分の速度で2分間。室を密閉した後、培養細胞を37℃で。 </li><li> D 2ポストヌクレオでは、各ウェルに直接2mLのIPSC媒体を追加します。 </li><li> D 4のポストヌクレオでは、培地の3ミリリットルを削除し、2 mLの新鮮なIPSC媒体を追加します。 D 4のポストヌクレオで、生細胞の大部分は、フィーダー層に付着しているであろう。 </li><li> 18 - D 6ポストヌクレオした後、500μLを残すことにより、培地を変更するごとに2 dはD 14まで0.25 mMの酪酸ナトリウムを添加した培地および2mLのを追加し、新鮮なE8媒体を過ごしました。 注：追加のフィーダー細胞は、フィーダー細胞が分離されていることを観察するたびに、培養ウェルに添加してもよいです。 （5.1および5.2を参照）のMEFを解凍した後、 すなわち 〜0（E8媒体少量の細胞ペレットを再懸濁します。その後、2 6ウェルプレートの1ウェルについてmL）を、培養ウェルにしたMEFを追加します。約2％FBSを細胞接着を増大させるために添加されてもよいです。代替的に、MEF馴化培地を使用することもできるが、それは、より面倒です。 </li></ol> iPS細胞の6.増設注： - 10ポストヌクレオほとんどのケースでは、IPSCの多数のコロニーは、D 8に表示されます。 D 14の後、大きなIPSCコロニーは通常、ピッキングの準備ができています。 <ol><li>コロニーを選ぶ前に、フィーダーまたはマトリゲル被覆された24ウェルプレートの1ウェル中で、ROCK阻害剤、Y27632（10μM）を補充した500μLE8媒体を追加します。スクラッチに10または20μLのピペットを使用して、顕微鏡下でコロニーを選択します。培養液を含むウェルに各コロニーの部分を転送します。 注：マトリゲルの濃度は、1バッチから別のものに異なります。マトリゲルの100希釈：通常、我々は1を使用します。 <ol><li>交差汚染を回避するために、選択広く、他のものから分離されたコロニー。 5％CO 2の加湿インキュベーター中で37℃で培養性IPSC。 注：コロニーの数十または数百は6ウェルプレートの各ウェルに存在する場合IPSC集団が原因で細胞遊走に対するポリクローナルであってもよいことに留意すべきです。 </li></ol></li><li>最初の2日間培地を変更しないでください。 ROCK阻害剤は、小さなコロニー25の生存を促進することができます。 </li><li>以降D 2から、使用済み培地を除去し、各ウェルに500μLの新鮮E8媒体を追加することで、毎日培地に変更。 </li><li>約1週間後、コロニーが十分に大きい場合、培地を除去し、1 37℃で300μLの細胞分離溶液（PBS中の0.5mMのEDTA）で細胞を治療する - 3分。細胞剥離溶液を除去し、iPS細胞を中断するROCK阻害剤（10μM）を含むE8媒体を追加します。過剰な細胞死につながる可能性があり、単一の細胞にコロニーを分解しないでください。 50セル - 5と細胞塊SはIPSC通過するのに適しています。 </li><li>フィーダまたはマトリゲルでプレコートされた12-または6-ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液を100％ - 転送50。 </li><li>マトリゲル被覆プレート（6.1の注を参照）長期培養のために、毎日培地を変更します。細胞集密度が40に達すると - 60％、約3分間、37℃で1mLの細胞分離溶液（PBS中の0.5mMのEDTA）で細胞を処置します。コロニーが丸くする起動すると、細胞剥離液を除去し、iPS細胞を中断するROCK阻害剤（10μM）を含むE8媒体を追加します。流路4の分割係数を有する細胞 - 8生存率を増加させるために細胞を継代時にROCK阻害剤を添加する必要があり、および分化を防止するために1次元後に除去しました。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って5分 - フリーズダウンするにはiPS細胞を、3 37℃で細胞剥離液で細胞を処理します。 IPSCコロニーを丸くするために開始すると、バッファを吸引し、0.5を追加 - 1 mLのE8媒体を。 </li> &lt;李&gt;は細胞懸濁液に凍結保存培地を等量加え、よく混ぜます。凍結性IPSCは、数週間または長期保存のために液体窒素で-80℃の冷凍庫に保存することができます。 </li></ol>残留エピソームプラスミドのないiPS細胞の7選択<ol><li>通路5の後、収穫性IPSCおよびゲノムDNAを抽出します。 注：通常、培養5継代後、残留エピソームプラスミドが検出されません。このように、ほとんどすべての5（ すなわち通路10）上記の通路でIPSCコロニーのは、残留エピソームプラスミドを欠いています。 </li><li>ネガティブコントロールとしてトランスフェクトしていないPBの多国籍企業からのゲノムDNAを使用してください。細胞あたりのPEVプラスミドのコピーで細胞を模倣するために1μgのネガティブコントロールDNAに1.6 pgのPEV-OCT4-2A-SOX2プラスミドを追加します。 </li><li> 100 ngのゲノムDNAおよび1μLの特異的プライマーを含む9μLPCRグレードの水を追加します（10μMフォワードの各プライマーおよびリバースプライマー）高忠実度PCRマスターミックス10μLに。午前のノーマライズGAPDHによるDNAのount。 EBNA1-F TTTAATACGATTGAGGGCGTCT、EBNA1-R GGTTTTGAAGGATGCGATTAAG、WPRE-F GGTTTAAACGCGTCGACAAT、WPRE-R GTTGCGTCAGCAAACACAGT、GAPDH-F GAGTCCACTGGCGTCTTC、GAPDH-R GACTGTGGTCATGAGTCCTTC：PCR用の以下のプライマーを使用してください。 </li><li> 60秒間、98℃で反応混合物をインキュベートし; 10秒、30秒、60℃、30秒、72°C、98°Cに続きます。 30サイクルの後、 5分間72℃で反応を延長します。 </li><li>負荷1％アガロースゲルの各ウェル中5μLのPCR産物。さらに文化や下流の分析のためのEBNA1およびWPREのための検出不可能なバンドでIPSCクローンを選択し、100Vで30分間 - 20用のゲルを実行します。 </li></ol> 8.フローサイトメトリー<ol><li>単一細胞懸濁液を得るために5分 - 3 37℃でのAccutaseでそれらを処理することにより収穫性IPSC。 5×10 5細胞- 1（100μLの細胞懸濁液に1μLPE結合抗TRA-1-60またはeFluor 570結合抗SSEA4またはアイソタイプの抗体を追加）5 mLチューブです。 20分間室温で暗所でチューブをインキュベートします。 </li><li> RTで20分間染色した後、5分間400×gで2 mLのPBSと遠心を追加します。細胞分析フローサイトメトリーを用いて、蛍光活性化細胞選別（FACS）分析のために300μLのPBSで細胞を再懸濁し。 23,26 </li></ol> 9.共焦点イメージング<ol><li>マトリゲルコーティングされたチャンバースライド中の種子性IPSC。 </li><li> 3後 - 培養の4日間、増殖培地を除去し、30分間室温で4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定します。 PBSで細胞を2回洗浄します。 注：PFAは、有毒、有害です。 </li><li>室温で30分間PBS中0.1％トリトンX-100（PBS-T）で細胞を処置します。 PBSで細胞を2回洗浄します。 </li><li> RTで1時間：ブロッキング緩衝液（V PBS中の5％ヤギ血清、V）で細胞をブロックします。 </li><li>ブロッキング工程の間に、ブロッキング緩衝液中で一次抗体（100倍）を希釈します。 注：抗体情報は、 材料/機器の表に記載されています。 </li><li> 4°CO / Nで希釈した抗体を用いて細胞をインキュベートします。 </li><li> 15分間、PBSで2回、続いて15分間、PBS-Tで二回洗浄します。 </li><li>室温で2時間希釈したフルオロフォア結合二次抗体で細胞をインキュベートします。 </li><li> 15分間、PBSで2回、続いて15分間、PBS-Tを用いて細胞を2回洗浄します。 </li><li> 10分間室温でPBS中DAPI（1μg/ ml）で核を染色。 </li><li> 15分間、PBSで細胞を2回洗浄します。 </li><li>共焦点顕微鏡で画像をキャプチャします。 23,27 </li></ol> 10.奇形腫アッセイ希釈した200μLのDMEM / F12における細胞剥離液（PBS中の0.5mMのEDTA）を再懸濁細胞と収穫1×10 6 iPS細胞（1：1）マトリゲル。 <ol><li>皮下には、NOD / SCID免疫不全マウスの背面ハンチに細胞を注入します。 </li><li> IPSCの注射後12週、10％ホルマリンで奇形腫を分析して修正 - 8時。 28 </li><li>マイクロセクションの後とヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）で染色し、サンプルを分析します。 29 </li></ol>

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</ol>

著者には、開示すべき競合または相反する利益はありません。

健康なドナーや患者から血液サンプルを取得したことで、それ基礎研究および臨床細胞治療のための魅力的な細胞源作り、便利で非侵襲的です。ここでは、末梢血サンプルから統合フリーiPS細胞の非常に効率的に生成するためのプロトコルを記載しています。この再現性と手頃な価格のアプローチは、IPSCフィールドに利益をもたらすべきです。 我々は非常に効率PBの再プログラミング30を担当する2つの重要な要因があることを報告しています。一つは、図2（a）のリンカー31を用いて、OCT4およびSOX2の等モル表現です。これを達成するために、PEV-OCT4-2A-SOX2は、このプロトコルで使用されています。もう一つは、我々が以前に30を使用していることを代わりにPEV-MYC-2A-KLF4のMYCおよびKLF4を発現させるための二つのプラスミドPEV-MYCとPEV-KLF4の使用です。 KL：一見単純な変更は、主にMYCの緩やかと大きく増加したことによるものであるPBの再プログラミング効率の約100倍の増加につなが...

いくつかの転写因子の強制発現した後、 （ すなわち OCT4、SOX2、MYCおよびKLF4）、体細胞は再生医療や細胞置換療法1-3のアプリケーションのための偉大な約束を保持して誘導された多能性幹細胞（性IPSC）に再プログラムすることができます。これまでに、さまざまな方法は、再プログラミング4-7の成功率を高めるために開発されてきました。ウイルスの統合が再プログラミング因子の高レベルの安定な発現を導くためのウイルスベクターによって誘発される再プログラミングが広く、iPS細胞の効率的な生成のために使用されます。しかし、細胞のゲノム中へのベクターDNAの永久的な統合は、挿入突然変異5を誘導し得ます。また、初期化因子の不十分な不活性化は、iPS細胞の分化8を妨害することができます。このように、初期化因子の統合なし性IPSCの使用は、特に、細胞療法用途における使用のために、必須です。 9からの二つの要素、ウイルス複製（のoriP）およびEB核抗原1（EBNA1）の起点を含むプラスミドです。 EBNA1エレメントは宿主細胞の分裂時のエピソームの分割を可能にする染色体DNAにoriPを含むプラスミドDNAを係留しながらのoriPエレメントは、哺乳動物細胞中でのプラスミドの複製を促進します。センダイウイルス（SV）およびRNAのトランスフェクションを含む他の統合フリーアプローチと比較して、電気自動車は、複数の利点5,6,10を有します。彼らは非常に手頃な価格、プラスミドDNAとしては、電気自動車は、容易に製造することができ、家の中で修正されました。また、EVに再プログラミングすることは、いくつかのRNAのトランスフェクションが成功した再プログラミングのために必要であるのに対し、電気自動車を持つ単一のトランスフェクションは、IPSCの世代のために十分であるため、少ない労働集約的なプロセスです。 Dermal線維芽細胞は、多くの初期化研究に使用されてきました。しかし、皮膚生検は侵襲的で痛みを伴うプロセスだけでなく、再プログラミングのために十分な量に細胞を拡大するために時間がかかるだけではありません。大きな懸念されるのは、成人ドナーの皮膚細胞は、多くの場合、このように皮膚線維芽細胞11,12由来iPS細胞用のアプリケーションを制限し、腫瘍に関連する変異につながる可能性があり、長期UV光放射線にさらされてきました。最近、正常なヒトの皮膚細胞は強い正の選択13の下にあり、皮膚の扁平上皮細胞癌の主な要因のほとんどを含む、体細胞変異及び複数の癌遺伝子を蓄積することが報告されています。 1）血液細胞を容易に低侵襲的方法によって得ることができるので、皮膚線維芽細胞とは対照的に、末梢血（PB）細胞は、2）末梢血細胞は、造血幹細胞の子孫であり、再プログラミングのための細胞の好ましい供給源であります骨髄中に存在する、したがって、有害な放射線から保護。末梢血単核細胞（PBのMNC）は、フィコール - ハイパック（1.077グラム/ ml）を用いて、単純な勾配遠心分離後、バフィーコート層からの時間で収集することができます。得られたPBの多国籍企業は、リンパ球、単球およびいくつかの造血前駆細胞（HPCの）14から構成されています。ヒトTリンパ球は、PBの主要な細胞型の一つである成熟がT細胞は、T細胞受容体（TCR）遺伝子の再配列を含み、従って、アプリケーション15,16のための可能性を制限する完全なゲノムを欠いています。しかし、IPSCの生成を介してT細胞の活性化は、キメラ抗原受容体（CAR）T細胞療法17-19における潜在的な用途を有することができます。比較において、のHPCは、無傷のゲノムを有しており、容易に再プログラム可能です。わずか0.01が-末梢循環中の0.1％の細胞でのHPCであり、これらの細胞はerythrの増殖を有利赤血球培地中でex vivoで拡大することができますOID前駆細胞14。 我々の以前の研究では、PBの再プログラミングefficency 20で10倍に増加した山中因子（OCT4、SOX2、MYCおよびKLF4）に加えて、因子BCL-XLを使用していました。またBCL2L1として知られているBCL-XLは、カスパーゼ21,22の活性化を阻害することにより、細胞死の強力な阻害剤です。しかし、BCL-XLはまた、多能性21,22を維持する上で重要な役割を果たし得ます。最近、我々はさらに、別途再プログラミング効率23で約100倍増加につながる2つのベクトルでMYCおよびKLF4を発現させることにより、当社のEV再プログラミングシステムを最適化しました。健康なドナーからの0.5％ - この方法を使用して、トランスフェクション時の細胞数を開始することによって分割コロニー数で定義された再プログラミング効率は、0.2です。以下のように、我々はPBから統合フリーiPS細胞を生成するための詳細な実験手順を説明します。

<table><tbody><tr><td>造血幹細胞増殖培地</td><td>Sigma</td><td>S0192</td><td>4°Cで保存。C</td></tr><tr><td>ヒト幹細胞因子 (SCF)</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td> -<td>20 または -80 °C で保管してください。C</td></tr><tr><td>インターロイキン-3 (IL-3)</td><td>ペプロテック</td><td>AF-200-03</td><td>-20 または -80 °C で保管。C</td></tr><tr><td>エリスロポエチン (EPO)</td><td>Peprotech</td><td>100-64</td><td>-20 または -80 °C で保存。C</td></tr><tr><td>インスリン成長因子-1 (IGF-1)</td><td>Peprotech</td><td>100-11</td><td>-20 または -80 °C;C</td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>Sigma</td><td>D4902</td> -<td>20 または -80 >C</td></tr><tr><td>1-チオグリセロール(MTG)</td><td>Sigma</td><td>M6145</td>は<td>-20または-80°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>DMEM/F12 ミディアム</td><td>Gibco</td><td>112660-012</td><td>4 °で保管;C</td></tr><tr><td>L-グルタミン (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>-20 °C;C</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン (100x)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>-20 >C</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸溶液 (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>4 °C;C</td></tr><tr><td>線維芽細胞成長因子 2 (FGF2)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td> は <td>-20 または -80 °C で保管します。C</td></tr><tr><td>インスリン-トランスフェリン-セレン (ITS, 100x)</td><td>Gibco</td><td>41400-045</td><td>4°C;C</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>Sigma</td><td>49752</td><td>-20 °C;C</td></tr><tr><td>DMEM(高グルコース)培地</td><td>サーモ</td><td>SH30243.01B4</td><td>°Cで保存。C</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>ハイクロン</td><td>SV30087.01</td><td>-20 °C で保存。C</td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare, SIGMA</td><td>17-5442-02</td><td>RTで保管</td></tr><tr><td>トレハロース</td><td>Sigma</td><td>T9531</td><td>4°Cで保管;C</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>RTに保管し、光から保護する</td></tr><tr><td>Endofree Plasmid Maxi Kit (10)</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>RTに保管</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>21056-023</td><td>4°Cで保管;C</td></tr><tr><td>ヒト CD34+ 細胞核吸収キット</td><td>ロンザ</td><td>VPA-1003</td><td>RT で保存し、核吸収バッファーとサプリメントは 4 °C で保存する必要があります。C</td></tr><tr><td>酪酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>B5887-20</td><td>または-80&degで保存。C</td></tr><tr><td>ROCK阻害剤 - Y27632</td><td>STEMGENT</td><td>04-0012-10</td><td>-20°Cで保管。C</td></tr><tr><td>エッセンシャル 8 基礎中 (E8)</td><td>Gibco</td><td>A15169-01</td><td>4 °C で保管。C、サプリメントは-20または-80&degで保存する必要があります。C</td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>BD</td><td>354277</td><td>-20 または -80 >C</td></tr><tr><td>2x EasyTaq PCR SuperMix (+dye)</td><td>TransGen Biotech</td><td>AS111</td><td>-20 °C;C</td></tr><tr><td>細胞剥離液</td><td>STEMGENT</td><td>01-0006</td><td>-20°Cで保存。C、単一細胞懸濁液</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>シグマ</td><td>D9542-1MG</td>を<td>4または-20°で保存するための細胞剥離溶液としてのアキュターゼ;C</td></tr><tr><td>Anti-Nanog AF488</td><td>BD</td><td>560791</td><td>4 °で保存。C、免疫蛍光法に使用した一次抗体、使用時に1/100を希釈</td></tr><tr><td>Anti-OCT4</td><td>abcam</td><td>ab19857</td> 4<td>°Cで保存;C、免疫蛍光法に使用した一次抗体、</td></tr><tr><td>AF488 ロバ抗マウスIgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td>を使用した場合、1/100を希釈し、<td>4°Cで保存します。C、免疫蛍光法に使用した二次抗体、&nbsp;PE</td></tr><tr><td>抗ヒトTRA-1-60-R抗体</td><td>Biolegend</td><td>330610</td>使用時1/500を希釈します <td>4°Cで保存してください。C、フローサイトメトリーに使用される抗体</td></tr><tr><td>eFluor 570-conjugated anti-SSEA4</td><td>eBioscience</td><td>41-8843</td><td>4 >C、フローサイトメトリーに使用される抗体</td></tr><tr><td>アイソタイプ抗体</td><td>eBioscience</td><td>11-4011</td><td>4°Cで保存します。C、フローサイトメトリーに使用される抗体</td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼ検出キット</td><td>SiDanSai</td><td>1102-100</td><td>4°Cで保存。C</td></tr><tr><td>ゲノムDNA抽出キット</td><td>TIANGEN</td><td>DP304-02</td><td>RTに保存</td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>RTに保存</td></tr><tr><td>フローサイトメトリー セルアナライザー</td><td>BD</td><td>LSRII</td><td></td></tr><tr><td>スピニングディスク共焦点顕微鏡(SDC)</td><td>PerkinElmer</td><td>UltraVIEW VOX</td><td>共焦点イメージング</td></tr><tr><td>用 ヌクレオフェクションデバイス</td><td>ロンザ</td><td>・ヌクレオフェクター 2b</td><td>PB MNC</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS-4010</td><td>GE</td><td></td>のヌクレオフェクション用で<td>、AP染色のバルク写真を撮影</td></tr></tbody></table>

エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

人工多能性幹細胞（性IPSC）は、病気のモデリングと再生治療のための偉大な約束を保持します。我々は以前に、末梢血単核細胞（PBのMNC）から統合フリー性IPSCを生成するエピソームベクター（EV）の使用を報告しました。使用するエピソームベクターは、それぞれ 、哺乳動物細胞におけるプラスミドの複製および長期保持を可能にエプスタイン-バー（EB）ウイルスからのoriPおよびEBNA1の要素、が組み込まれたDNAプラスミドです。さらなる最適化では、IPSCコロニーの数千人は、末梢血の1ミリリットルから得ることができます。高再プログラミング効率を達成するための2つの重要な要因は次のとおりです：1）2Aの使用は「自己切断」は、ペプチドは、このように二つの要因の等モル発現を達成し、OCT4およびSOX2をリンクします。 2）個別MYCおよびKLF4を発現させるための2つのベクトルの使用を。ここでは、統合のないIPアドレスを生成するためのステップバイステップのプロトコルを記述します成人の末梢血サンプルからのSC。残留エピソームプラスミドは5継代後に検出されないようにして生成性IPSCは、統合フリーです。再プログラミング効率は、センダイウイルス（SV）ベクターに匹敵するが、EVのプラスミドは、かなりより経済市販SVベクターよりいます。この手頃な価格のEVの再プログラミング・システムは、再生医療における臨床応用の可能性を保持し、統合のない間葉系幹細胞、神経幹細胞などにPBの多国籍企業の直接再プログラミングするためのアプローチを提供します。

このプロトコルを使用して、我々は1×10 5 nucleofected PB多国籍企業からのコロニーの数百を取得することができる（ 図1Aおよび図1B）。 0.5％のコロニーが多能性マーカー（ 図1Cおよび1D）を発現-再プログラミング効率は約0.2です。記載されたプロトコルを使用して生成されたiPS細胞は、統合含まず、3胚葉（ 図1Eおよび1F）を構成する奇形腫を形成する能力を有します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55091/55091fig1.jpg" /> 図1： 末梢血単核細胞から...

このプロトコルは、ヒトの成人末梢血細胞から統合フリーのiPS細胞を効率的に生成するための詳細な方法を説明しています。4つのoriP/EBNAベースのエピソームベクターを使用してリプログラミング因子(KLF4、MYC、BCL-XL、またはOCT4およびSOX2)を発現させることで、1 mLの末梢血から数千のiPS細胞コロニーを得ることができます。

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

本手順の目的は、非統合型エピソーマルベクターを用いて、成人ヒト末梢血単核細胞からiPS細胞を樹立することです。本プロトコルは、疾患モニタリング、薬剤スクリーニング、および一般的な放射線医学のためにiPS細胞の樹立を希望する幹細胞分野の研究者に有用です。我々のリプログラミングプロトコルは非常に簡便でありながら、極めて高い効率性を備えています。この手順に従うことで、血球リプログラミングの技術を容易に習得することができます。リプログラミングを成功させるには、プラスミドの品質が非常に重要です。不純物がリプログラミング効率を低下させる可能性があるため、エピソーマルプラスミドの精製にはEndofreeキットの使用を推奨します。iPS細胞は他の細胞よりも脆弱です。継代時に細胞を1時間以上放置すると、特に低継代回数の場合に大量の細胞死を誘発する可能性があります。この手順を開始する前に、付属の論文に従って必要なすべての培養液を準備してください。次に、10 mLの新鮮なPBサンプルと10 mLのPBSバッファーを50 mLチューブに入れ、よく混ぜ合わせます。PBSは使用前に室温または37 °Cに戻しておきます。その後、チューブの底に10 mLのficollを加えます。Ficoll層がPBと混ざらないように、この工程はゆっくりと行う必要があります。混合物を400 x gで30分間、加速および減速を低速に設定して遠心分離します。遠心分離後、PB MNCsはPB血漿とFicollの間に位置する白色層に回収されます。Ficollの緩衝層を乱さないように、PB血漿を10 mLゆっくりと吸引します。次に、白色層を慎重に回収し、新しい50 mLチューブに移します。白色層から回収された細胞の全量は、約3〜6 mLになります。その後、PBSを加えて全量を30 mLとし、よく混合します。次に、サンプルを 400 x g で10分間遠心分離します。10分後、上清を除去し、細胞ペレットを 20 mL の培地で再懸濁します。よく混合し、サンプルを 400 x g で5分間遠心分離して、血小板の大部分を除去します。続いて、上清を除去し、細胞ペレットを1〜2 mLのIMDMで再懸濁します。細胞はすぐに培養に使用するか、後で使用するために凍結保存します。凍結保存を行う場合は、等量の凍結保存液を加えます。細胞をクライオバイアルに分注し、直ちに-80°Cのフリーザーに移します。この手順では、15 mLチューブに5 mLのIMDM培地を用意します。凍結したPB MNCsを37°Cのウォーターバスで迅速に融解させ、IMDM培地が入ったチューブに移します。サンプルを400 x gで5〜10分間遠心分離します。その後、上清を除去し、細胞ペレットを赤血球系培地で再懸濁します。次に、血球計数計を用いて顕微鏡下で細胞数を計測します。続いて、組織培養処理を施していない6ウェルプレートを用い、1ウェルあたり2 mLの培地を加えて、37 °C、5% Carbon Dioxide、加湿条件のインキュベーター内でPB MNCsを培養する。3日目と5日目に、培地を交換せずに、各ウェルに1 mLの新鮮な赤血球系培地を直接添加する。6日目に、ヌクレオフェクション用にPB MNCsを回収する。ヌクレオフェクションの前日に、組織培養処理済みの6ウェルプレートを0.1%ゼラチンで37°C、20分間プリコートします。不活化MEFフィーダー細胞を37°Cの恒温水槽で融解し、直ちに5 mLのMEF培地を含む15 mLチューブに移します。次に、400 x gで5分間遠心分離し、上清を除去します。次に、6ウェルプレートからゼラチンを除去し、細胞ペレットをMEF培地で再懸濁します。その後、ゼラチンで前処理した6ウェルプレートの各ウェルに、2 mLのMEF培地とともに不活化MEF細胞を播種し、37 °C、5% carbon dioxide 湿潤インキュベーターで培養します。ヌクレオフェクション当日、MEF培地を吸引除去し、1 mLの赤芽球培地と交換します。その後、5%二酸化炭素加湿インキュベーターにて、培養プレートを37 °Cで10-30分間予備平衡化します。1.5 mLの滅菌チューブに、2 µgのPEV OCT4、Sox2、1 µgのPEV MYC、1 µgのPEV KLF4、および0.5 µgのPEV Bcl-XLを加えます。コンタミネーションを防ぐため、チューブを50 °Cで5分間加熱し、その後室温まで冷却します。その後、サンプルに57 µLのヌクレオフェクションバッファーと13 µLのサプリメントバッファーを加えます。培養したPBMNCを2×10⁶個、5 mLチューブに回収し、200 ×gで7分間遠心分離します。その後、上清を除去し、細胞ペレットにプラスミドとヌクレオフェクションバッファーの混合液を加えます。次に、チューブを指で軽く叩いてよく混ぜ合わせます。続いて、細胞懸濁液中のDNAをキット付属のキュベットに移し、キャップを閉めます。ヌクレオフェクション装置でプログラムU-008を選択してください。続いて、キュベットをホルダーに挿入し、OKを押します。その後、キュベットをホルダーから取り出します。各キュベットに予熱した赤血球培地を 0.5-1 mL 加え、速やかに細胞をあらかじめ平衡化したMEFプレートに移します。サンプルによっては、血液 1 mL から数千個のコロニーが得られる場合があります。さらなる培養のために単一コロニーをピックアップしたい場合は、1 million cellsのみを播種したウェルを1つ追加する必要があるかもしれません。低酸素チャンバーをインキュベーターに入れる直前に、チャンバーを数回そっと揺らし、培養ウェル内の細胞を均一に分散させます。その後、プレートを低酸素チャンバーへ移します。20 Liters/minの流量で、混合ガスを用いてチャンバー内を1〜2分間フラッシュします。その後、チャンバーを密閉し、サンプルを37 °Cで培養します。ニュークロフェクション後の2日目に、各ウェルにiPSC培地を2 mL直接添加します。ニュークレオフェクションの4日後、培地を3 mL除き、新鮮なiPSC培地を2 mL加えます。この段階では、生存細胞のほとんどがフィーダー層に接着しています。ニュークレオフェクションの6日後からは、14〜18日目まで、使用済みの培地を500 µL残し、0.25 mMの酪酸ナトリウムを添加した新鮮なE8培地を2 mL加えることで、2日ごとに培地を交換します。ここでは、末梢血細胞をリプログラミングするためのプロトコールの概略図を示します。この画像はボウルの中で維持されているAPを示しており、もう一方の画像はPB MNCsのニュークレフェクションから14日後の典型的なESC様iPSCコロニーを示しています。ここでは、TRA-1-60またはSSEA4を発現している継代5代目のiPSCの代表的なFACSダイアグラムを示します。以下は、NANOGおよびOCT4を発現するiPSCコロニーの代表的な共焦点画像です。こちらの画像は、3胚葉すべてで構成されるテラトーマのH&amp;E染色を示しています。このビデオを視聴することで、ヒト末梢血単核細胞からインテグレーションフリーのiPS細胞を作製する方法について十分に理解できるはずです。習得すれば、3週間で大量のiPS細胞を生成することができ、実作業時間は3時間未満で済みます。私たちは、効率的な血球細胞のリプログラミングのために、シンプルなエピソーマルベクターシステムを開発しました。この低コストなシステムは、特にリソースが限られている小規模な研究室でも容易に導入できると考えています。ヒトの血液および血漿の取り扱いは危険を伴う可能性があるため、本手順の実施中は手袋や白衣を着用するなど、適切な予防措置を講じる必要があることに留意してください。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

ここでは、単一のレンチウイルスベクターを用いたプログラミング末梢血の3-4...

STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成

ここでは、一貫性のある成果と効率向上を示しているセンダイウイルスと導入遺伝子のない人間性IPSCにヒト体細胞を再プログラムする当社の確立された手法を提案する。...

仙台ウイルスのヒト体細胞からの効率的な次世代ヒューマン誘導多能性幹細胞

ここでは、再プログラミング戦略とヒス​​トンデアセチラーゼ阻害剤ベースのエピソームを用いて末梢血からのヒト人工多能性幹細胞を生成するためのプロトコルを記述している。...

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末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

誘導多能性幹細胞（iPS細胞）が臨床応用および基礎研究のための患者特有の組織のソースを表します。ここでは、非組み込みエピソームプラスミドを用いてウイルスを含まないiPS細胞に凍結バフィーコートから得たヒト末梢血単核細胞（PBMNCs）を再プログラムするために詳細なプロトコルを提示します。...

非統合ソームプラスミドを用いて凍結軟膜から誘導多能性幹細胞の生成

このプロトコルは、転写因子の強制発現を通じて、ヒト多能性幹細胞からの血行性内皮および多能性造血前駆細胞の効率的な誘導について説明しています。...

ヒト多能性幹細胞における転写因子の過剰発現によって、造血内皮と血液の直接誘導

この原稿は、抜毛された髪の毛からのヒトケラチノサイトの誘導と維持、およびその後のエピソームベクターによる統合フリーのヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）の生成のための段階的な手順を提供します。...

髪の由来ケラチノサイトを使用した統合フリーヒト誘導多能性幹細胞の生成

このプロトコルは、リプログラミング因子を含むマトリゲルとセンダイウイルスベクターの組み合わせを使用して、フィーダーフリーの状態でヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞(iPSC)を生成する方法を説明しています。...

フィーダーフリー条件にセンダイウイルスを用いてヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞の生成

末梢血単核細胞(PBMC)を人工多能性幹細胞(iPSC)に再プログラミングするためのプロトコルを提案します。形質導入した血液細胞をマトリックスコーティングプレートに遠心分離で播種することにより、浮遊細胞からiPS細胞を成功裏に誘導します。この技術は、PBMCやCBMCなどの細胞に対するシンプルで効果的なリプログラミングプロトコルを示唆しています。...

センダイウイルスや遠心分離を用いて血液細胞から誘導多能性幹細胞の生成

ヒトに誘導された多能性幹（hiPS）細胞の強力な誘導は、真皮線維芽細胞の非組込みセンダイウイルス（SeV）ベクター媒介性再プログラミングを使用することによって達成された。 hiPS細胞の維持およびクローン増殖は、組換えヒトラミニン521（LN-521）マトリックスおよびEssential E8（E8）培地を用いた異種非含有および化学的に規定された培養条件を用いて行った。...

ラミニン521マトリックスを用いたヒト誘導多能性幹細胞の統合された誘導

学ぶ エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリーiPSC生成法。非統合型ベクターで安全かつ効率的に多能性幹細胞を作製し、疾患モデリングや創薬研究に応用する技術を習得できます。

エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成

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