Name: マウス全層皮膚移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 学ぶマウス全層皮膚移植の手順と移植片拒絶のモニタリング方法。BALB/cからC57BL/6への移植モデルを用いて、同種免疫応答とドナー特異的寛容性を評価する再現性の高い手法です。

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この作品は、NIHの助成金R01AI077610によって賄われていました。

すべての手順は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針（NIH）に従って行ったし、ジョンズ・ホプキンス大学動物実験委員会（JHUACUC）によって承認されました。具体的な手順は、承認されたACUCプロトコルMO13M292とMO13M370下で行いました。 1.ドナー皮膚の収穫<ol><li>イソフルラン（ - マウスコーンを介して、2％、4％で誘導気化器、1でのメンテナンス）でドナーマウスを麻酔。麻酔深度を監視するために、つま先のピンチ引っ込め反射を使用してください。 </li><li>電気かみそりを使用して、動物の背中を剃る、10％ポビドンヨード（ 例えば 、ベタジン）でそれを消毒します。 </li><li>疎性結合組織のレベルで鈍的切開して、滅菌はさみ、手袋、無菌技術、収穫ドナー首の後ろに腰から皮膚を使用しました。 </li><li>収穫後に頸椎脱臼により動物を安楽死させます皮膚移植。 </li><li>顕微鏡下で、微細な腱切除はさみを使用して、背中の皮膚からの結合組織、脂肪組織、および皮筋層を分離します。皮筋層は、皮膚のけいれんの動きに責任薄い透明筋肉です。 </li><li>無菌の楽器の技術を用いて、15ミリメートル×15 mmの移植床に10ミリメートル×10ミリメートルのための背中の皮膚から15ミリメートル×15 mmの移植片を切り出します。 </li><li>氷上のペトリ皿中の滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に浸したガーゼに移植片を保管してください。 注：8 - 10の移植片は、1つのドナーマウスから得ることができます。 </li></ol> 2.受信者の皮膚移植<ol><li>イソフルラン（ - マウスコーンを介して、2％、4％で誘導気化器、1でメンテナンス）とレシピエントマウスを麻酔。麻酔深度を監視するために、つま先のピンチ引っ込め反射を使用してください。 </li><li>術後の疼痛緩和のためのブプレノルフィンの0.02ミリグラム/ kg体重を管理します。 </li><li>グラフトのWi動物の背中側を剃ります挿入され、10％ポビドンヨードで消毒することでしょう。 </li><li>はさみを使用して、皮膚の15ミリメートル×15ミリメートル四方に10ミリメートル×10ミリメートルを切りました。欠陥サイズは、グラフトより（10％）、わずかに大きくする必要があります。表面的に可能な限りカットします。皮筋層および血管を維持するために注意してください。皮筋層は、その移動性によって、根底にある筋膜およびそれに表面的な実行の血管と区別することができます。 </li><li>エッジに沿って折り目を避け、移植床に移植片を配置します。 </li><li>四隅と各辺の中央に8縫合糸を配置します。各縫合糸のために、移植片を通過し、その後、周囲のレシピエントの皮膚下の移植床の皮筋層を介して針を渡します。 </li><li>麻酔マスクを外し、動物が粘着包帯を適用する前に麻酔から部分的に回復してみましょう。 </li><li>グラフト折り重ねガーゼ絆創膏でレシピエントマウスをラップします。切断、2包帯を組み合わせることにより、包帯を作ります接着剤の1の部分と一緒に2吸収パッドを配置します。 </li><li>包帯は、胸部の遠足と呼吸を制限しないことを確実にするためにリカバリ時に密接にマウスを監視します。呼吸数が減少または動物が浅く息をのむか、息を開始した場合に包帯を外します。 </li></ol> 3.術後ケア<ol><li>感染予防のための手術後のエンロフロキサシン5ミリグラム/キログラムを管理します。 </li><li>それは完全に麻酔から回復するまで電子レンジで加熱パッドの上にきれいなケージに移植したマウスを置きます。 </li><li>術後の前の住宅施設に戻すに1時間、マウスを観察します。 </li><li>七日手術後、ステップ2.1のように、マウスを麻酔。包帯の腹側を介してのみ切断することにより包帯を外します。 </li><li>観察し、痂皮形成、収縮、または硬さの兆候が次の日に移植片を触診します。存在する場合、移植片は、適切vascularizaを達成していない可能性がありますションとは、技術的な失敗とみなされるべきです。 </li><li>拒絶反応の徴候について毎日監視します。移植片組織の≥90％が壊死性になったときに拒否された移植片を考えてみましょう。 </li><li>拒否された動物を安楽死させると分析のためにそれらを収穫。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

メダウォアによるその導入されて以来、最初のヒトの研究で、その後、ウサギおよびマウスで、皮膚移植、同種免疫応答6,7の研究のための貴重なモデルとなっています。この原稿では、上下の背中の皮膚を用いた大規模な、非血管新生化、全層皮膚移植のモデルを提示します。移植組織の供給源として、マウスの尾の皮膚又は耳の皮膚を使用することを含む様々な代替方法は、8,9までに報告されています。これらのモデルは、技術的なシンプルさの明確な利点を提示し、大容量のスループットを可能にします。表皮ランゲルハンス細胞と尾皮膚移植片における真皮樹状細胞の相対的な欠乏は、しかし、特にマイナーMHCの不一致モデル10,11に、ホストによってグラフト受け入れを促進するために遅れて拒絶につながるだけでなく、。このため、全層トランク皮膚移植は、T細胞メディアを研究するためのより強固なモデルと、より適していると考えられますテッドは拒絶12急性 。 加えて、我々のモデルは、単純な技術を使用し、高度な顕微スキルを必要としません。運転時間（麻酔の発...

臓器移植は、末期の臓器不全を有する患者のための選択の治療法である、と結果は外科的手順および免疫抑制プロトコルの進歩と飛躍的に向上しています。しかし、長期的な免疫抑制は、重大な副作用に関連付けられている、と寛容を促進する新たな戦略の開発は、現代の移植研究の目標のままです。 多数の動物モデルが、移植片拒絶反応を予防するため、長期的な耐性1-3を促進するための接近同種移植片拒絶反応のメカニズムを研究するために、および免疫抑制を試験するために、移植における基礎研究のために開発されています。マウスモデルは、原因、診断と治療用抗体の排他的で広大な可用性と明確に定義された近交系およびトランスジェニック株と免疫学研究の主力となっています。皮膚移植は特別な顕微スキルや缶を必要としない簡単な手順であります簡単に術後監視されます。まとめると、マウスの皮膚移植は、移植片拒絶4,5中の抗原送達、細胞輸送、および組織破壊を含む同種免疫応答に関与する多くの側面を研究するための例外的なツールとなっています。 ここでは、マウスモデルを用いた全層皮膚移植のためのステップバイステップの手順を示し、我々は移植皮膚の生着の成功のために必要な重要な手順を説明します。

<table><tbody><tr><td>ストレートマイクロ鉗子</td><td>シグマ</td><td>F4017</td><td></td></tr><tr><td>湾曲マイクロ鉗子</td><td>Aesculap</td><td>BD333R</td><td></td></tr><tr><td>湾曲したスティーブンス 腱切開ハサミ</td><td>Aesculap</td><td>BC905R</td><td></td></tr><tr><td>メイヨー解剖ハサミ</td><td>Sigma</td><td>S3146</td><td></td></tr><tr><td>マイクロニードルホルダー</td><td>Aesculap</td><td>BM563R</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ガーゼ</td><td>Covidien</td><td></td><td></td>441218</tr><tr><td>6-0ナイロン縫合糸</td><td>MWI</td><td>31849</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックストリップバンド&#45;エイド・</td><td>ジョンソン&ジョンソン</td><td></td><td>薬局から取得</td></tr><tr><td>10 cm シャーレ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>品質 生物学的</td><td>119069131</td><td></td></tr><tr><td>ブプレノルフィン</td><td></td><td></td><td>DEA 番号が必要です。病院薬局</td></tr><tr><td>エンロフロキサシン</td><td>バイエルヘルスケア</td><td>186599</td><td></td></tr>から取得</tbody></table>

マウス全層皮膚移植

Murine Full-thickness Skin Transplantation

マウスの全層皮膚移植は、同種免疫反応および移植片拒絶を研究するためのインビボモデルで十分に確立されています。ヒトへのその限られた用途にもかかわらず、マウスでは皮膚移植が広く移植研究のために採用されています。手順は、学び、実行することが容易であり、それは繊細な顕微技術も広範囲の訓練を必要としません。また、このモデルにおける移植片拒絶は、非常に再現性の免疫反応で発生しやすい直接検査や触診によって監視されます。また、ドナーをマッチさせた、またはサードパーティの皮膚移植片を有する二次皮膚移植はドナー特異的寛容を評価するための代替と合併症のない方法として、より複雑な移植モデル上で実行することができます。合併症は低く、一般的に手順の後、麻酔の過剰摂取や呼吸困難に限定されています。移植の失敗は、他の一方で、GRの準備不足の結果として、一般的に発生します移植床における後方、不正確な位置決め、または包帯の不適切な配置。この記事では、我々は、マウスの全層皮膚移植のためのプロトコルを提示し、成功した手順のために必要な重要な手順を説明します。

レシピエントマウスに包帯の配置は、手順の重要なステップです。皮膚移植は、肩、腰、及び背骨（ 図1）との間で、受信者の胴体上に配置されます。包帯は、折り畳まれたガーゼと2プラスチック絆創膏の組み合わせで作られています。レシピエントマウスは、包帯の中心にガーゼの上にダウン移植片で配置されています。 2つの湾曲マイクロ鉗子を用いて、包帯の下側端部が最初に引っ張られ、その後包帯の上面は腹部に、マウスの上にラップされます。 完全なミスマッチのモデルでは、全層皮膚移植片は、通常8〜12日で拒否されます。マイナーミスマッチモデルにおいて、拒絶反応は、多くの変数、遅い、および皮膚移植の出現は、収縮または毛髪の喪失（ 図2）として以下の異なる変化によって特徴付けられます。急性移植片拒絶の属LLY移植片の腫脹および紅斑から始まります。これらのイベントは、グラフト乾燥、収縮、およびかさぶたの形成（ <str...

マウス全層皮膚移植は同種免疫設定で拒絶反応を研究するために、十分に確立されたモデルです。 &gt; C57BL / 6全層皮膚移植 - ここでは、BALB / cと実行に関与し、各ステップのチュートリアルを提供しています。

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established in vivo model to study alloimmune response and graft rejection. Despite its limited ...

このビデオ論文の目的は、全層皮膚移植を実施し、手術を成功させるために必要な重要な手順を説明することです。マウスの全層皮膚移植は、同種免疫応答およびグラフト拒絶反応を研究するための確立されたモデルです。この手順は実施が容易であり、繊細な顕微鏡下手術の手技は必要ありません。本モデルにおける移植拒絶は、非常に再現性の高い免疫反応として起こり、直接的な観察や触診によって容易にモニタリングすることができます。さらに、ドナー一致またはサードパーティの皮膚片を用いた二次的な皮膚移植を行うことで、より複雑な移植モデルを構築することができ、ドナー特異的寛容を評価するための代替的かつ簡便な手法として利用可能です。プロトコルに従ってドナーマウスを麻酔した後、電気シェーバーを使用して動物の背中を剃毛します。次に、10%ポビドンヨードを用いて皮膚を消毒します。鋏と鈍的な剥離法を用いて、股関節から頚部まで、疎性結合組織のレベルでドナーの背部皮膚を採取します。背部皮膚を顕微鏡下に置き、微細な腱切断鋏を使用して、結合組織と皮下筋膜を皮膚から分離させます。背中の皮膚から15 by 15 millimeterの移植片を切り出し、10 by 10から15 by 15 millimeterの移植床を作製します。移植片はPBSを含浸させたガーゼの上に載せてペトリ皿に入れ、氷上に保持します。レシピエントマウスを本文のプロトコルに従って麻酔します。移植片を挿入する動物の背面の側方を剃毛し、術後の疼痛緩和のためにブプレノルフィンを0.02 mg/kg投与します。10%ポビドンヨードを用いて患部を消毒します。はさみを使い、可能な限り浅い層で、10 by 10から15 by 15 mmの正方形に皮膚を切除します。肉様層（panniculus carnosus）およびその表層を走る血管を損傷しないよう注意します。次に、辺縁に折り込みが生じないように注意しながら、移植片を移植床に配置します。その後、移植片の四隅と各辺の中間に、計8か所の縫合を行います。針を移植片に通し、次に移植床の肉様層を、周囲のレシピエント皮膚の下で貫通するように縫い合わせます。折りたたんだガーゼを二重にした包帯の上に置き、動物を移植部位が下になるように包帯の上に配置します。その後、麻酔マスクを外して動物を部分的に覚醒させます。次に、包帯で動物を巻きます。生着プロセスにおいて最も重要な要因は、ホストの血管が移植片内に進入することによる移植組織の再血管化です。panniculus carnosus（皮下筋層）の剥離と包帯の正しい固定が最も重要なステップです。手術直後に、感染予防のためエンロフロキサシンを5 mg/kg投与してください。移植後のマウスは、麻酔から完全に回復するまで清潔なケージに入れて管理してください。マウスを飼育施設に戻す前に、術後1時間観察します。回復中のマウスを注意深く観察し、包帯が胸郭の拡張や呼吸を妨げていないことを確認してください。8日後、移植片を観察および触診し、かさぶた、収縮、または硬結の兆候がないかを確認します。これらの兆候のいずれかが認められる場合、移植片が適切に血管新生していない可能性があり、技術的失敗とみなすべきです。拒絶反応の兆候がないか、移植片を毎日観察してください。移植片組織の90%以上が壊死した場合、その移植片は拒絶されたと判断します。完全不適合モデルでは、全層皮膚移植片は通常8〜12日で拒絶されます。軽度不適合モデルでは、拒絶反応はより緩やかで変動が大きく、皮膚移植片の外観は、収縮や脱毛などのあまり明確ではない変化によって特徴づけられます。急性移植拒絶は、一般的に移植片の腫脹と紅斑から始まります。これらの現象に続いて、ここで見られるように、移植片の乾燥、かさぶたの形成、および収縮が起こります。MHC不一致の程度や免疫抑制プロトコルに応じて、脱毛、色素沈着の消失、皮膚線（皮丘）の消失、移植片の体積減少などのわずかな変化を特徴とする亜急性プロセスによる拒絶反応が生じることがあります。これらの場合、拒絶された移植片は光沢のある白色で無毛となり、辺縁が不整になります。ドナーにBALB/c、レシピエントにC57 black 6を用いて、糖新生および酸化リン酸化、あるいはグルタミン代謝のみを抑制することで、皮膚移植片の生存期間が延長することが観察されました。しかし、これら3つの経路を同時に遮断したところ、移植片の生存期間が有意に増加しました。さらに、この3重の代謝療法は、従来のシクロスポリンやラパマイシンよりも効果的でした。さらに、代謝療法群の皮膚移植片の組織学的な所見では、未治療の組織と比較して、組織配列の保持がより良好であり、リンパ球性炎症浸潤が少ないことが示されました。臓器移植の成績は、手術手技や免疫抑制プロトコルの進歩により著しく向上しています。しかし、長期的な免疫抑制は深刻な副作用を伴うため、免疫寛容を促進する新たな戦略が現代の移植研究の目標となっています。T細胞の調節における代謝の重要性はよく知られています。糖新生、酸化的にリン酸化、およびグルタミン代謝を抑制することで、同種移植片の生存期間を大幅に延長することができました。この新しいアプローチは従来の治療法よりも効果的であり、免疫調節および移植への潜在的なアプローチにおけるパラダイムシフトとなるものです。

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