反応性アストロ サイトと増殖の in Vitro虚血のような条件下での監視

次のプロトコルは、酸素グルコース欠乏またはOGDを実行するために、子ラットの脳から初代星状細胞の分離を示すことを目的としています。精製されたアストロサイトの酸素グルコース欠乏環境への曝露は、虚血性脳卒中に見られるいくつかの条件に対する反応をテストすることを可能にするモジュールです。酸素グルコース欠乏への曝露後の系統的な変化は、GFAPなどの選択的アストロサイトマーカーを使用して観察および測定できます。

要約すると、虚血様条件に曝露されたこれらの単離された細胞は、低酸素状態で活性化される新しい部分方法や虚血性脳卒中から保護する他の薬物をテストするために使用できます。プロトコルのこの部分では、星状細胞は子ラット皮質から分離されます。この手順の目的は、酸素グルコース欠乏実験を実施するための初代アストロサイト細胞培養物を取得することです。

この手順の材料は次のとおりです、この手順で使用する前にすべての材料をオートクレーブします。また、プロトコールを開始する前に、フードを少なくとも20分間UVライトにさらしてください。この手順を開始するには、各プレートに3〜5ミリリットルの完全なDME培地をピペットで移します。

マウスの脳ごとに1つ、すべての皮質に2つ、髄膜のないすべての皮質に3つ、次のように分けられます。70%エタノールで消毒した後、子犬の首を切ります。後頭部から鼻に向かって切開します。

湾曲した鉗子で頭蓋骨を切除し、皮質を露出させる小脳をそっとこすり落とします。露出した脳をピンセットで取り除き、メディアを入れた最初のシャーレに脳を置きます。他のすべての子犬について、これらの手順を繰り返します。

微小解剖鉗子の鋭い端で正中線の亀裂に沿って穏やかに分割して、大脳半球を分離します。ピンセットを使って白質と海馬をつまむようにして皮質を取り除き、皮質を残します。皮皮質を2番とラベル付けされたペトリ皿に移します。

ペトリ皿内のすべての解剖された皮質を組み合わせて、すべての脳に対して手順を繰り返します。皿を静かに振って、メディアをすべての皮質に均等に分散させます。解剖顕微鏡を使用して、剥離した皮質の内側を覆う髄膜を特定します。

髄膜は非常に薄い透明な層であり、組織を囲む小さな赤い毛細血管を探すことで識別できます。皮質の内側を覆っている髄膜を注意深く検査して取り除き、各皮質の両側にある細いピンセットを使用して、個々の皮質葉からそっと剥がします。きれいな皮質を3番とラベル付けされた新しいシャーレに入れます。

胃法またはブレンダー法を使用した組織解離の場合は、きれいで皮をむいた皮質とペトリ皿の培地を滅菌ブレンダーバッグに注ぎます。そして、バッグの総容量を5ミリリットルにするのに十分なメディアを追加します。袋をストマッカー80に入れ、袋の約2センチメートルを閉じたドアの上に見えるようにする。

この装置での細胞解離は、2.5分後に高速で行われます。あるいは、滅菌バッグを閉じ、組織粒子が微細な懸濁液になるまでフード内のビーカーで組織を穏やかに叩くことによって、組織解離を行うことができる。摩擦やバッグの破損を防ぐために、バッグとビーカーの間に布を使用してください。

メッシュ番号60でセル懸濁液をスリーブの中央に注ぎます。ろ過したセルをメッシュ番号100の中央に注ぎ、重力でフィルタリングできるようにします。ろ過した細胞懸濁液を円錐形の15ミリリットルチューブに注ぎます。

センターフュージは、セル懸濁液を200倍Gでセンターフュージに入れ、好ましくはスイングバケットルーターを用いて5分間行う。上澄みを取り除き、ビーカーに捨てます。完全な新しいメディアをセルパレットに追加します。

血清ピペットを使用して、細胞のパレットを最大5ミリリットルの培地に再懸濁し、解離します。フラスコに所望の量の細胞懸濁液を加え、培地を完成させます。再懸濁したパレットをミディアムでフラスコに加えます。

細胞をフラスコ全体に均等に分布させ、5%の二酸化炭素を含む摂氏37度のインキュベーターに入れます。メディアは3日ごとに交換することを忘れないでください。次の方法論は、制御された環境で細胞から酸素とグルコースを奪うことを目的としています。

このモデルの目的は、虚血様脳卒中状態におけるアストロサイトの応答を研究することです。この手順に使用される材料は、ガスシステムに接続された血清ピペットを挿入して、グルコースフリー培地をパージすることです。ガス混合物で溶液を10分間、毎分10〜15リットルの流れで泡

10分が経過したら、OGD培地のpHを7.4に調整します。パージしたグルコースフリー培地を50ミリリットルチューブフィルターシステムを使用してろ過します。すべての実験で常に新鮮なOGD培地を作成することが重要です。

これにより、培地から酸素が確実に除去されます。アストロサイト培地を取り出し、細胞PBSで2回洗浄して細胞からグルコースを取り除きます。OGD培地をウェルに加えます。

蓋を開けた状態でマルチウェルディッシュを低酸素チャンバー内に置きます。混合ガスを入口バルブに接続し、出口バルブを開いたままにします。ガス混合物でチャンバーを毎分10〜15リットル、5〜7分間洗い流します。

ガスの流れを止め、最初に出口バルブのクランプを閉じます。次に、clを閉じますamp ガス入口バルブチューブのチューブ。低酸素チャンバーを37°Cの細胞培養インキュベーターにOGDで所望の時間置きます。

インキュベーション時間が終了したら、OGD培地を吸引し、正常酸素状態のために細胞に完全なDMEMを慎重に追加します。細胞を培養インキュベーターに戻し、ゼロ24時間および48時間の正常酸素状態にします。このプロトコルは、新生児ラット皮質からの星状細胞の分離について説明しています。

初代培養物の純度を検証した後、OGD実験を行いました。この虚血様モデルでは、グルコースと酸素の欠乏は、GFAPなどのアストロサイトマーカーやPCNAなどの増殖マーカーを使用して免疫蛍光法によってモニターされた、よりフォロジカルな変化を誘発しました。このモデルの利点の1つは、特定の細胞タイプの応答を研究できることです。

この技術の制限は、アストロサイトの分離による細胞間相互作用の欠如です。この制限を克服する可能な方法の1つは、アストロサイトを他の細胞タイプのコンディショニング培地または共培養液にさらすことです。要約すると、単離された細胞系における酸素グルコース欠乏法により、さまざまな神経保護分子または神経毒性分子の影響を直接テストできます。

また、アストロサイトの生物学を研究するための有効なツールです。最後に、このモデルは、in vivoモデルを使用して実験条件で発生薬を研究するための強力な基盤を設定します。