Name: 反応性アストロ サイトと増殖の in Vitro虚血のような条件下での監視 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 8 s
Description: 学ぶ 虚血性脳卒中を模した酸素グルコース欠乏条件下で、新生ラット脳由来の一次アストロサイトを単離し、GFAPマーカーを用いて反応性と増殖の変化を観察する方法。この技術は神経保護薬の開発に貢献します。

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著者のテクニカル サポート パオラ ・ ロペス Pieraldi を感謝したいです。A.H.M. は助成金 8G12MD007600 と U54 NS083924 このパブリケーションをサポートに感謝しています。NIH NIMHD-G12 MD007583 助成施設支援に感謝いたします。D.E.R.A. は、NIHNIGMS R25GM110513 によって提供される交わりに感謝しています。共通の計測領域の使用のため感謝しております、博士プリシラ サナブリアの RCMI プログラムでの光イメージング施設の使用のための援助を与える G12MD007583。さらに、私たちは撮影・編集視覚的プロトコルの彼の顕著な役割のホセパディーヤを感謝したいと思います。

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このプロトコルでは、ラット皮質アストロ サイトの分離について説明します。このメソッドは、線維芽細胞、オリゴデンドロ サイト、ミクログリアなど他の細胞の種類と汚染を減らすために重要です。ミクログリアの数を減らすためには、いくつかの手順を取ることができる: メディア、揺れ、軌道と化学治療を変更します。選択的細胞マーカーを用いた蛍光抗体法によって、最も顕著な細胞汚染物質文化の純度を確認すると、実験を実行できます。例えば、イオン化カルシウム結合アダプター分子 1 (Iba-1) に対する抗体は、ミクログリアを検出する使用できます。神経細胞死は文化初期段階から始まりますとこれらの細胞がフラスコめねじオリゴデンドロ サイト前駆細胞 (Opc) と共に除去してメディア変更 3 日目31。Oligodendrocytic の前駆細胞は、olig2 など NG2 抗体を使用して識別できます。GalC は未熟か成熟オリゴデンドロ サイトを識別するために使用することができますが、この文化段階でこれらで発見される可能性はありません。または、非 GFAP 陽性細胞を定量化することができ、汚染物質を推定できます。この...

ストロークは、「、急性神経障害血管由来の症状と脳の焦点区域の関与に対応する徴候の突然または急速な開発と」1,2として定義されます。ストロークの 2 つの種類があります: 出血性および虚血性。動脈瘤や、動脈の破裂の後弱体化を伴う動静脈の故障により血管機能不全が引き起こされるときほとんどの場合、死につながる3出血性脳卒中と呼びます。血栓または塞栓は、血流を妨げ、脳の領域に酸素とグルコースの一時剥奪の原因と呼びます虚血性脳卒中4。影響を受ける地域や恒常性、代謝の不均衡、エネルギッシュな不全、神経細胞死および炎症5患者6生涯障害を誘発することができますに虚血性の芯線の周りの細胞に栄養を与えるに失敗しました。
虚血性脳卒中は多因子性傷害を含むいくつかの種類の細胞が反応し、異なる時点でその効果を発揮します。多くの相互作用は、個々 の細胞の挙動を調べるための困難な環境を作成します。だから、どのようにこのような複雑な環境下で特定のセルタイプの寄与を調べたか?虚血の認められた体外モデルは、平地の環境に、細胞の修復に続く一定の期間酸素とグルコースの剥奪 (OGD) へ細胞を公開するための構成されます。このシステムは、脳虚血再潅流をシミュレートします。この方法では細胞や組織が削除されるは特殊な低酸素室を用いた酸素環境のブドウ糖自由な媒体に公開されます。最大 24 h で、テストしたい仮説によって数分から OGD インキュベーション時間は異なります。研究が示している OGD 回数に応じて、平地環境、ストローク (すなわち、急性または亜慢性) の特定の表現型が実現できます。平地の条件に後部修復 OGD にさらされる主の孤立したアストロ サイトは、ストローク体外7を模倣するよく研究細胞モデルです。OGD を使用してストロークのような環境下での隔離されたセルの独立した分子メカニズムを明らかにすることができます。
アストロ生物学の知識が増えると、彼らがシナプスを維持し、神経の修復、開発、および可塑性8を維持するために重要なことは明白になりました。通常の条件下でアストロ サイトは解放し、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、gliotransmitters、新陳代謝のバランスとシナプス5,9内の恒常性を維持に対応します。虚血性脳卒中などの急性 neuroinflammation でこれらの細胞が反応になって、長期的な過剰発現のグリア線維性酸性タンパク質 (GFAP) を示し肥大の形態5,10,11,12. 虚血性梗塞が発展すると、アストロ サイトによって提供される恒常性、通常グルタミン酸取り込み、エネルギー代謝、活性と抗酸化活性13の交換に関する影響になります。
再アクティブ化されたアストロ サイトは、白血球の破壊領域14に向けて移行中周囲の梗塞組織増殖します。アストロ サイトの増殖は、増殖細胞核抗原 (PCNA)、キ67、ブロモデオキシウリジン (BrdU)15などのマーカーを使用して測定できます。この増殖応答が時間依存的に生成されます、それグリア瘢痕、外傷9後破損したサイトの実質に沿って不可逆的反応性アストロ サイトの配列を形成できます。この傷跡の初期の機能の 1 つはこの区域から免疫細胞漏出を制限します。しかし、研究では、傷跡が拡張、軸索の成長を阻害する分子をリリースおよび軸索が16患部の周りを拡張することを防ぐ物理的な障壁を作成する軸索の物理的な障害になることを示しています。それにもかかわらず、脊髄損傷後完全にグリア瘢痕の形成を防止するが17軸索の再生を損なうことができるを示す科学的な証拠があります。したがって、傷害の検討の枠組みに、測定する特定のアストロ サイトの応答コンテキストを考慮されなければなりません。
酸素無グルコース後アストロ サイトの個別の機能の研究に提示された方法論を適用できるし、調査官が答えたい質問に応じて変更することができます。たとえば、形態変化、OGD 時期を表明したマーカーのほか OGD にさらされているアストロ サイトから清さらに分析できる可溶性因子これらの細胞によって解放または評価するために調節されたメディアとして使用を識別するために、他の脳細胞に影響します。このアプローチにより、支配すると虚血性脳卒中のシナリオでその応答を調節する因子の解明につながる可能性がアストロ サイトの反応性に関する研究です。

<table><tbody><tr><td>手術用器具 - ステップ1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手術用ハサミ5.5インチ</td><td>Roboz Company</td><td>RS-6812</td><td>ネズミの首を切るために使用されるツール。</td></tr><tr><td>湾曲した鉗子7インチ&nbsp;</td><td>Roboz Company</td><td>RS-5271</td><td>頭蓋骨を取り外した状態でラットの皮膚を保持します。</td></tr><tr><td>マイクロ解剖ハサミ4インチ&nbsp;</td><td>Roboz Company</td><td>RS-5882</td><td>ラットの皮膚と頭蓋骨の両方を切断します。</td></tr><tr><td>マイクロ解剖鉗子4 "角度付き、細かいシャープ&nbsp;</td><td>ロボズ社</td><td>RS-5095</td><td>頭蓋骨を取り外した状態でラットの皮膚を保持します。</td></tr><tr><td>マイクロ解剖鉗子 4インチ わずかに湾曲した 0.8</td><td>Roboz Company</td><td>RS-5135</td><td>皮質を分離するために使用されるツール。</td></tr><tr><td>マイクロ解剖ピンセット</td><td>Roboz Company</td><td>RS-4972</td><td>脳の髄膜を剥がします。</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>SZX16</td><td>皮質から髄膜を除去するために重要です。</td></tr><tr><td>DMEMの準備 - ステップ2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ'のモディファイドイーグル」s Medium (DMEM)</td><td>GibCo.会社</td><td>11995-065</td><td>細胞の成長をサポートします。</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>S7277</td><td>細胞培養培地用サプリメント。</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>GibCo.会社</td><td>10437-010</td><td>細胞培養用の血清サプリメント。</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン&nbsp;</td><td>ギブコ。会社</td><td>15140-148</td><td>細胞培養中の細菌の増殖を阻害します。</td></tr><tr><td>0.22umの細孔を持つフィルターシステム 1L</td><td>コーニング</td><td>431098</td><td></td></tr><tr><td>アストロサイト培養 - ステップ 3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serological ピペット 5mL</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td>DMEMを細胞の入った容器にピペットで移します。</td></tr><tr><td>血清ピペット 10mL</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td>DMEMを細胞の入った容器にピペットで</td></tr>移します。<tr><td>血清ピペット 25mL</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td>DMEMを細胞の入った容器にピペットで</td></tr>移します。<tr><td>遠心分離機の円錐管15mL</td><td>サンタクルスバイオテクノロジーsc-200250</td><td></td><td></td></tr><tr><td>セーフロックチューブ1.5mL</td><td>エッペンドルフ</td><td>022363204</td><td></td></tr><tr><td>バリアチップ200 uL</td><td>サンタクルス</td><td>バイオテクノロジーsc-201725</td><td></td></tr><tr><td>バリアチップ1mL</td><td>サンタクルーズ</td><td>バイオテクノロジーsc-201727</td><td></td></tr><tr><td>バイオハザードオレンジバッグ 14 x 19インチ</td><td>VWR</td><td>14220-048</td><td></td></tr><tr><td>60mmのペトリ皿</td><td>の鷹の</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>の生殖不能のガーゼのパッド</td><td>Honeywell社の安全</td><td>89133-086</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 Biomaster</td><td>のSewarの実験室システム</td><td>030010019</td><td>脳のティッシュを三面的に。</td></tr><tr><td>ストマッカー80ブレンダー滅菌バッグ</td><td>セワールラボシステム</td><td>BA6040</td><td>ストマッカーセルホモジナイザー用滅菌バッグ。</td></tr><tr><td>ビーカー 400mL</td><td>パイレックス</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>滅菌細胞解離ふるい、メッシュ #60&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>S1020</td><td>均一な単一細胞懸濁液を得るため。</td></tr><tr><td>滅菌細胞解離ふるい、メッシュ#100</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>S3895</td><td>均一な単一細胞懸濁液を得るため。</td></tr><tr><td>反転相顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>エクリプス Ti-S</td><td>細胞の汚染や異常な細胞増殖を確認します。</td></tr><tr><td>75cm2 滅菌フラスコ</td><td>ファルコン</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>マルチウェルプレート</td><td>ファルコン</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>マイクロカバーグラス(カバースリップ)、18mm、丸型</td><td>VWR</td><td>48380-046</td><td></td></tr><tr><td>ブライトライン血球計算計</td><td>シグマ・アルドリッチ社</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ社</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>L-ロイシンメチルエステル塩酸塩 98% (LME)</td><td>シグマ・アルドリッチ社</td><td>L1002</td><td>初代皮質アストロサイト培養におけるミクログリア細胞の排除を促進します。</td></tr><tr><td>シトシン &β;-D-アラビノフラノシド (Ara-C)</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>GibCo.会社</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>トリパン ブルー</td><td>シグマ-アルドリッチ カンパニー</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 錠剤</td><td>カルバイオケム</td><td>524650</td><td></td></tr><tr><td>滅菌水</td><td>シグマ-アルドリッチ カンパニー</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;OGD培地調製 - ステップ5</強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機コニカルチューブ50mL</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ'修正されたイーグル」中性血糖</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>D5030</td><td>細胞の成長をサポートします。</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>S7277</td><td>細胞培養培地用サプリメント。</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン&nbsp;</td><td>ギブコ。会社</td><td>15140-148</td><td>細胞培養中の細菌の増殖を阻害します。</td></tr><tr><td>200mM&nbsp;L-グルタミン&nbsp;</td><td>ギブコ。会社</td><td>25030-081</td><td>細胞の成長を補うアミノ酸。</td></tr><tr><td>ホスパヘット緩衝生理食塩水(PBS)錠剤</td><td>Calbiochem</td><td>524650</td><td></td></tr><tr><td>フィルターシステム 50mL 0.22um 細孔付き</td><td>Corning</td><td>430320</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機コニカルチューブ 50 mL</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>シングルフローメーター&nbsp;</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>SMF3001</td><td>酸素パージにおけるガス流量を測定します。</td></tr><tr><td>低酸素インキュベーターチャンバー&nbsp;</td><td>StemCell</td><td>27310</td><td>細胞培養のための低酸素環境を生成します。</td></tr><tr><td>トレーサブルな溶存酸素計</td><td>VWR</td><td>21800-022</td><td></td></tr><tr><td>95% N2/5% CO2ガス混合物</td><td>リンデ</td><td></td><td>酸素の環境をパージします。</td></tr><tr><td>primary astrocyte immunofluorescence - step 6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline (PBS) tablets</td><td>Calbiochem</td><td>524650</td><td></td></tr><tr><td>Formaline Solution Neutral Buffer 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>細胞の固定に使用される溶液。</td></tr><tr><td>メタノール&nbsp;</td><td>フィ</td><td>ッシャーA4544</td><td>溶液は細胞を固定するために使用されます。</td></tr><tr><td>非イオン性界面活性剤 (Triton X-100)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>GibCo.会社</td><td>10437-010</td><td>細胞培養用の血清サプリメント。</td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Cell Signaling</td><td>24307</td><td>成熟ニューロンを検出し、アストロサイト培養の検証に役立ちます。</td></tr><tr><td>Anti-PCNA</td><td>Cell Signaling</td><td>2586</td><td>増殖する細胞を検出します。</td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム(PI)</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>P4170</td><td>アポトーシス染色。</td></tr><tr><td>Anti-Olig1</td><td>Abcam</td><td>AB68105</td><td>成熟したオリゴデンドロサイトを検出します。</td></tr><tr><td>アンチイバ1+</td><td>ワコー</td><td>016-20001</td><td>ミクログリア細胞を検出します。</td></tr><tr><td>Cy3と結合した抗GFAP&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>C9205</td><td>処理した細胞内の反応性アストロサイトを検出します。</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probe Life Technology</td><td>A1101</td><td>抗マウス二次抗体。</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555</td><td>Molecular Probe Life Technology</td><td>A21428</td><td>抗ウサギ二次抗体。</td></tr><tr><td>4',6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>D9542</td><td>核染色.</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

反応性アストロ サイトと増殖の in vitro虚血のような条件下での監視

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

虚血性脳卒中は血栓や塞栓脳の部分への血流を妨害によって引き起こされる複雑な脳損傷です。これは、酸素とブドウ糖のエネルギー不全や神経細胞死を引き起こすの剥奪に します。虚血性脳卒中の侮辱後、アストロ サイトは反応になるし、それが発展するにつれ、損傷部位の周囲増殖します。このシナリオの下では、虚血にさらされている脳の領域にアストロ サイトの特定の貢献を研究することは困難です。したがって、プライマリ アストロ サイトの反応と酸素無グルコース (OGD) と呼ばれる虚血のような環境の生体外モデルの下で増殖を検討する方法を紹介します。アストロ サイトは 1-4 日から分離された-古い新生児ラットと非特異的アストロ サイト細胞の数は、アストロ サイト選択的マーカー グリア線維性酸性蛋白質 (GFAP) と染色性が核を使用して評価されました。公開されている酸素の割合のと同様、OGD 条件に服従するアストロ サイトの期間をカスタマイズできます。この柔軟性により、細胞の試験管内のさまざまなグループの虚血のような条件の期間を特徴付けるための科学者です。この資料では、反応性アストロ サイト、肥大形態と増殖細胞核抗原 (PCNA) を用いた蛍光抗体法によって測定される増殖を誘発する OGD の時間枠について説明します。増殖、ほかアストロ サイトはエネルギーと酸化ストレスを受けるし、細胞培地に可溶性因子を放出し OGD に対応します。このメディアを収集し、分子細胞間相互作用のない初代神経細胞培養アストロ サイトによるリリースの影響を分析するために使用することができます。要約すると、傷害に孤立したアストロ サイトの役割を理解するこの一次電池文化モデルを効率的に使用できます。

培養アストロ サイトの主な懸念の 1 つは、ニューロン、オリゴデンドロ サイト、線維芽細胞、ミクログリアなど他の細胞の存在です。図 1、ラット皮質から隔離されたセルごとに 3 日間メディアの変更があったし、か未処理または処理追加 LME 1, 24 時間後の細胞 GFAP の immunostained, DAPI で counterstained。未処理の細胞は、LME 処理細胞を示した 8% 陽性細胞 39% 非 GFAP の平均を示した。これらの結果は、どのように LME 治療とメディアは 4.75 倍、濃縮アストロ文化生産によって効果的に減らされた非 GFAP 陽性細胞を変更を示します。1 h や 6 h の OGD がこの方法論後アストロ サイトの生存率を与える影響かどうかは、図 2は、アストロ サイト文化、侮辱後 24 h の MTT の試金を示しています。二回とも使用できるアストロ サイトの反応性を研究する表示の状態で生存率に有意差が見つか...

虚血性脳卒中、酸素無グルコース (OGD) に影響を受ける脳の領域にアストロ サイトの特定の貢献がさらされて複雑なイベントは調査しにくい。孤立したアストロ サイトを取得し、反応性、OGD 条件下での増殖を研究する手法を紹介します。

反応性アストロ サイトと増殖の in Vitro虚血のような条件下での監視

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

以下のプロトコルは、酸素・グルコース剥奪（OGD）を行うために、幼若ラットの脳から初代アストロサイトを単離する方法を示すことを目的としています。精製したアストロサイトを酸素・グルコース剥奪環境にさらすモジュールを用いることで、虚血性脳卒中で見られるいくつかの条件に対する反応を検証することが可能です。酸素・グルコース剥奪後の方法論的な変化は、GFAPなどの選択的なアストロサイトマーカーを用いて観察および測定できます。要約すると、虚血様条件に曝露させたこれらの単離細胞は、低酸素条件下で活性化される新しい経路や、虚血性脳卒中を保護するその他の薬剤の試験に使用できます。プロトコルのこのパートでは、ラット仔の皮質からアストロサイトを単離します。この手順の目的は、酸素・グルコース剥奪（OGD）実験を行うための一次アストロサイト培養細胞を得ることにあります。本手順で使用する材料は以下の通りです。これらの材料を本手順で使用する前にすべてオートクレーブで滅菌してください。また、プロトコルを開始する前に、クリーンベンチに少なくとも20分間UV照射を行ってください。本手順を開始するために、各プレートに完全DME培地を3〜5 mLピペッティングします。以下のように分割します。1つは各マウス脳用、2つはすべての皮質用、そして3つは髄膜を除いたすべての皮質用とします。70% ethanolで消毒後、幼若マウスを断頭します。後頭部から鼻に向かって切開を加えます。曲がったピンセットで頭蓋骨を取り除き、小脳をそっと掻き出して皮質を露出させます。露出した脳をピンセットで取り出し、培地を入れた1つ目のシャーレに入れます。他のすべての仔マウスについても、これらの手順を繰り返します。マイクロ解剖用ピンセットの鋭い先端を用いて、正中裂に沿って慎重に分けることで大脳半球を分離します。ピンセットでつまむようにして白質と海馬を取り除き、皮質を剥離します。剥離した皮質を、2番と表記されたペトリ皿に移します。すべての脳について同様の手順を繰り返し、解剖したすべての皮質をペトリ皿にまとめます。皿を軽く揺らし、すべての皮質に培地が均等に行き渡るようにします。解剖顕微鏡を用いて、剥離した皮質を覆っている髄膜を確認します。髄膜は非常に薄く透明な層であり、組織の周囲にある小さな赤色の毛細血管を探すことで識別できます。皮質を覆っている髄膜を慎重に確認して除去し、各皮質の両側から微細ピンセットを用いて、個々の皮質葉からゆっくりと剥がします。洗浄した皮質を、「3」とラベルを貼った新しいシャーレに入れます。ストマッカーまたはブレンダー法を用いて組織解離を行うには、洗浄し皮を剥いた皮質とペトリ皿内の培地を滅菌ブレンダーバッグに移します。そして、バッグ内の全量が5 mLになるまで十分な量の培地を加えます。バッグをStomacher 80に入れ、閉じたドアの上にバッグが約2 cm見える状態にします。本装置による細胞解離は、高速設定で2.5分間行います。あるいは、滅菌バッグを閉じ、フード内でビーカーを用いて組織を軽く叩き、組織粒子が微細な懸濁液になるまで組織解離を行うことも可能です。摩擦によるバッグの破損を防ぐため、必ずバッグとビーカーの間に布を挟んでください。細胞懸濁液をメッシュ番号60のスリーブの中央に注ぎます。ろ過した細胞をメッシュ番号100の中央に注ぎ、重力ろ過させます。ろ過した細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに注ぎます。細胞懸濁液を、できればスイングバケットローターを備えた遠心分離機を用い、200 ×gで5分間遠心分離します。上清を除去し、ビーカーに廃棄します。細胞ペレットに新鮮な完全培地を加えます。セロロジカルピペットを使用して、最大5 mLの培地で細胞ペレットを再懸濁し、分散させます。必要量の細胞懸濁液をフラスコに加え、培地を規定量まで満たします。再懸濁したペレットを培地が入ったフラスコに加えます。細胞をフラスコ全体に均等に分散させ、37 °C、5% carbon dioxide のインキュベーターに入れます。3日ごとに培地を交換することを忘れないでください。以下の手法は、制御された環境下で細胞から酸素とグルコースを枯渇させることを目的としています。このモデルの目的は、虚血性脳卒中様の条件下におけるアストロサイトの反応を研究することである。本手順で使用する材料は以下の通りである。ガスシステムに接続したセロロジカルピペットを挿入し、グルコースフリー培地をパージする。溶液にガス混合物を、1分あたり10〜15 Lの流量で10分間バブリングさせる。10分後、OGD培地のpHを7.4に調整します。パージ済みのグルコースフリー培地を50 mLチューブフィルターシステムを用いてろ過します。実験ごとに常に新鮮なOGD培地を調製することが重要です。これにより、培地から酸素が完全に除去されます。アストロサイト培地を除去し、細胞からグルコースを取り除くために細胞用PBSで2回洗浄します。その後、ウェルにOGD培地を加えます。蓋を開けた状態でマルチウェルディッシュを低酸素チャンバー内に配置します。ガス混合物を入口バルブに接続し、出口バルブは開いたままにします。ガス混合物を10〜15 L/minの流量で5〜7分間流し、チャンバー内をパージします。ガスの流量を停止させ、まず出口バルブのクランプを閉じます。次に、ガス入口バルブチューブのクランプを閉じます。低酸素チャンバーを37 °Cの細胞培養インキュベーターに入れ、目的のOGD時間まで保持します。インキュベーション時間が終了した後、OGD培地を吸引し、正常酸素条件とするために完全DMEMを細胞に慎重に加えます。細胞を培養インキュベーターに戻し、正常酸素条件下で0、24、および48時間保持します。本プロトコルでは、新生ラットの大脳皮質からのアストロサイトの単離について説明します。一次培養の純度を確認した後、OGD試験を実施した。この虚血様モデルでは、グルコースおよび酸素欠乏によってより生理的な変化が誘導され、GFAPなどのアストロサイトマーカーやPCNAなどの増殖マーカーを用いた免疫蛍光染色によりモニタリングを行った。本モデルの利点の一つは、特定の細胞型の応答を研究できることである。この手法の限界は、アストロサイトを単離するため、細胞間相互作用が欠如していることです。この限界を克服する可能な方法の一つとして、アストロサイトを他の細胞種の条件培地にさらすか、あるいは共培養を行うことが挙げられます。要約すると、単離細胞系における酸素糖欠乏法を用いることで、さまざまな神経保護分子または神経毒性分子の効果を直接的に検証することが可能になります。また、本手法はアストロサイトの生物学を研究するための有効なツールとなります。最後に、このモデルは、in vivo モデルを用いた実験条件下で開発中の薬剤を研究するための強固な基盤となります。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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