Name: シンプルの力：ウニ胚として in vivoで複雑な細胞間シグナル伝達ネットワークの相互作用を研究するための発達モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 学ぶシグナル伝達経路と遺伝子制御ネットワークのin vivo解析法。無脊椎動物胚を用いて細胞運命決定を支配する複雑な相互作用を効率的に解明し、発生生物学と進化生物学の重要な問いに答える。

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原稿を注意深く読み、編集してくださったロバート・アンジェラー博士に感謝いたします。NIH R15HD088272-01、ミシシッピ州立大学研究開発室、生物科学部がRCRにこのプロジェクトを支援しました。

1.高スループットモルホリノデザイン戦略<ol><li>目的の遺伝子（複数可）（ 例えば 、候補遺伝子アプローチ、シス調節分析、RNAseqおよび/またはプロテオミクス差動画面）を特定します。 </li><li>頻繁に更新されるウェブサイト上で利用可能なゲノム、トランスクリプトーム、および遺伝子発現データを使用してください（ 例えば SpBase http://www.echinobase.org 20とS. purpuratusゲノム検索のhttp：///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .htmlの）時空間的発現プロファイルは、問題の発生機構とオーバーラップすることを決定しました。全く発現データが利用可能でない場合には、定量PCRプライマーおよび/または遺伝子の発現パターンを評価するための現場プローブアンチセンスを発生させます。 </li><li>空間的および時間的発現パターンを決定した後、ゲノムのウェブサイトからのDNA配列を得ます。 <ol><li>翻訳ブロッキングモルホリノオリゴヌクレオチドを生成するための、配列Oを得ます5 &#39;非翻訳領域（5&#39; UTR）は、f直接上流SpBaseまたはS purpuratusゲノム検索のウェブサイト上で利用可能な発現配列タグ（EST）データベースからの開始コドンから。この情報は、目的の遺伝子のために使用できない場合は、5 &#39;RACEを行います。 </li><li>スプライスブロッキングモルホリノ、SpBaseまたはS purpuratusゲノム検索ツールで足場のblastnツールを使用して、エクソンおよびイントロンを含むゲノム配列の検索を設計します。 </li></ol></li><li>目的の25塩基対のモルホリノシーケンスを設計するために、オリゴヌクレオチドの設計ウェブサイトhttp://oligodesign.gene-tools.comを使用してください。 <ol><li>翻訳ブロッキングモルホリノについては、翻訳の標的配列の供給源として、5 &#39;から3&#39;のmRNA配列を使用します。 5 &#39;UTR配列（転写開始部位の上流の約70ヌクレオチド）プラス著しいのwi開始コドンと（開始部位の下流）コード領域の25塩基を含みます番目の括弧（ATG）。 </li><li>スプライスブロッキングモルホリノについては、イントロン - エクソンまたはエクソン - イントロン境界のシーケンスを選択して、境界領域の周りの50塩基（エキソン配列の25塩基およびイントロン配列の25塩基）が挙げられます。シーケンスが一意であることを確認するために、モルホリノ配列とゲノムをスキャンします。 </li></ol></li></ol>モルホリノオリゴヌクレオチドの2マイクロインジェクション<ol><li> 300ナノモルホリノバイアルにヌクレアーゼフリー水100μLを添加することにより、モルホリノオリゴヌクレオチドの3 mMのストック溶液を準備します。 注：ピロ炭酸ジエチルがモルホリノに損傷を与えることができるので、再懸濁のためにDEPC処理水を使用しないでください。 </li><li>フルスピードで30秒のための株式オリゴヌクレオチドを含む溶液をバイアルダウン最初の再構成のスピンのための（14,000 - 16,000 XG）、簡単に渦、5〜10分間65℃で熱、簡単に渦を、ルームでモルホリノ株式を保ちます少なくとも1時間、温度。モルホリノ原液<html> sが4℃に-20°Cから格納されます。 </li><li>所望の濃度でモルホリノオリゴヌクレオチドを含む注射液を準備します。このソリューションは、通常20％グリセロールまたはキャリアとして125 mMのKCl及び15％（フルオレセインイソチオシアネートデキストラン万MWの2.5mg /μLのストック溶液）FITC-デキストランが含まれています。 FITCデキストランおよび他の蛍光デキストラン複合体は、日常的にエピ蛍光顕微鏡により注入された胚を識別するために使用されます。 -20℃で保存の注射溶液。 </li><li> 5分 - 少なくとも2つのヒートブロックまたはウォーターバス中で65℃でモルホリノ溶液を加熱します。 </li><li> （ - 16,000 XG 14000）、フルスピードで1分間遠心操作のための渦 - 少なくとも10分間（14,000 16,000×gで）簡単に言えばフルスピードで30秒間モルホリノ液をスピン。 </li><li>モルホリノ溶液で注射針をロードします。詳細なマイクロインジェクションプロトコルの場合Stepichevaや歌、2014年21、乾杯とEttensohn、2004を参照してください。&quot;&gt; 22。 </li></ol> S. purpuratus胚で24時間ポスト受精（HPF）で3固定とその場プロトコルで 注：このプロトコルは、アレナス・メナらから変更されています。 2000年23およびセティら。 2014年24。 <ol><li> 固定 <ol><li> 、胚を含有するウェルに（下記参照）固定液を数滴を追加し、ピペッティングにより穏やかに混合し、それらを解決することができます。固定溶液を外し、固定剤の二つの追加180μLの洗浄で胚を混ぜます。 注：それは徹底的に穏やかなピペッティングを数回上下することにより回の洗浄中に胚を混合することが重要です。 そうしないと、信号対雑音比を低下させることができます。 </li><li> 10mMのMOPS pHは7.0、0.1％のTween-20、および人工seawateからなる4％の電子顕微鏡グレードパラホルムアルデヒド中で室温（RT）で1時間に50分間の第二固定液の洗浄に固定するために胚を残しますR（ASW）。最良の結果を得るために毎回このソリューションは、新鮮なことを確認します。また、使いやすさと実用性のための胚を96ウェルプレートに固定されています。 <ol><li> 20 mLのための固定剤を使用5mLの16％パラホルムアルデヒド、15 mLのASW、200μLの1 M MOPS pHが7.0、および20μLのTween-20。 </li></ol></li><li> 0.1 M MOPSのpHは7.0、0.5 M NaClおよび0.1％のTween-20、少なくとも5分間、または胚は、ウェルの底に落ちるまでから成る180μLMOPSの洗浄緩衝液で室温で洗浄を5回。ここでも、徹底的に優しく上下に数回ピペッティングすることにより、洗浄緩衝液に胚を混合することが重要です。 MOPS洗浄緩衝液は4℃で保存した場合、2日間使用することができます °C。 <ol><li> 40mLのMOPS洗浄緩衝用の4 mLの1 M MOPS pHは7.0、4 mLの5 M NaClを、32 mLののdH 2 O、および40μLのTween-20。 </li><li>固定された胚は、2日間、4 O℃で保存することができます。 注：より長い固定胚を保存する場合は、細菌の増殖を防止するために、MOPS洗浄緩衝液中の0.2％アジ化ナトリウムを加えます。</li></ol></li></ol></li><li> プレハイブリダイゼーション <ol><li> MOPSは、洗浄緩衝液吸引し、2の180μLを追加します、ハイブリダイゼーションバッファにバッファ穏やかにピペッティング数倍液に胚を混合し、室温で少なくとも20分間インキュベートウォッシュMOPSの1の比率。ハイブリダイゼーション緩衝液は、70％ホルムアミド、0.1 M MOPS pH7.0の、0.5MのNaCl、1mg / mlのBSAおよび0.1％のTween-20で構成されています。 <ol><li> 40 mLのハイブリダイゼーション緩衝液用の4 mLの1 M MOPS pHは7.0、4 mLの5 M NaClを、4 mLののdH 2 O、0.04グラムのBSA、および40μLのTween-20。再びボルテックスでよく混ぜ、28 mLのホルムアミドを追加し、渦。 </li></ol></li><li> MOPS洗浄およびハイブリダイゼーション緩衝液の1の比率と1の180μL追加：2を取り外しMOPSの2比を、ハイブリダイゼーションバッファーにバッファー液に胚を混合し、室温で少なくとも20分間インキュベート洗います。 </li><li>ハイブリダイゼーション緩衝液の150μL - プローブハイブリダイゼーションの前に軽く100に胚を混ぜます。少なくとも1つの、50℃で胚をインキュベート時間。 注：一晩胚をインキュベートすることは許容可能です。インキュベーションの前に、蒸発を防ぐために、接着シートでウェルを密閉します。 </li></ol></li><li> 交配 <ol><li>その後、渦が静かにプローブ溶液を作成するには、ハイブリダイゼーション緩衝液にプローブおよび500μgの/ mLの酵母tRNAの0.3 ngの/μL - 別のチューブに0.1を追加します。酵母tRNAは、アンチセンスプローブの非特異的結合を減少させるためにプローブ溶液に添加します。この50°Cの解決策、および吸引ハイブリダイゼーション緩衝液を予熱。 </li><li> 、プローブ溶液100μLにプレハイブリダイズ胚をミックス粘着シートで密封し、プローブに応じて、2〜7日間50℃でハイブリダイズ（foxq2プローブは、2日間インキュベートすることができます）。 注：インキュベーション時間は、プローブをオフに異なります。低レベルで発現されるいくつかの遺伝子は、7日間のインキュベーションまで必要とします。 adhes場合、96ウェルプレートは、蒸発に対する保険として湿度ボックス内に配置することができアイブシートが適切に密封するために失敗しました。 </li><li>作りたてのMOPSは3時間の合計洗浄緩衝液を180μLに50℃で5回洗浄します。その後、室温で180μLMOPSの洗浄緩衝液で3回（15分間）洗浄します。静かに数回ピペッティングすることにより、各バッファ時間洗浄に胚を混合することを忘れないでください。 </li></ol></li><li> 抗体インキュベーション <ol><li>吸引しMOPSは、MOPSで10％正常ヒツジ血清および5mg / mLのBSAからなるブロッキング緩衝液180μLに胚をバッファリングし、混ぜる洗浄は、バッファー、一晩RTまたは4℃で少なくとも45分間インキュベート洗います。 </li><li>ブロッキング緩衝液外し、1含むブロッキング緩衝液に胚を混ぜる：ブロッキング緩衝液で希釈したアルカリホスファターゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体の1500希釈。蒸発を避けるために密閉されたプレート中、室温で一晩インキュベートします。注：一晩以上の抗体を放置しないでください。 </li><li>胚を6回洗浄（5分または胚がドロップするまで）MOPSにRTでバッファを洗います。胚できます4℃で一晩保存します。 </li></ol></li><li> その場開発で <ol><li> 0.1MトリスpH9.5中、100mMのNaCl、50mMのMgCl 2を、1mMのレバミゾール、および0.1％のTween-20からなる新たに作られたpH9.5の緩衝液を用いて室温で胚を3回（10分間）洗浄します。 <ol><li> 20 mLのpHが9.5バッファ使用2 mlの1 MトリスpHは9.5、400μL5MのNaCl、1 mLの1 MのMgCl 2、20μLのTween-20、16.6ミリリットルのdH 2 O、および0.0048グラムのレバミゾール。 </li></ol></li><li>光から保護し、染色緩衝液中で37℃で胚をインキュベートします。染色バッファは、新たに作られたpH9.5の緩衝液中10％ジメチルホルムアミド、4.5μL/ mLの4-ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（NBT）、3.5μL/ mLの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル - リン酸（BCIP）からなります。 <ol><li>染色バッファー1mLのために100μLのジメチルホルムアミド、4.5μLNBT、および3.5μLのBCIPを使用しています。 </li></ol></li><li> MOPS中で3~5回洗浄することによりアルカリホスファターゼ反応を停止し、バッファを洗います。反応のwifoxq2プローブは、典型的には、1時間に30分を要し番目。いくつかのプローブは、RTまたは4℃のいずれかで一晩のインキュベーションが必要な場合があります。 </li><li> 70％のMOPS洗浄し、30％グリセロールの溶液に胚を混ぜます。グリセロールは、顕微鏡検査のために必要な屈折率を提供します。胚は、数週間のために、この溶液中で保存することができます。蒸発を防ぐためにプラスチック製のパラフィンでプレートをシール。 </li></ol></li><li> スライドの調製及び撮像 <ol><li>スライド上にストリップ間の小さなギャップを持つ三角形に両面テープの三つの小さなストリップを配置することにより、スライドを準備します。 </li><li>三角形の中央に70％のMOPS洗浄し、30％グリセロール溶液中で胚を移し、カバーガラスでカバーしています。 </li><li>カバーガラスのエッジの周りマニキュアの層を適用することにより、カバースリップをシール。 </li><li> 20Xの対物レンズと取り付けられたカメラを有する化合物の光学顕微鏡を用いて画像をキャプチャします。 </li></ol></li></ol>

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<li>Rottinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signals+guide+migration+of+mesenchymal+cells%2C+control+skeletal+morphogenesis+%5Bcorrected%5D+and+regulate+gastrulation+during+sea+urchin+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development.</a> Development. 135, 353-365 (2008).</li>
<li>Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+requires+motile+cilia+in+the+sea+urchin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin.</a> Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).</li>
<li>Technau, U., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cnidaria.+Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary crossroads in developmental biology.</a> Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).</li>
<li>Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+Wnt-Nodal+Signals+Regulate+the+Patterning+of+Anterior+Neuroectoderm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm.</a> PLoS Genet. 12, e1006001(2016).</li>
<li>Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+and+BMP2%2F4+signaling+organizes+the+oral-aboral+axis+of+the+sea+urchin+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo.</a> Dev Cell. 6, 397-410 (2004).</li>
<li>Bradham, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chordin+is+required+for+neural+but+not+axial+development+in+sea+urchin+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos.</a> Dev Biol. 328, 221-233 (2009).</li>
<li>Su, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+for+ectoderm+specification+in+sea+urchin+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks for ectoderm specification in sea urchin embryos.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789, 261-267 (2009).</li>
<li>Lin, C. Y., Su, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+sea+urchin+embryos+by+using+a+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system.</a> Dev Biol. 409, 420-428 (2016).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで紹介する方法は..多くのラボが分析する早期ウニ開発時に同様のアッセイを使用している基本的な発達のメカニズムを支配するシグナル伝達経路とGRNsを理解するために、脊椎動物未満ゲノムおよび形態学的な複雑さに胚を使用してのパワーを示している例です。他の細胞運命指定イベント（ 例えば、ノッチ、ヘッジホッグ、TGF-βの、及びFGFシグナリング）に関与する経路27、28、29、30、31シグナリング 。これらのウニの研究では、多くの興味深いと新規なシグナル伝達機構を明らかにした、と早期ウニの開発を支配するこれらのシグナル伝達機構の多くの側面は、&lt;30、27、...

遺伝子制御ネットワーク（GRNs）とシグナル伝達経路は、成体動物の体の計画を構築するために使用される胚発生の間の遺伝子の空間的および時間的発現を確立します。細胞から細胞へのシグナル伝達経路は、細胞が通信する手段を提供し、これらの調節ネットワークの重要な構成要素です。これらの細胞の相互作用は、胚発生1、2中の様々な地域でとの間の規制および分化遺伝子の発現を確立し、改良します。分泌された細胞外調節因子（リガンド、アンタゴニスト）、受容体および共受容体の間の相互作用は、シグナル伝達経路の活性を制御します。細胞内分子の品揃えは、遺伝子発現の変化、分割、および/または細胞の形で得られたこれらの入力を伝達します。主要な経路で細胞外および細胞内のレベルで使用する鍵分子の多くがあるが既知の、個々のシグナル伝達経路の複雑さに大部分の不完全な知識です。加えて、異なるシグナル伝達経路は、多くの場合、細胞外、細胞内での正または負のいずれかで互いに相互作用し、転写レベル3、4、5、6。重要なことには、シグナル伝達経路のコアコンポーネントは、非常にすべての後生動物種で保存され、特に密接に関連門の生物を比較する場合、著しく、主要なシグナル伝達経路の大部分は、多くの場合、多くの種において類似の発達機能を実行7、8、9、 10、11。 開発中にシグナル伝達の研究では、任意の生物で困難な作業であり、そしてそこに脊椎動物では、大きな可能性リガンドと受容体/共変調器の相互作用の数、細胞内伝達分子、ならびにがあります1）：ほとんどの新口動物モデル（脊椎動物、無脊椎動物脊索動物、半索動物、および棘皮動物）でシグナル伝達経路を研究するためのいくつかの重要な課題がありますゲノム12の複雑さに起因する異なるシグナル伝達経路の間の潜在的な相互作用、13、14; 2）脊椎動物の複雑な形態および形態形成の動きは、多くの場合、それはより困難でかつシグナル伝達経路間の機能的相互作用を解釈することを可能にします。 3）ほとんどの非棘皮動物無脊椎動物の新口動物モデル種における分析は、いくつかのホヤ種15、16を除いて妊娠の短いウィンドウによって制限されています。 ザウニ胚は、上記制限のいくつかを持っており、 生体内でのシグナル伝達経路の詳細な分析を行うために多くのユニークな資質を提供しています。これらは、以下のものが挙げられる：1）ウニゲノムの相対的なシンプルさが大幅に可能なリガンド、受容体/共受容体と細胞内伝達分子の数を減少させる17の相互対話します。 2）胚葉および主要な胚軸の仕様およびパターニングを制御GRNsはよく信号18、19セル受信/地域の規制状況の理解を助ける、ウニ胚で確立されています。胚は、その形態を分析するのが容易である単層上皮で構成されたとき3）多くのシグナル伝達経路は、早期に切断し、原腸ステージ間で研究することができます。 4）分子が関与しますウニ内シグナル伝達経路中のdは、容易に操作されています。 5）多くのウニは、10〜11ヶ月〜1年（ 例えばStrongylocentrotusのpurpuratusとLytechinusのvariegatus）のために妊娠しています。 ここでは、体系的かつ効率的に指定し、ウニ胚のパターン領土は、いくつかの無脊椎動物モデル系が複雑な分子メカニズムの研究に提供する利点を説明するためにシグナル伝達経路の構成要素を特徴づけるための方法を提示します。

<table><tbody><tr><td>翻訳ブロッキングモルフォリノおよび/またはスプライスブロッキングモルフォリノ</td><td>Gene Tools LLC</td><td>カスタマイズ</td><td>詳細情報</td></tr><tr><td>www.gene-tools.com Glycerol</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>FITC (デキストランフルオレセインイソチオシアネート)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>D1821</td><td>Make 25 mg/mL Stock solution</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% solution EM Grade</td><td>Electron顕微鏡科学</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1254-250G</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23336-0010</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47671-1L-F</td><td></td></tr><tr><td>酵母 tRNA</td><td>Invitrogen</td><td>15401-029</td><td></td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023-10mL</td><td></td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体</td><td>Roche</td><td>11 093 274 910</td><td></td></tr><tr><td>テトラミソール塩酸塩(レバミゾール)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9756-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base UltraPure</td><td>Research Products Internationall</td><td>Corp 56-40-6</td><td></td></tr><tr><td>Nadium</td><td>Chloride Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>BCIP (5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-リン酸</td><td>ロシュ</td><td>11 383 221 001</td><td></td></tr><tr><td>4 ニトロブルー塩化テトラゾリウム (NBT)</td><td>ロシュ</td><td>11 383 213 001</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルホルムアミド</td><td>Σ Aldrich</td><td>D4551-500mL</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Σ Aldrich</td><td>P9541-5KG</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Σ Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>Σ Aldrich</td><td>M7506-2KG</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム Σ</td><td>Aldrich</td><td>C1016-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

シンプルの力：ウニ胚として<em&gt; in vivoで</em&gt;複雑な細胞間シグナル伝達ネットワークの相互作用を研究するための発達モデル

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

驚くほど、胚発生中に成人の体型で多種多様な細胞タイプと組織を生成するために必要な細胞間シグナル伝達経路はほとんどありません。しかし、毎年、個々のシグナル伝達経路のより多くの構成要素が発見されており、研究によると、状況によっては、これらの経路のほとんどで有意なクロストークが存在することが示されています。この複雑さにより、in vivo発生モデルシステムにおける細胞間シグナル伝達の研究は困難な作業となっています。さらに、次世代のディファレンシャルスクリーニングによって生成された大規模なデータセットから同定されたシグナル伝達経路に関連する分子を特徴付けるためには、効率的な機能解析が必要です。ここでは、ウニ胚の細胞運命と軸の仕様を支配するシグナル伝達経路の構成要素を効率的に同定する簡単な方法を示します。ウニと同様の胚のゲノム的および形態学的単純さは、複雑なシグナル伝達相互作用を理解するための強力なin vivo発生モデルとなっています。ここで説明する方法論は、個々の経路における新規シグナル伝達分子や、他の多くの生物におけるさまざまな経路における分子間の相互作用を同定するためのテンプレートとして使用できます。

ウニ胚では、3つの異なるWntシグナル支店（のWnt /βカテニンは、Wnt / JNK、およびWnt / PKC）4、25相互作用は前後（AP）パターニングを支配するWntシグナル伝達ネットワークを形成することが示されています。これらのシグナル伝達イベントの中で最も重要な結果の一つは、初期広く発現し、前方神経外胚葉（ANE）GRNは、原腸形成の開始（ エス・purpuratusで24 HPF）によって前極の周りの小さな領土に限定になるということです。これらの結果は、Wnt /βカテニンシグナル伝達は32細胞期によって胚の後半にANE遺伝子の活性化を防ぐことを示しています。そして、この経路は次第にダウン60細胞期と初期の原腸形成の間の胚の前半分にANE GRNを調節する非標準的なWnt / JNKシグナル伝達経路に信号を中継します。最後に、第3の非標準Wnt pathwaYは、Wnt / PKCは、シグナル伝達経路のWnt / JNKに拮...

このビデオの記事では、体系的かつ効率的に多くの無脊椎動物の胚では、複雑なシグナル伝達経路および制御ネットワークの構成要素を特徴付けるために使用することができるin vivoでの方法論に簡単な詳細を示します。

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

これらの実験の全体的な目的は、発生プロセスを制御する遺伝子調節ネットワーク間の複雑な相互作用の研究において、単純な生物が提供する利点を明らかにすることです。この手法は、後生動物の主要な胚軸に沿った細胞運命決定をシグナル伝達経路がどのように制御しているかなど、進化生物学および発生生物学における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点の一つは、生体内（in vivo）の発生過程において、シグナル伝達経路およびそれが活性化する遺伝子調節ネットワークを効率的に特性評価できることです。この手順の実演は、Marina Martinez-Bartolomが行います。

the-power-simplicity-sea-urchin-embryos-as-vivo-developmental-models

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

この記事では、頭蓋顔面の開発中にシグナリングと表面頭部外胚葉のパターニング特性をテストするために設計された組織移植の手法を説明します。...

頭蓋顔面の開発時には外胚葉上皮のシグナリング特性を評価する

ここでは、胚での大規模培養のための改訂されたプロトコルを記述細胞エレガンス 。胚でエレガンスこの方法を用いてインビトロで培養した細胞は、細胞特異的な様式で遺伝子の発現を区別し、反復するように見える。他の組織から特定 ​​の細胞型の細胞または単離への直接アクセスを必要とする技術は、C.上に塗布することができる培養細胞エレガンス 。...

培養胚のための方法<em&gt; C.虫</em&gt;細胞

マイクロインジェクションは、卵、胚、および種々の種の細胞にDNA構築物、mRNAは、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは他の治療法を送達するために使用される一般的な技術である。...

ウニ​​接合体のハイスループットマイクロインジェクション

モルファント胚を生産する方法は、発生メカニズムや遺伝子制御ネットワークを研究するために不可欠である。海の星Patiria miniataはこれらの研究のための新たなモデル系である。ここでは、胚の培養液を生産、配偶子を取得するためのプロトコルを提示しており、この種から接合体の急速なマイクロインジェクション。...

のマイクロインジェクション法 Patiria minata接合体

私たちは、自己組織化、対称性の破れ、軸方向の発達と並行する伸長を示すマウス胚性幹細胞の凝集体を生成するためのプロトコルを開発しました。この技術により、軸方向の発生過程の研究や、単層培養では困難な細胞タイプの作製が可能になります。...

対称性の破れ、偏光と創発集団行動を表示、マウス胚性幹細胞の凝集物の生成<em&gt;インビトロ</em

Xenopusの胚では、胚盤胞の屋根からの細胞は多能性であり、さまざまな組織を生成するようにプログラムすることができます。ここでは、両生類の胚盤胞の屋根外植片をアッセイシステムとして使用するプロトコルについて説明し、初期の神経発達の主要なin vivoおよびin...

幹細胞様<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚外植片を早期神経発達の特徴を研究するために<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

&gt;jove_content&lt;ここで説明するプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚をin...

生きたゼブラフィッシュ胚における運動ニューロン膜電位のバイオセンシング

多細胞系の組織複合体は、細胞外キューと個々の細胞挙動との因果関係の同定を混同した。ここでは、C.エレガンス胚ブラストメアと接着剤ポリスチレンビーズを用いて接触依存性キューと分割軸との直接的なリンクを研究する方法を提示する。...

単離されたカエノラブディティス・エレガンス胚ブラストミアと接着剤ポリスチレンビーズを用いた空間細胞接触パターンのインビトロ再構成

ゼブラフィッシュ・ブラソドルム外植は、初期胚内の内在性シグナル伝達センターから胚細胞を単離することによって生成され、比較的ナイーブな細胞クラスターを容易に操作し、 培養したex...

ゼブラフィッシュ胚からのナイーブ・ブラストデム・エクスプラントの生成

ここでは、脊椎動物 アフリカツメガエル...

発生中の(カエル)胚における細胞系譜ガイド質量分析プロテオミクス

シグナル伝達経路の光遺伝学的操作は、発生、再生、恒常性、および疾患においてシグナル伝達がどのように解読されるかを調べるための強力な戦略となり得ます。このプロトコルは早いゼブラフィッシュの胚の光酸素電圧感知の領域基づかせていた節および骨のmorphogenic蛋白質(BMP)のシグナリングの活性剤を使用するための実用的な指針を提供する。...

ゼブラフィッシュ胚における光遺伝学的シグナル伝達の活性化

学ぶシグナル伝達経路と遺伝子制御ネットワークのin vivo解析法。無脊椎動物胚を用いて細胞運命決定を支配する複雑な相互作用を効率的に解明し、発生生物学と進化生物学の重要な問いに答える。

シンプルの力：ウニ胚として

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