Name: 器官培養とマウスウォルフダクトの全マウント免疫蛍光染色 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学ぶマウスウォルフダクトの器官培養と全マウント免疫蛍光染色法。in vivo環境を模倣し、器官の形態形成と構造発生のメカニズムを可視化する。発生生物学研究における有用な手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我々は、この原稿の重要な読書のための婦人科腫瘍学グループのメンバーに感謝したいと思います。この作品は、部分的には国立保健医療研究評議会、オーストラリア研究評議会、および癌研究所NSW（PST）からの資金提供によってサポートされています。 MKは、ニューカッスル大学院研究員の大学の受取人です。

動物のケアおよび実験手順は、ニューサウスウェールズ州の動物研究法、ニューサウスウェールズ州動物実験規制、およびケアのためのオーストラリアのコードとにニューカッスル大学の動物実験倫理委員会のガイドラインに従って行われ、確認されました科学的な目的のための動物の使用。マウスに着手すべての手順は、ニューカッスル大学の動物実験倫理委員会によって承認されました。 1.タイム交尾<ol><li>ペア6から8週齢の雄と昼光サイクルの終了直前に雌マウス。 </li><li>毎日、（8.00 AM日以前に）早朝膣栓の存在のために、女性を確認してください。プラグの日は0.5 DPCとして考えられています。 </li><li> （オスなし）新しいケージに膣栓の女性を移し、プラグの日付にラベルを付けます。 </li></ol>マウス胚性生殖隆起の2の単離<ol><li>マウスembryonを分離以下に説明するように、いくつかの修正を加えて、9で説明したように15.5 DPC妊娠女性からIC生殖隆起。 </li><li>妊婦が午後による妊娠の次の日に入ると考えられている時のように正午前に解剖を行っています。 </li><li>頸椎脱臼（または施設の動物倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って）を使用して15.5 DPC妊婦を生け贄に捧げます。 </li><li>吸収性のティッシュペーパーにその背中の上でマウスを維持し、70％エタノールで腹部の腹側をスプレー。 </li><li>鉗子で下腹部の皮膚（腹側）を持ち上げ、手術用はさみを使用して横方向の切開を行い、胸郭の端に泌尿生殖器の開口部から延びます。腹部を露出するように、動物の頭部に向けて肌を引き出します。 </li><li>腹膜腔を公開するために手術用ハサミで腹部の筋肉をカットします。ちょうど子宮頸部上記鉗子で妊娠子宮を取得し、カットをします。今トンに保持することによって子宮を持ち上げます膀胱o及び腹膜アタッチメントから子宮を分離するために子宮卵管接合部でのカットに続いて子宮広間膜をカット。 </li><li>氷冷HBSS（ハンクス液）を含む50 mLのチューブに子宮を転送します。過剰な血液を除去するために、氷冷HBSSで優しく妊娠子宮を洗ってください。 </li><li>氷冷HBSSを含むペトリ皿に子宮を維持し、氷上に置きます。子宮壁を切り取り、胚を取り出します。氷上でHBSS新鮮なペトリ皿に胚を保管してください。 </li><li>きれいな滅菌ティッシュペーパーを取り、新しいペトリ皿の上に置きます。ティッシュペーパーで70％エタノールをスプレー。側面でこのティッシュペーパーで胚を維持し、 図1に点線で示すように方向に滅菌ブレードを使用して、下腹部からそれをカット。 </li><li>脊柱を固定することによって、滅菌スポンジベースで胚を修正しました。 </li><li>解剖実体顕微鏡下でそれを置き、慎重に腹側正中線に沿って切断。肝臓と腸を削除します。マウス泌尿生殖器系（腎臓、尿管、精巣、WD、および輸精管）が表示されるようになるはずです。 </li><li>精巣およびWDを切り取り、そして氷上で、HBSSで新鮮なペトリ皿に保管。 WDおよび精巣を取り出し、尿道への取り付けに近い輸精管を切断し、導帯からWDの下部の添付ファイルをカット。 </li><li> （これは実験計画に従って変更される場合があります）同じグループの胚からの精巣およびWDSをプール。 </li></ol>胚性生殖隆起の3.文化（図2） <ol><li> 10％FBS（ウシ胎児血清）、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1％L-グルタミンを含むDMEM / F12を補うことにより、胚生殖隆起を培養するための培地を調製します。水浴中で37°Cにメディアを温めます。 </li><li> 24ウェル細胞培養プレートのウェルあたり培地300μLを加えます。 </li><li>新鮮なペトリ皿を取り、その上に無菌HBSSの小滴を置きます。ポリカーボネートトラックエッチメンブレン（0.8を入れて81;メートル）HBSSに面した輝く表面とのHBSSこのドロップに。 </li><li>きれいな鉗子を使用すると、（上向きにし、その粗面に）膜上の2つのWDSおよび生殖腺を入れて、滅菌ワイプ/吸収紙を使用して、HBSSの最大量を削除します。吸収紙で組織に触れないでください。そうでなければ、それは、組織を損傷します。 </li><li> WDSも生殖腺いずれも互いに接触していることを確認してください。そうでなければ、彼らはその後のインキュベーション中に一緒に固執します。 </li><li>空気 - 媒体インターフェースで300μLの培地と文化それらを含む24ウェルプレートのウェルに組織を有する膜を転送します。 WDSの嚢胞成長の膜の結果にあまりにも多くの培地。 </li><li> 5％CO 2の存在下で、37℃のインキュベーター中でプレートをインキュベートします。 </li><li>毎日培地を変更します。ピペットで培地を変更するには、第1ウェルから培地を除去した後、予め温め新鮮な培地300μLを追加します。 注意：WDの形態形成の異なるシグナル伝達経路の効果を研究するために、必要な濃度での化学的活性化および/または阻害剤を培地に添加することができます。 </li><li> 3日間培養組織。 3日以内に、15.5 DPCの胚から収集巻かWDSは非常に入り組んチューブ（ 図3B）に変身します。 Wntシグナル阻害剤、IWR1の添加は、巻きWD（ 図3C）の阻害をもたらします。 </li><li>これらの組織を採取するために、氷冷PBSでペトリ皿を取ります。ペトリプレートに培養生殖腺およびWDを有する膜を転送します。膜をPBSに浮遊します。 PBSでそれをシンクし、生殖腺およびWDを取り出すために、膜を押します。 </li><li> 4℃または室温で1時間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）、O / Nで組織を固定してください。必要に応じて、固定する前に、WDSの明視野像を取ります。 </li></ol> 4.ホールマウント免疫蛍光<ol><li>洗浄固定組織をPBS-T（PBS + 1％で3回RTでゆっくりと揺らし、10分ごと、とのトリトンX-100）。 </li><li>ゆっくり揺り動かし（〜30回転）で、4℃で、段階的エタノールシリーズ（25％、50％、75％及び100％）、10分毎に組織を脱水。このステップでは、組織を75％エタノール中で4℃で保存することができます。 <ol><li>エタノールを変更するには、2分間邪魔されずに組織を維持し、組織が落ち着くしましょう。できるだけ多くの上清を取り出した後、エタノールの次に高い濃度を追加します。組織への損傷を避けるために、ピペットチップは、いずれかの段階で組織に触れないようにしてください。 </li></ol></li><li>脱水後、ゆっくり揺り動かしながら4℃で、エタノール（100％、75％、50％及び25％）、10分毎に段階的に直列に組織を再水和します。 </li><li> PBS-T（PBS + 0.1％トリトンX-100）を用いて組織を洗浄し、4倍、20分毎に、室温で、穏やかで（約30 rpm）をロッキング。 </li><li>ブロッキング緩衝液を用いて室温で1時間、組織ブロック（PBS + 1％BSA + 0.2％脱脂粉乳粉末+ 0.3％トリトンX-100）。 </li><li> AFTERブロッキング、（ブロッキング緩衝液中に希釈した）一次抗体溶液に組織を転送し、穏やかなロッキング（〜30 rpm）で4℃でO / Nインキュベートします。用いた一次抗体の希釈液は、 材料表に記載されています。 </li><li>次の日は、穏やかなロッキング（〜30回転）で、室温でPBS-MT（PBS + 2％脱脂粉乳+ 0.5％のTween-20）、4倍、30分ごと、で組織を洗います。 </li><li>ブロッキング緩衝液中で（このステップは個々の抗体の最適化を必要とする）250と緩やかに揺り動かしながら、室温で1時間インキュベート：この洗浄工程に続いて、1の希釈で二次抗体を追加します。 </li><li>今年以降、二次抗体は、感光性蛍光体で標識されているように、光への暴露を防止するために、アルミホイルで覆われた組織を維持します。 </li><li>組織は緩やかに揺り動かしながら、PBS-T（PBS + 0.1％のTween-20）、30分ごとに3倍洗います。 </li><li>染色された組織を取り付けるためのスライドを準備します。 <ol><li>このために、ガラスカバースリップをカットダイヤモンドペンを用いて、薄いストリップに2つのストリップネイルエナメルを使用して、スライドガラス上の他の上の1つを貼り付けます。 2つの境界を作成し、これら2つの境界の間に組織を配置します。 </li><li> DAPIを含む封入剤を追加し、カバースリップ上に置きます。スライドにそれを修正するためにカバースリップの隅にネイルエナメルを適用します。 注：組織は現在、イメージングのための準備が整いました。 -20℃でこれらのスライドを保管してください。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+morphogenesis+of+the+Wolffian%2Fepididymal+duct%2C+more+twists+and+turns%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns.</a> Dev Biol. 325, 6-14 (2009).</li>
<li>Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+normal+and+abnormal+development+of+the+Wolffian%2Fepididymal+duct+by+using+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice.</a> Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).</li>
<li>Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt9b+plays+a+central+role+in+the+regulation+of+mesenchymal+to+epithelial+transitions+underlying+organogenesis+of+the+mammalian+urogenital+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system.</a> Dev Cell. 9, 283-292 (2005).</li>
<li>Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Wnt%2F%CE%B2catenin+signalling+is+essential+for+epididymal+coiling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial Wnt/βcatenin signalling is essential for epididymal coiling.</a> Dev Biol. 412, 234-249 (2016).</li>
<li>Murashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+roles+of+androgen+signaling+in+Wolffian+duct+stabilization+and+epididymal+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation.</a> Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).</li>
<li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+limitations+of+genetically+modified+mouse+models+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Metab%22%5BJournal%5D)">Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development.</a> Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).</li>
<li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+In+Vitro+Culture%3A+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?</a> Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).</li>
<li>Hirashima, T., Adachi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+the+Quantification+of+Whole-Tissue+Immunofluorescence+Images+Obtained+at+Single-Cell+Resolution+during+Murine+Tubular+Organ+Development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development.</a> PLoS One. 10, 0135343(2015).</li>
<li>Chan, W. Y., Blomberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+Development%3A+Methods+and+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline Development: Methods and Protocols.</a> Methods Mol Biol. 825, (2012).</li>
<li>Karner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tankyrase+Is+Necessary+for+Canonical+Wnt+Signaling+During+Kidney+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development.</a> Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).</li>
<li>Traykova-Brauch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+versatile+system+for+acute+and+chronic+modulation+of+renal+tubular+function+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice.</a> Nat Med. 14, 979-984 (2008).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

器官培養系は、伝統的な細胞培養系に比べて多くの利点を有します。このシステムは、異なる細胞型の間の元の構造関係と相互作用を保持します。これは、 インビボ系で模倣し、ニッチな要因が存在しない細胞培養研究よりも正確な情報を提供します。器官培養系の使用は、さらに、動物全体を用いて上の利点を有します。これらは、全身がすることができない動物全体を使用してのコストが高く、お手入れが簡単な器官培養系の維持、 など 。また、様々な薬理学的薬剤または薬物は、単離された/培養器官でテストすることができ、臓器の直接の応答を含んでおり、研究しました。 胚WDSの成功の培養のために考慮する必要があるいくつかの重要なステップがあります。損傷を受けた組織が十分に成長し、嚢胞にならないような組織は、それらの完全性を損傷することなく、慎重に収集しなければなりません。の上にメディアの過剰フィルタは、WDSの嚢胞の成長をもたらします。私たちはどんな汚染なしの組織培養フードの外組織の分離と文化を行いました。培地を調製し、組織培養フード内部の24ウェルプレートに添加しまし...

男性生殖器系は、主に精巣から成る、生殖細胞の発達および分化、および精子の成熟、輸送、および保管のために必要とされる複雑な管システムのためのサイト。精巣上体は、輸精管と精巣および生殖細胞1の後の精巣発達と成熟に主に関与を接続する管状の器官です。高度にコイル状の成体マウスの精巣上体は、シンプルでストレート前駆体管、ウォルフ管（WD）1から開発しています。精子が雌性の生殖細胞2を受精する能力を獲得するための精巣上体の複雑かつコイル構造が必須です。男性の生殖能力のために、このような本質的な臓器の形状に発展し、取得する方法を十分に理解されていません。様々なシグナル伝達経路は、Wntシグナル伝達経路3,4及び経路5シグナリングアンドロゲンとしてWDの発症に関与することが示されています。我々の最近の仕事は、BALの要件を確立しています出生前の開発4時のWDの巻き取り用のとれたWntシグナル伝達。しかし、さらなる研究が出生後の精巣上体のコイリング、細胞分化、および精巣上体上皮内および間質細胞と細胞間コミュニケーションに関与するメカニズムを理解するために必要とされています。 遺伝的に改変されたマウスモデルは、種々の器官系6の開発および疾患の根底にある分子機構の同定/検証のための強力なツールであることが証明されています。その広範な使用にもかかわらず、推定される遺伝子機能にに関して目標とマウス変異体の予測できない表現型、および一部のモデルでヌル変異体で無表現型、遺伝的要因と環境要因の影響を受け、労働集約を含む遺伝子改変されたマウスモデルの重大な限界があり、マウスモデルを開発する時間のかかるプロセス。したがって、唯一の遺伝的改良剤からの所見の意義の解釈fiedがマウスモデルは、常に6簡単ではありません。これらの制限は、我々に制御培養条件下で、リアルタイムで複数のシグナル伝達経路を操作するための柔軟性を提供し、インビトロ器官培養系で使用することによって克服することができます。器官培養系は、全体の臓器7の生理学および病理学を理解することに尽力しています。また、フルオロフォア標識抗体で染色した全器官の画像化は、それによって、臓器の形状、構造、および機能8のより良い理解を提供し、それはインビボで存在するように、三次元の文脈において関心のマーカーを可視化することを可能。 ここでは、そのようなWDSとして管状の器官の形態形成に関するさまざまな質問に答えるためにも適用することができるマウス胚性生殖隆起の単離、 インビトロ培養し、WDSの全体マウント免疫蛍光イメージングのための方法を、記載しています。このプロトコルでは、我々単離したマウス15.5日から胚性泌尿生殖器の尾根ポスト交尾（DPC）妊娠中のダムや上皮細胞マーカーの免疫染色に続いて3日間（サイトケラチン8、CK8）のためにそれらを培養し、細胞増殖マーカー（ホスホ - ヒストン3、PH 3）とアクティブβcatenin。

<table><tbody><tr><td>24ウェルプレート</td><td>コーニング、米国</td><td>3524</td><td>は、他のベンダーHank'から購入できます</td></tr><tr><td>s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>GE Healthcare Life Sciences, USA</td><td>SH30031.02</td><td>他のベンダーから購入できます</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td><td>Sigma, USA</td><td>D8437</td><td>37°Cで温まる;Cウォーターバス使用前の</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>Interpath,&nbsp;オーストラリア</td><td>SH30034.02</td><td>10% FBS を培地に使用</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>GE Healthcare Life Sciences, USA</td><td>SH30034.01</td><td>1% 濃度</td></tr><tr><td>使用 ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco, USA</td><td>15070-063</td><td>1% 濃度</td></tr><tr><td>使用 Whatman Nuclepore ポリカーボネート Track-Etch&nbsp;</td><td>Whatman、USA</td><td>110409</td><td>メンブレン(0.8 &micro;m)</td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Sigma, USA</td><td>10161-5mg</td><td>100 &micro;</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA)</td>を使用したM濃度<td>Electron Microscopy Sciences, USA</td><td>15710</td><td>16%ストック、4%PBS使用。有毒 - 手袋を着用し、流しに廃棄することはできません </td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>214-20L PL</td><td>Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water.</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>2509-500ml</td><td>非常に粘性があり、</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, USA</td><td>T8787-50ml</td><td>非常に粘性があり、</td></tr><tr><td>Di-Sodium Hydrogen Phosphate</td>を分注する際に注意が必要です <td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>621-500mg</td><td>他のベンダーから購入できます</td></tr><tr><td>Sodium Di-hydrogen Phosphate</td><td>Ajax Finechem, USA</td><td>4745-500g</td><td>他のベンダーから購入できます</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>465-500g</td><td>他のベンダーから購入できます</td></tr><tr><td>Cytokeratin8/Troma I</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB)</td><td>TROMA-I</td><td>1:250 ブロッキングバッファー</td></tr><tr><td>アクティブ&ベータ;カテニン&nbsp;</td><td>細胞シグナル伝達技術,&nbsp;USA</td><td>D13A1</td><td>1:200 in blocking buffer</td></tr><tr><td>phospho-Histone 3</td><td>Millipore, MA, USA</td><td>06-570</td><td>1:200 in blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa488 Goat anti-rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearchLabs,&nbsp;米国</td><td>111-545-047</td><td>1:250 ブロッキングバッファー</td></tr><tr><td>Alexa594 ヤギ抗ラットIgG</td><td>Jackson ImmunoResearchLabs,&nbsp;米国</td><td>112-585-072</td><td>1:250 ブロッキングバッファー</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国</td><td>242-500ml</td><td>他のベンダーから購入できます</td></tr><tr><td>n-プロピルガレート</td><td>シグマ、米国</td><td>2370-2</td><td></td></tr><tr><td>-(4-アミジノフェニル)-1H -インドール-6-カルボキサミジン (DAPI)</td><td>シグマ、米国</td><td>D9564-10mg</td><td>核酸 (DNA)</td></tr> <tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td> <td>サーモフィッシャーを染色するために使用サイエンティフィック、アメリカ</td><td>2225-500ml</td><td>溶剤</td></tr><tr><td>カバースリップ(24 x 50 mm)</td><td>Lomb Scientific</td><td></td> <td>CS24501GP-</td></tr></tbody></table>

器官培養とマウスウォルフダクトの全マウント免疫蛍光染色

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

卵管の形態形成は、男性生殖器系を含むほとんどの哺乳動物の臓器の開発のための基本的な要件です。精巣上体、男性の生殖器官の不可欠な部分は、精子貯蔵、熟成、および輸送を担当しています。大人の精巣上体ウォルフ管（WD）として知られているシンプルかつストレート胚性前駆体から発生する非常にコイル状の管です。精巣内の精子が卵母細胞を受精することができないとして、精巣上体の適切な巻取りは、男性の生殖能力に不可欠です。しかし、精巣上体の開発とコイリングの責任のメカニズムは、部分的に起因し、全器官培養およびイメージング方法の不足のため、不明なままです。本研究では、より良い他の管状器官を研究するために適用することができるWDの巻き取り及び発達のプロセスを可視化するために、インビトロ培養系全体マウント免疫プロトコルを記述する。

開発中に、WDはシンプルで直管は非常に複雑で、コイル状のダクトに変換された重大な変化を受けます。上記の方法を使用して、WDSは、培養条件に類似の変換を受けます。ここでは、3 D（ 図3）培養WDSからの結果を示しています。 WDの形態形成に関与する分子メカニズムを分析するために、培養培地は、異なるシグナル伝達経路を標的とする阻害剤および活性化剤を補充することができます。 図3Cは IWR1 10、Wntシグナル特異的阻害剤の存在下での培養3日後に巻かWDを示しています。矢印は、（ 図3B）コイル状とコイリングWD（ 図3C）の阻害におけるWntシグナル伝達の結果の抑制を示すWDS（ 図3AおよびC）を解かマークします。従って、この培養系はdevelの間に関与する分子メカニズムを分析するために使用することができWDS（または他の器官）の発。 異なる種類の細胞を標識するために、我々は、WDS（ ...

我々は、マウスウォルフ管（WD）の単離および培養のための方法を提示します。また、蛍光タグ付けされた抗体を用いて培養/単離されたばかりのWDSのホールマウント免疫染色のための詳細な手順を示しています。一緒に、これらの技術は、WDの開発、コイリング、および分化の研究を可能にします。

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

この器官培養およびホールマウント免疫蛍光法の全体的な目的は、ウォルフ管の誘導、コイル形成、および発生のプロセスをより詳細に可視化し、理解することにあります。本手法は、器官の形状、構造、および機能の発達に関与するメカニズムについて、発生生物学分野における重要な疑問への回答に寄与します。本技術の主な利点は、in vivo システムを模倣していることであり、ニッチ因子を欠く細胞培養研究よりも正確な情報が得られる点にあります。受精後15日目の正午前に、妊娠したマウスを吸収性のティッシュペーパーの上に仰向けに配置し、腹部の腹側を70%エタノールで噴霧します。ピンセットを用いて動物の腹側の下腹部の皮膚を持ち上げ、外科用はさみを使用して、尿生殖器開口部から肋骨まで横方向に切開します。子宮頸部の直上の膀胱をピンセットで把握し、子宮を切開します。尿Therefore、尿嚢を保持しながら、子宮広靭帯および子宮卵管接合部に切開を加え、傍子宮組織の付着部から子宮を分離します。子宮を氷冷したHBSSを含む50 milliliterチューブに入れ、組織を穏やかに撹拌して過剰な血液を除去します。洗浄した子宮を氷上に置いた新鮮な氷冷HBSSを含むペトリ皿に移し、子宮壁を切開して胚を取り出します。回収した胚は、氷上の新鮮なHBSSを入れた新しいペトリ皿に順次移します。新しいディッシュの中の、エタノールを染み込ませた滅菌ティッシュペーパーの上に、胚を側面に沿わせるように置きます。次に、滅菌ブレードを使用して、動物の下腹部を斜めに切開します。胚の脊柱に沿って滅菌スポンジベースにピンで固定し、解剖用実体顕微鏡の下に胚を移動させます。腹側正中線に沿って慎重に切開し、肝臓と腸を除去します。これで尿生殖系が視認できるようになります。精管の、尿道への付着部に近い部位を切開します。続いて、精巣およびウォルフ管を採取するため、ウォルフ管下部と移行索の付着部を切開します。採取した組織は、回収しながら氷上の新鮮なHBSSを入れた新しいシャーレに移します。胚性生殖腺隆起を培養するには、まず24ウェル細胞培養プレートの各ウェルに300 µLの培地を加えます。次に、新しいペトリ皿に滅菌HBSSを少量滴下し、その滴の上に0.8 µmのポリカーボネートトラックエッチ膜を、光沢のある面をHBSSに向けて置きます。組織を水和状態に保つため、常にHBSSの滴の上にメンブレンを配置し、メンブレンの粗い面を上にしてください。清潔なピンセットを使用して、組織同士が接触しないように、メンブレンの粗い面上に2つの生殖堤を配置します。滅菌ワイプを使用して、余分なHBSSを取り除きます。生殖堤をメンブレン上に転送する際は、2本のピンセットの腕でサンプルを挟んで持ち上げ、転送後にメンブレンから余分なHBSSを取り除くことで、ウォルフ管の嚢胞状増

organ-culture-whole-mount-immunofluorescence-staining-mouse-wolffian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオでは、無傷の前立腺がんオルガノイドの免疫蛍光染色の技術と、ホールマウント共焦点顕微鏡によるそれらのイメージングについて説明しています。この手法は、基底細胞および管腔前立腺上皮細胞のex...

ホールマウント免疫蛍光イメージング:インタクトオルガノイドを評価するための固定および染色技術

改良されたイメージング技術により、発生中の臓器の3次元イメージングが可能になりました。ここでは、マウス胎児の腸で発生中の絨毛をライブイメージングできる全臓器培養システムについて説明します。...

マウス胎児腸全体培養システム生体外シグナル伝達経路の操作と絨毛開発の3次元ライブイメージング

この資料に記載されている間接免疫プロトコルは、検出およびマウス乳腺中のタンパク質の局在を可能にします。完全な方法は、乳腺のサンプルを調製するために蛍光顕微鏡により画像を、組織切片の免疫組織化学を実行し、画像を再構成するために与えられています。...

マウス乳腺の凍結切片の間接免疫

ex vivoの直立液滴培養は、現在のin vitroおよびin...

使い方<em&gt;エクスビボ</em&gt;全体の胎児器官の直立飛沫培養物をマウス器官中に発生過程を研究します

シリアルセクショニングせず若いマウスの培養の卵巣内の卵胞を定量化するためのプロトコルを紹介します。全臓器の蛍光抗体法と組織をクリア使用して、、光学セクショニングに置き換えられます物理的な区分します。試料調製及び可視化のこのメソッドでは、オルガンの整合性を維持し、特定のセルの自動定量評価を容易に。...

全体のマウントの蛍光抗体法と培養マウス卵巣の卵胞の定量化

遺伝子改変マウスは、前立腺癌のメカニズムを調査するための有用なモデルです。識別とマウス泌尿生殖器から前立腺の丸い突出部を解剖、組織学に基づく区別と分離および下流解析の回転楕円体として体外主な前立腺細胞文化プロトコルをご紹介します。...

培養 3 D 回転楕円体モデルでのマウス前立腺の葉の解剖組織学的特性及び

ここでは、原発性新生児マウス精巣細胞から精巣オルガノイドを生成する4つの方法、すなわち、細胞外マトリックス(ECM)およびECMフリーの2Dおよび3D培養環境について説明する。これらの技術は、複数の研究アプリケーションを持っており、体外で精巣の発達と生理学を研究するために特に有用である。...

細胞外マトリックスベースおよび細胞外マトリックスフリーのマウス精巣オルガノイドの生成

本プロトコルは、半日本円上皮周期の特定段階を表す成体マウス半細管の断面微小切除法、およびその中の細胞タイプ、および後にスカッシュ製剤および無傷の管状セグメントの免疫染色を記述する。...

下流免疫染色解析のためのマウス半離層上皮周期の特定段階のトランスイルミネーション支援解離

本プロトコルは、成マウス雌マウス尿道の上皮内膜を単離し、フローサイトメトリー、免疫染色、オルガノイド培養などの下流解析のための最適化方法を提示します。これらの手法により、フローサイトメトリー解析、全額イメージング、効率的なオルガノイド形成により、濃縮され生存可能な尿道上皮細胞が得られました。...

単細胞および免疫蛍光解析のために雌マウス尿道上皮を単離する最適化方法

口蓋開発の研究は、口蓋裂、驚異的な健康の負担を課し、外観を損なうを持続残すことができ先天異常の発生率が動機とされています。ここでは口蓋の開発および融合に関与する種々のシグナル伝達経路を研究するために使用することができる培養口蓋棚の技術を実証します。...

静的器官培養を使用して口蓋の融合を研究の方法

学ぶマウスウォルフダクトの器官培養と全マウント免疫蛍光染色法。in vivo環境を模倣し、器官の形態形成と構造発生のメカニズムを可視化する。発生生物学研究における有用な手法です。

器官培養とマウスウォルフダクトの全マウント免疫蛍光染色

さらに動画を探す