レジオネラ・ニューモ外膜小胞：マクロファージ上における炎症誘発ポテンシャルの単離と解析

この研究の全体的な目標は、レジオネラ・ニューモフィラから外膜小胞またはOMVを標準化された方法で精製し、ヒトおよびマウスのマクロファージにおける細菌複製への影響を分析することです。この方法は、外膜小胞研究の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、OMV調製の標準化された手順は、宿主と病原体の相互作用に対するOMVの影響を研究するのに役立つ可能性があります。

この手法の主な利点は、レジオネラ菌の肺炎球OMVがヒトまたはマウスのマクロファージに与える影響を研究するための標準化されたプロトコルを提供し、これによりレジオネラ菌の肺炎球の病原性の理解が向上することです。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、OMVの炎症誘発性の可能性と、OMVがレジオネラ菌によって宿主細胞内および細胞外に放出されるため、これが感染の経過にどのように影響するかについて考えたときでした。この手順は、私の研究室の技術者であるKerstin Hoffmannとポスドク研究員のAnalina Youngによって実演されます。

まず、無菌状態で作業しながら、L.pneumophila株コアBをBCYE寒天プレートに広げ、摂氏37度で3日間インキュベートします。プレカルチャープレートのL.pneumophilaを使用して、OD600 0.3で10ミリリットルのYEB培地を接種し、回転するシェーカーで37°Cで細菌を6時間インキュベートします。血液寒天プレート上に懸濁液100マイクロリットルを広げて、液体培養物の純度を確認します。

血液寒天プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。残りの液体培養物を90ミリリットルの新鮮なEEB培地に加え、回転するシェーカーで培養物をインキュベートし、OD600が3.0〜3.5に達するまで培養します。液体培養物を4, 000gで20分間遠心分離し、細菌をペレット化します。

次に、上清を新しい遠心分離チューブに移します。バクテリアペレットを廃棄し、サンプルを再度遠心分離してから、遠心分離ステップをもう一度繰り返します。次に、残りの上清を2回ろ過滅菌します。

次に、バクテリアを含まない上清を超遠心チューブに移し、サンプルを摂氏4度で100, 000gで3時間回転させます。上清をデカントして捨てます。次に、滅菌PBSを使用してOMVペレットを再懸濁し、プールします。

超遠心分離ステップを繰り返して、汚染されたタンパク質と遊離LPSを除去します。次に、上清を捨て、超遠心チューブを滅菌綿棒で乾かします。OMVペレットを500マイクロリットルの滅菌PBSで再懸濁します。

次に、血液寒天プレートとBCYE寒天プレートにそれぞれ20マイクロリットルを縞模様にして、調製した小胞の細菌汚染を排除します。血液寒天プレートを一晩インキュベートし、BCYE寒天プレートを3日間インキュベートします。製造元の指示に従ってBCYEアッセイを使用し、得られたOMV調製物のタンパク質量を定量化します。

テキストプロトコルに従ってTHP-1細胞をマクロファージに分化させた後、500マイクロリットルの新鮮な培地を使用して分化培地を交換し、細胞を摂氏37度でさらに24時間インキュベートします。THP-1またはマウスのBMDM細胞をOMVで治療するには、事前に調製したOMVを解凍し、細胞に適切な量を添加します。マクロファージをOMVと37°Cで少なくとも20時間インキュベートして、野生型L.pneumophila株コアBの前処理または未処理のTHP-1細胞、またはこの株のべん毛欠損変異体を持つマウスBMDM細胞に、細胞から培地を変更せずに感染させます。

MOIが0.5でバクテリアを添加し、これはウェルあたり5番目のL.pneumophilaの10の1倍に相当します。培養物をそれぞれ24時間および48時間インキュベートします。細胞を溶解するには、最終濃度0.1%のサポニンを添加し、細胞を5分間インキュベートします。

次に、溶解したマクロファージをピペッティングで再懸濁し、懸濁液を反応容器に移します。滅菌PBSを使用して、L.pneumophila懸濁液の段階希釈液を調製します。次に、必要な希釈液をBCYE寒天プレートに50マイクロリットルの線で縞模様にし、プレートを3日間インキュベートします。

形成されたコロニーを目視で数え、テキストプロトコルに従って計算を実行します。この実験では、L.pneumophila OMVsの炎症誘発性の可能性を調べると、PMA分化THP-1細胞はIL-8およびIL-6分泌の時間と用量依存的な増加に応答します。ここでは、異なる遺伝的背景を持つマウスBMDMにおいて、異なるToll様受容体がL.pneumophila OMV認識に及ぼす影響をCXCL-1 ELISAアッセイを用いて解析しました。

野生型マウスのマウスBMDMは、OMV刺激後にCXCL-1を分泌しましたが、TLR2/4ダブルノックアウトのマウスBMDMは分泌が有意に少なかった。L.pneumophila OMVsがTHP-1マクロファージの細菌複製に及ぼす影響を研究するために、細胞をOMVと20時間事前にインキュベートした後、さらにL.pneumophilaに感染させました。THP-1由来マクロファージの事前刺激は、感染の24時間後に最初に細菌の複製量を依存的に減少させますが、後の時点でCFU数が倍増します。

この実験で示されたように、OMVを用いたマウスBMDMの事前刺激は、野生動物由来のマウスBMDMのCFU数を10倍に増加させますが、TLR2ノックアウトおよびTRIF/MyD88マクロファージは、OMVの事前インキュベーション後のL.pneumophila複製のこの増加を示さない。この手順を試みる際には、無菌条件下で作業し、精製されたOMVの細菌汚染を確認することを忘れないでください。そうしないと、ダウンストリーム分析で決定的な結果が得られません。

この手順に続いて、ナノ粒子追跡分析などの他の方法を実行して、どのレジオネラ変異体が多かれ少なかれOMVを生成しているかなどの追加の質問に答えたり、OMVの分泌に対するさまざまなストレス条件の影響を調査したりすることができます。その開発後、この技術は、OMV研究の分野の研究者がin vitroおよびin vivoで宿主と病原体の相互作用に対するOMVの影響を調査する道を開きました。このビデオを見れば、OMVを精製する方法と、その後のマクロファージの感染に対するOMVの影響の分析を開始する方法について十分に理解できるはずです。

このプロトコールは、インキュベーションと増殖時間を適応させた後、さまざまなグラム陰性菌とそれぞれの宿主細胞に適用できます。レジオネラ・ニューモフィラを扱う作業は、人間にとって非常に感染力が強いため、レジオネラ菌を取り扱い、この手順を実行する際には、常に滅菌ベンチの下で作業を行う必要があることを忘れないでください。