Name: レジオネラ・ニューモ外膜小胞：マクロファージ上における炎症誘発ポテンシャルの単離と解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 学ぼう、Legionella pneumophilaから外膜小胞を単離し、マクロファージにおける炎症誘発ポテンシャルを解析する標準化手法。この方法は細菌病原性の理解を深め、宿主-病原体相互作用の研究に貢献します。

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私たちは、TLR2をご提供するための教授マルクスSchnareに感謝- / -およびTLR2 / 4 - / -マウスおよびTRIF / MyD88のための教授カルステンKirschning - / -マウス。 、ドイツ学術協会（SFB / TR-84; BundesministeriumがビルドゥングウントForschung（：： - - http://www.bmbf.de/メッドCAPSYS FKZ 01X1304E FKZ 0316175B、電子バイオmiRSys e）をFURことで、この作業の一部は資金を供給されましたhttp://www.sfb-tr84.de/）、およびHessisches MinisteriumのfürWissenschaftウントクン（LOEWE医療RNomics - FKZ 519/03 / 00.001-（0003）; http://www.proloewe.de/medicalrnomics）、すべてのBSへ。

1.培地および寒天プレートを準備します<ol><li>ブロス培地（YEB）の1 Lを用意。 ACES 10gと蒸留水900mL中で酵母エキス10gを溶解させます。 KOH（5 N）で6.9にpHを調整します。 L-システイン（蒸留水10mLの0.4 g）を10 mLを加え、Feの10ミリリットル（NO 3）3 x9H 2 O（蒸留水10mLの0.25 g）を得ました。蒸留水で1Lに埋めるとソリューション（孔径：0.22μm）を滅菌ろ過します。 4℃で保存。 </li><li>寒天プレートの緩衝木炭酵母エキス（BCYE）を準備します。 ACES 10gと蒸留水900mL中で酵母エキス10gを溶解させます。 KOH（5 N）で6.9にpHを調整します。寒天の15グラム、活性炭の2.5グラムを追加します。蒸留水、オートクレーブで1Lに埋めます。 <ol><li> L-システイン（10mLの蒸留水で0.4グラム）の10 mLを加え、Feの10ミリリットル（NO 3）3 x9H 2 O（10mLの蒸留水で0.25グラム、0.22μmの濾過滅菌の両方BCYE（約50℃）を冷却するための孔）。 4℃でプレートや店舗を注ぎます。 </li></ol></li></ol> 2. L.ニューモフィラの育成<ol><li> BCYE寒天プレート上L.ニューモ株コービー（野生型、WT）を広げ、3日間37℃でそれらをインキュベートします。前培養プレートからL.ニューモでOD 0.3の600でYEB 10mLのを接種します。 6時間、回転シェーカー（150rpmで）上で37℃で細菌を培養します。 </li><li>血液寒天プレート上に懸濁液100μLを拡散することにより液体培養物の純度を確認してください。 37℃で一晩インキュベートします。 </li><li>新鮮なYEB培地の90 mLに残りの液体培養を追加し、約16〜20時間を要しOD 3.0から3.5の600に到達するために、回転シェーカー（37℃、回転数150rpm）上でインキュベートします。 </li></ol> 3.準備とL.ニューモのOMVを定量化注：以下の遠心分離工程のすべてを行って無菌条件下で4℃で秒。 <ol><li>細菌をペレット化し、20分間4000×gで液体培養を遠心。 、新たな遠心チューブに上清を移し細菌ペレットを廃棄し、遠心分離（20分間4,000×gで）を繰り返します。一度、この手順を繰り返します。 </li><li>滅菌フィルタ残りの上清は二回（孔径：0.22μmで）。 3時間、100,000×gで超遠心管と超遠心分離機に細菌を含まない上清を移します。 </li><li>上清を除去し、それを捨てます。汚染タンパク質およびLPSを除去するために、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）および超遠心機（3時間100,000×gで）にOMVペレットを再懸濁します。 </li><li>上清を捨て、滅菌PBSの500μLにOMVペレットを再懸濁します。準備された小胞の細菌汚染を排除するストリーク血液寒天プレート上とBCYE寒天プレート上で20μL。両方とも37℃（3日間終夜血液寒天プレートおよびBCYE寒天プレートをインキュベート6; C）。 </li><li>製造業者の指示に従ってビシンコニン酸アッセイを用いOMV調製物から得られたタンパク質の量を定量します。 注：100mLのL.のニューモ文化の濃度は、通常を1μg/μLです。 -20℃で調製し、定量化のOMVを保管してください。 </li></ol> 4.前処理マクロファージ<ol><li> THP-1細胞を準備します。 注：THP-1白血病患者由来の単球細胞株です。 <ol><li> 24ウェルあたり2×10 5 THP-1細胞を添加し、マクロファージ様細胞に20 nmのホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）を加えることにより、それらを区別します。 37℃で24時間インキュベートします。 </li><li>新鮮な培地の500μLで培地を交換し、さらに24時間インキュベート。 THP-1細胞のための最適な培地を、10％ウシ胎児血清を補充したRPMI1640高グルコースで構成されています。 </li></ol></li><li>参照ので説明したように、マウス骨髄由来マクロファージ（mBMDM）を単離しますレンス20。 </li><li> OMVを用いたTHP-1由来マクロファージやmBMDMを扱います。 <ol><li>ステップ3で調製したOMVを解凍し、ヒトまたはマウスのマクロファージへのタンパク量（0.1、1、および10μg/ mL）をに従ってそれらを追加します。少なくとも20時間、37℃でのOMVとマクロファージをインキュベートします。 ELISAのために上清を使用するか、手順5に進みます。 </li></ol></li></ol> 5.マクロファージに感染し、コロニー形成単位（CFU）アッセイで細菌の複製を評価します<ol><li>ステップ2.1からL.ニューモを使用して 、ステップ4.3からTHP-1細胞またはmBMDMを前処理された、およびコントロール（2×10 5月24日のウェル）としてマクロファージを事前に処理されていません。培地を交換しないでください。 </li><li> L.ニューモコービー（0.5の感染多重度（MOI）との両方; 1×10 5 L.ニューモ / 24ウエル）のフラジェリン欠いた変異体とL.ニューモコービーWTとmBMDMとTHP-1細胞に感染し、24インキュベートそれぞれ48時間、。 BOを準備第L.ニューモコービー（WTまたはフラジェリン欠いている変異体）ステップ2.1で説明したように。 </li><li>溶解サポニンを添加することにより、それらの培地中の細胞（最終濃度：0.1％）、5分間37℃でインキュベートします。 </li><li>ピペッティングにより細菌を再懸濁し、反応容器に懸濁液を移します。滅菌PBSでメディアを含有L.ニューモの連続希釈液を調製します。 </li><li>ストリークBCYE寒天プレート上で必要な希釈液50μL、37℃で3日間インキュベートします。 </li><li>視覚的に形成されたコロニーを数えます。 CFUを計算<img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/55146/55146eq1.jpg" />前処理が、100％に設定されたマクロファージを、感染していないためCFUカウント結果を正規化します。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

細菌性病原体およびそれらの標的細胞上のこれらの膜小胞の影響のOMVは、現在集中的に研究されています。例えば、 クロストリジウム・パーフリンジェンスののOMVが、マクロファージにおけるサイトカインの分泌を誘導由来、Bリンパ球は、 ボレリアブルグドルフェリからのOMVによって活性化され、およびヘリコバクター・ピロリは、膜小胞は、胃上皮細胞21、22、23に作用することができる-releasedできます。 L.ニューモ 、非定型肺炎の重症型を誘導することができる細胞内病原体は、また、肺上皮細胞とマクロファージ16、19を活性化することができるのOMVを解放します。ここでは、肺炎でのOMVの潜在的な役割を研究するための培養液からL.ニューモのOMVの小規模単離するための詳細なプロトコルを提示します。無菌コンディット下で作業することが重要ですイオンおよび純粋L.・ニューモフィラを得るために、他の細菌からの汚染を排除するためには、OMV調製物が由来しました。 OMVを単離は、最大のOMVは、この濾過工程で失われるので、これは、OMVの収率を低下させるにもかかわらず、L。ニューモで得られるOMVペレットの汚染を防止するために、0.22ミクロンの細孔を介して濾過するステップを含みます。 さらに、我々はより密接のOMVが細胞外細菌15でLCVの内側にリリースされたレジオネラ肺炎、の状況に近づけるために、これらの単離された小胞およびL.ニューモで感染した細胞にヒトおよびマウスマクロファージの応答をテストしました。採用OMVの用量は、インキュベーションの24時間後のヒトマクロファージのインビトロ感染における自由OMV量に応じて推定されている（参考文献20に記載）。他のレシピエント細胞の刺激のために、またはin vivo実験において 、他のOMV投与量が必要になるかもしれませんし、確立されなければなりません。 L.ニューモフィラのOMVの効果の分析はイェーガーとシュタイナー24によって記述されたプロトコルに進歩を表しています。 ここでは、PMA分化THP-1細胞は、初代​​ヒト材料の限られた在庫状況により、肺胞マクロファージのモデルとして役立ちます。 PMAの添加は、マクロファージ様細胞25への単球THP-1細胞を区別する。さらに、それらは、L。ニューモ研究 26のための周知のモデル細胞株です。このヒト単球細胞株のほか、mBMDM細胞が使用されます。 mBMDMは広くL.ニューモ 27、28、29の効果の研究のために受理されています。異なるのTLRまたは他のタンパク質のための遺伝子ノックアウトを使用する可能性は、それらのOMV効果を研究するための貴重なツールとなっています。 ORDで実験あたりのマウスの量を低下させるために、ERは、mBMDMではなく、マクロファージの制限による肺胞マクロファージから使用されています。主な実験は、検証のために肺胞マクロファージを必要とするかもしれません。 OMVを精製するための超遠心分離の本明細書に記載のプロトコルに加えて、Chutkan らのプロトコルに含まれている密度勾配遠心分離を行うことができます。 30。これは、得られたOMV調製物の純度を向上させると共精製されたタンパク質の凝集、フラジェリン、およびLPSの量を減らすことができます。得られたOMV調製物の純度は、品質管理における補助ステップとして、透過型電子顕微鏡法によって、またはナノ粒子追跡分析によって分析することができます。これは、ここで提示タンパク質の測定手順を超えて、定量化の追加の手段を提供することができます。任意に、LPS濃度はリムルス変形細胞溶解物の試験によって分析することができます。 OMV収率が低い場合、遠心フィルターを経由して、追加の濃縮工程は、ここで行われなかった、実行することができます。収量が予想より低かった場合は、OMVを廃棄しました。 OMVを背後にある生物学的メカニズムと機能を解明するための継続的な取り組みの一環として、OMVの生産に異なるストレス条件の影響を試験することができます。栄養欠乏、インキュベーション温度の変化、または有害な薬剤への曝露は、OMV分泌31に影響を与える可能性があります。可能性のあるストレス条件はKlimentovaとStulik 32によってプロトコルで説明されています。また、ハイパーまたはhypovesiculating L.・ニューモ変異体が生成することができます。異なるOMV調製物は、その後、（文献17に記載）、ヒト肺組織外植片、あるいはin vivoモデルにおけるマクロファージの感染実験で分析することができました。細菌の通信における自然免疫シグナル伝達におけるのOMVの役割、彼らの影響力のほかに実験的に対処することができます。さらに、様々な自然免疫シグナル伝達カスケードの影響は、マウスノックアウト細胞の使用またはヒト細胞株におけるCRISPR / Cas9ノックアウトの生成によって分析されることがあります。 OMVのこの基礎研究はすでに髄膜炎菌 33によって送信された髄膜炎Bのために存在する新たなワクチン戦略の開発を支援します。 OMVの単離および特徴上のプロトコルから始めて、1は、他のグラム陰性菌および他の宿主細胞にこれを適用することができます。それは、液体培養における細菌の増殖を調整する必要があります。 Chutkan らによって発表されたプロトコル。 大腸菌や緑膿菌 30からのOMVの生成に関する詳細な情報を提供しています。文化を溶解し、細菌の増加と汚染タンパク質とMEMを避けるために、後期定常期に達するべきではありませんブレーン。さらに、宿主細胞の刺激のために使用されるOMV用量は依然として細胞毒性の低い速度を確保しながら、 インビボでの感染の間のOMVの存在量に応じて決定する必要があります。このように、OMVをの病理学的役割は、種間の通信、およびホスト病原体相互作用に及ぼす影響を調べることができました。 さらに肺炎でL.ニューモのOMVの役割を研究するために、十分な収量と同等の感染実験で標準化されたOMV調製物が必要とされています。このプロトコルは、分離手順を標準化し、他のグラム陰性菌および他の宿主細胞へのOMVの研究を拡張するのに役立ちます。さらに、研究は、 インビボでの設定に実験を拡張するために使用することができる、 インビトロ知識に詳細恩恵を受ける。今後は、このプロトコルは、血清又は気管支LAVとして、主要な生物学的材料からのOMVの単離に拡張することができ年齢流体は、生理学的条件の下でリリースするOMVの組成への洞察を得るために。これは、OMV組成物の重要なパラメータを決定し、in vitroで -generatedのOMVの性質を理解するのに役立ちます。

<html>細菌は異なるメカニズム1を介して病原性因子を分泌することができます。よく知られている分泌システムのほかに、グラム陰性細菌は、情報を交換することができ、直径及び二層状膜構造を持つ小さな、回転楕円体小胞10〜300nmである外膜小胞（OMVを）を介して病原性因子を提供します。彼らは、成長環境（液体培養、固体培養、およびバイオフィルム）の様々な、すべての成長段階2、3に分泌されます。 OMVを輸送する重要な手段である（ 例えば、OMVの表面上に見出されるタンパク質、アドヘシン、毒素、酵素、ならびにためのLPSのための）4。管腔内の貨物は、タンパク質分解から保護されたので、長い距離にわたって作用することができる、と小胞は、体液や遠隔臓器5、6で見つけることができますされています「外部参照」&gt; 7、8。彼らは認識し、真核細胞9,10によって取り込まが、さらに、それらは、宿主細胞4に細菌およびそれらの浸潤の結合を促進することが可能であることはできません。 レジオネラ・ニューモフィラ （L.ニューモは ）のOMVを解放することができ、グラム陰性細菌です。ヒトの肺では、それは主に、その天然の宿主は淡水アメーバ11であっても、肺胞マクロファージに感染します。 L.・ニューモフィラ感染はレジオネラ症、肺炎12の重症型を引き起こす可能性があります。また、宿主細胞内のブロックファゴソーム - リソソーム融合を。複製ニッチ、 レジオネラ -含有小胞（LCV）は、13、14を形成することも、ホスト細胞内小器官を動員します。リソソーム分解だけでなく、エフェクタータンパク質TRAによって阻害されますIV型分泌システムを介して、だけでなく、OMVを15のリリースによりnslocation。 細菌培養物からのOMVの精製は、レシピエント細胞に対する効果を分析するために必要とされます。 L.ニューモフィラのOMVのタンパク質含有量に及び肺胞上皮細胞16が、ヒト肺組織移植とその後の研究に小胞の影響に焦点を当てた初期の研究はL.ニューモフィラのOMVは肺胞マクロファージ17によって取り込まれることを実証しました。 OMVを、本病原体関連分子パターン（PAMP）および他の細菌抗原として、それらは、真核細胞の感染に影響を与えると宿主免疫応答18を調節するかもしれません。 L.ニューモフィラのOMVが急速さらに、それらは、膜TLR2 19を活性化する 、宿主細胞膜と融合し、。それはL. pneumophことが知られているようILAのOMVは、炎症誘発性の様式16、17にマクロファージおよび上皮細胞を刺激し、我々は、ヒトおよびマウスのマクロファージにおける感染プロセスに対するのOMVの影響を分析しました。 ここでは、直接、または感染後、差動超遠心分離により分泌のOMVを分離し、真核生物の宿主細胞に小胞の影響を評価するために、液体培養中でL.・ニューモフィラの栽培のためのプロトコルを説明します。

<table><tbody><tr><td>10cmシャーレ</td><td>Sarstedt AG &Co KG (ニュンブレヒト、ドイツ)</td><td>82.1473</td><td></td></tr><tr><td>70 Ti rotor</td><td>Beckman Coulter Incorporation (California, USA)</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>ACES</td><td>Carl Roth GmbH &Co KG (カールスルーエ、ドイツ)</td><td>9138.2</td><td></td></tr><tr><td>活性炭</td><td>Carl Roth GmbH &Co KG (カールスルーエ、ドイツ)</td><td>X865.2</td><td></td></tr><tr><td>寒天、神戸I</td><td>Carl Roth GmbH &Co KG (カールスルーエ、ドイツ)</td><td>5210.2</td><td></td></tr><tr><td>コロンビア寒天、5% 羊の血液</td><td>Becton Dickinson GmbH (ハイデルベルク、ドイツ)</td><td>254005</td><td></td></tr><tr><td>キュベット</td><td>Sarstedt AG &Co KG (ニュンブレヒト、ドイツ)</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>ELISA (human)</td><td>BD OptEIA&trade;;Becton Dickinson GmbH (ドイツ、ハイデルベルク)</td><td>IL-8: 555244 IL-6: 550799</td><td></td></tr><tr><td>ELISA (マウス)</td><td>DuoSet, R&D(米国ミネアポリス)</td><td>CXCL1:DY453-05</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NO3)3x9H2O</td><td>Carl Roth GmbH &Co KG (カールスルーエ、ドイツ)</td><td>5632.1</td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児血清 (FCS)</td><td>Life Technologies GmbH (ダルムシュタット、ドイツ)</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i CO2 インキュベーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィックドイツBV &Co KG (ブラウンシュヴァイク、ドイツ)</td><td>40830469</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV &Co KG (Braunschweig, Germany)</td><td>75004515</td><td></td></tr><tr><td>Inoculation loop&nbsp;</td><td>ザルスタットAG &Co KG (ニュンブレヒト、ドイツ)</td><td>86.1567.010</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Carl Roth GmbH &Co KG (カールスルーエ、ドイツ)</td><td>6751.1</td><td></td></tr><tr><td>L. pneumophila Corby</td><td>---</td><td>---</td>親切提供:<td>Prof Dr Antje Flieger (RKI, Berlin, Germany)</td></tr><tr><td>L. pneumophila Corby &Delta;flaA</td><td>---</td><td>---</td>親切提供:<td>Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlin, Germany)</td></tr><tr><td>L-cystein</td><td>Carl Roth GmbH &Co KG (カールスルーエ、ドイツ)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mBMDM</td><td>---</td><td>---</td> <td>Prof Dr Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Germany) and Prof Dr Carsten Kirschning (University Duisburg Essen, Essen, Germany)</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom GmbH (Berlin, Germany)</td><td>L 1825</td><td></td></tr><tr><td>phorbol 12-myristate 13-acetate</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany)</td><td>P8139-1MG</td><td></td></tr><tr><td>回転式シェーカー(MaxQ 6000)</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV &Co KG (ブラウンシュヴァイク、ドイツ)</td><td>SHKE6000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 high glucose</td><td>Life Technologies GmbH (ダルムシュタット、ドイツ)</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>saponin</td><td>Carl Roth GmbH &Co KG (カールスルーエ、ドイツ)</td><td>9622.1</td><td></td></tr><tr><td>Ultrospec 10</td><td>Biochrom Ltd (ケンブリッジ、イングランド)</td><td>80-2116-30</td><td></td></tr><tr><td>滅菌フィルター (細孔サイズ: 0.22 & マイクロ;m)</td><td>コーニングインコーポレイティッド(米国ニューヨーク</td>)<td>431096</td><td></td></tr><tr><td>THP-1</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH(タウフキルヒェン、ドイツ)</td><td>88081201-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Discovery 100 SE</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV &Co KG(ブラウンシュヴァイク、ドイツ)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>Carl Roth GmbH &Co KG (カールスルーエ、ドイツ)</td><td>2363.2</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA protein assay kit</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV &Co KG (ブラウンシュヴァイク、ドイツ)</td><td>23225</td><td></td></tr></tbody></table>

レジオネラ・ニューモ外膜小胞：マクロファージ上における炎症誘発ポテンシャルの単離と解析

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

バクテリアは、さまざまな分泌システムを通じてさまざまな分子を分泌することができます。グラム陰性菌は、分子が細胞外空間に分泌されたり、別の細胞に直接分泌されたりするだけでなく、外膜小胞(OMV)を形成することもあります。これらの膜小胞は、貨物を長距離にわたって輸送することができ、貨物はプロテアーゼやヌクレアーゼによる分解から保護されています。
Legionella pneumophila (L. pneumophila) は、重篤な肺炎を引き起こす細胞内、グラム陰性病原体です。ヒトでは、肺胞マクロファージに感染し、リソソームの分解をブロックし、特殊な複製液胞を形成します。さらに、L. pneumophilaは、さまざまな増殖条件下でOMVを産生します。ヒトマクロファージの感染過程におけるOMVの役割を理解するために、液体培養物から細菌膜小胞を精製するためのプロトコルを設定しました。この方法は、示差超遠心分離に基づいています。その後、濃縮されたOMVをタンパク質およびリポ多糖(LPS)の量に関して分析し、ヒト単球細胞株またはマウス骨髄由来マクロファージの治療に使用しました。これらの細胞の炎症誘発性応答は、酵素結合免疫吸着アッセイによって分析されました。さらに、その後の感染における変化を解析した。この目的のために、マクロファージにおけるL.ニューモフィラの細菌複製をコロニー形成単位アッセイによって研究しました。
ここでは、超遠心分離による液体培養からのL. pneumophila OMVの精製と、マクロファージに対するそれらの炎症誘発性の可能性の下流分析のための詳細なプロトコルについて説明します。

L.ニューモのOMVを調製するための、および感染後のマクロファージの炎症誘発性応答に及ぼす影響を分析する実験は、図1に示されています。調製したOMVの炎症誘発電位は、 図2に示されているPMA分化THP-1細胞上で分析することができます。 THP-1細胞を、IL-8およびIL-6分泌の時間および用量依存的増加に応答します。 図3にCXCL1 ELISAによって提示されるように加え、L。ニューモ OMV認識の異なるTLRの影響は、異なる遺伝的背景からmBMDMを用いて分析することができます。 OMV刺激後CXCL1分泌WTマウスからmBMDM、しばらくmBMDM TLR2 / 4 - / -大幅に少ない分泌。 THP-1マクロファージにおける細菌の複製にL.ニューモのOMVの影響を研究するために、細胞は、OMVを用いてプレインキュベートし、次いで、さらに感染させましたL.ニューモフィラ （ 図4 A）で。 THP-1由来マクロファージの刺激前には、最初の感染の24時間後に細菌の複製を減少させるが、それは後の時点（48時間π）でCFU数の倍増につながります。 図4 Bに提示されるようなマクロファージの感染後のOMV認識にシグナリングToll様受容体（TLR）の影響は、mBMDMによって評価することができます。 OMVのプレインキュベーション後のWT動物からmBMDMで十倍による細菌の複製が増加し、TLR2ながら- / -およびTRIF / MyD88に- / -細胞はL.・ニューモフィラ複製におけるこの増加を示しません。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig1.jpg" /> 図1：実験手順。 （A）L. ニューモコービーWT 10センチBCYE寒天プレートは、新鮮なYEBの90ミリリットルに移し、少量の液体培地（10ミリリットル）を、接種するために使用されているから6時間後の培地。少量はまた、純度を確認するために、血液寒天プレート上にプレーティングされます。細菌は、初期定常期（OD 600 = 3.0〜3.5）になるまで37℃でインキュベートします。細菌を除去するために、（B）液体培養物を遠心分離し、滅菌濾過しました。 レジオネラフリー次いで、上清をPBSに再懸濁し、再び超遠心分離されたOMVペレットを得るために超遠心分離されます。単離された小胞は、純度をチェックし、再懸濁し、およびタンパク質の量を定量します。スケールバーは2.5 cmで表します。 （C）ヒトまたはマウスのマクロファージを定量したOMVで刺激します。細胞培養上清をELISAに使用することができ、またはマクロファージは、10センチBCYE寒天プレート上のCFUアッセイによって細菌複製を決定するために、L・ニューモで感染させることができます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> </A&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig2.jpg" /> 図2：L.ニューモフィラのOMVによるTHP-1細胞のプロ炎症活性化。 （A）ここで、単球THP-1細胞株は、肺胞マクロファージのモデルとして使用されます。 PMA分化THP-1細胞を、それぞれ、24および48時間L.ニューモのOMV（0.01〜25 / mlの）の漸増用量で処理しました。無細胞上清を、IL-8 ELISAのために使用しました。 SEM±3つの独立した実験の平均値が示されています。 THP-1細胞は、時間および用量依存的であった重要なIL-8分泌、とわずか0.01 / mlのL.ニューモのOMVに反応しました。 （B）L。ニューモフィラのOMV（0.1μgの/ mL）をPMA分化THP-1細胞を刺激するために使用しました。上清をインキュベーションの24および48時間後に収集し、そして放出されたIL-6はELISAにより上清中で測定しました。。 SEM±3つの独立した実験の平均値が示されています。偶数のOMVの最低用量（0.1μgの/ mL）で、IL-6の有意な量を分泌したTHP-1細胞。 IL-6の分泌は、OMV用量の増加に伴って延長し、インキュベーション時間と共に増加しました。統計：マンホイットニー検定。 * P &lt;対応0 / mlのOMVに比べ0.05および**はp &lt;0.01。リファレンス20からの許可を得て転載<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig2large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig3.jpg" /> 図3：マクロファージの炎症誘発性活性化はTLR2 / 4に依存します。 WTからmBMDM及びTLR2 / 4 - / -マウスはL.ニューモのOMV（0.1を1μg/ mL）でインキュベートしました。 CXCL1分泌は、それぞれ、24および48時間後にELISAによって分析しました。ザ3つの独立した実験の平均値±SEMが示されています。 WTマウスからmBMDMはL.ニューモ OMVのインキュベーション後に用量依存CXCL1の分泌と答えました。 TLR2 / 4 - / - mBMDMは、WT mBMDMと比較して有意に少ないCXCL1を分泌し、この分泌は用量依存的に増加しませんでした。統計：マンホイットニー検定。対応する0 / mlのOMVと比較して、*はp &lt;0.05; #P &lt;0.05は等しく扱わWTサンプルと比較します。リファレンス20からの許可を得て転載<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig3large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig4.jpg" /> 図4：マクロファージにおけるL.ニューモ OMVプレインキュベーション増加細菌複製。 （A）分化したTHP-1細胞のOMV（0.1、1、または10μと共にプレインキュベートしました。;グラム/ ml）またはLPS / IFN-γ（200 ngの/ mLの各）またはコントロールの未処理のままとしました。プレインキュベーション（20時間）後、THP-1細胞を、それぞれ、2、24、及び48時間L.ニューモコービーWT（MOI 0.5）で感染させました。 THP-1細胞は、サポニンを添加することによって溶解し、そして細菌をBCYE寒天プレート上にプレーティングしました。 CFUは、すべての時間点の後0 / mlのOMVと比較して計算しました。バーは、3つの独立した実験、技術的な二重に実行される各の平均値±SEMを表します。細菌の取り込みの差異は、前処理されていない細胞と比較して（2時間の感染後（PI））が存在しませんでした。細菌の複製の変化は、それぞれ、24および48時間後に測定しました。 LPS / IFN-γ前処理されたTHP-1細胞は、これはまた、L。ニューモ OMVプレ処理した細胞の用量依存的に観察された細菌負荷の24時間PIの減少を示しました。後の時点（48時間PI）では、OMVの前処理されたTHP-1細胞は、L。ニューモフィラ再で倍増を示しましたLPS / IFN-γ前処理されたマクロファージ一方ひだは、細菌負荷のさらなる低減を示しました。統計：マンホイットニー検定。 * P &lt;対応0 / mlのOMVに比べ0.05および**はp &lt;0.01。 20時間は0.1μg/ mLのL。ニューモフィラのOMVでプレインキュベートし、次いで、フラジェリンを感染させた（B）mBMDMは異なる遺伝的背景を有するマウス（WT、TLR2 - / - 、およびTRIF / MyD88の- / - ）から48時間L.ニューモコービー（MOI 0.5）の欠損変異体。 mBMDMは、サポニンを添加することによって溶解し、およびレジオネラを BCYE寒天プレート上にプレーティングしました。 CFUは、実線で示され、0 / mlのOMVに対して計算しました。バーは平均値±±3つの独立した実験のSEM、二重に行っそれぞれを表します。 WTマウスからmBMDMはOMV前処理後のL.・ニューモフィラの複製の増加を示しました。 TLR2 - / -マクロファージは、有意に減少を示しました<emTRIF / MyD88のに匹敵するものであった&gt;レジオネラ複製、 - / - mBMDM。統計：マンホイットニー検定。 WTサンプルと比較してp &lt;0.05。リファレンス20からの許可を得て転載<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig4large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

ここでは、 レジオネラ・ニューモフィラ （L.ニューモ ）液体培養物から外膜小胞（OMVを）の精製を記載しています。これらの精製された小胞は、次いで、それらのプロ炎症性の可能性を分析するために、マクロファージの治療のために使用されます。

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

本研究の全体的な目的は、Legionella pneumophilaから外膜小胞（OMV）を標準化された方法で精製し、ヒトおよびマウスのマクロファージにおける細菌複製への影響を解析することです。この手法は、外膜小胞研究分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。例えば、OMV調製の標準化された手順は、ホスト・病原体相互作用に対するOMVの影響を研究する際の一助となる可能性があります。本手法の主な利点は、Legionella pneumophila OMVがヒトまたはマウスのマクロファージに及ぼす影響を研究するための標準化されたプロトコルを提供できることであり、これによりLegionella pneumophilaの病原性に関する理解を深めることができる点にあります。私たちがこの手法を考案したきっかけは、OMVが炎症を惹起させる可能性と、Legionellaが宿主細胞内および細胞外の両方でOMVを放出することから、それが感染経過にどのような影響を与えるかを検討したことでした。本手順は、私の研究室の技術員であるKerstin Hoffmannと、博士研究員のAnalina Youngによって実演されます。まず、無菌条件下で L.pneumophila strain core B を BCYE 寒天プレートに塗布し、37 °C で3日間培養します。前培養プレートの L.pneumophila を用い、OD600 が 0.3 になるように 10 mL の YEB 培地に接種し、回転振盪機を用いて 37 °C で6時間培養します。懸濁液 100 µL を血液寒天プレートに塗布し、液体培養物の純度を確認します。血液寒天培地プレートを37 °Cで一晩インキュベートします。残りの液体培養液を90 mLの新鮮なYEB培地に加え、OD600が3.0から3.5に達するまで回転振盪機で培養します。液体培養液を4,000 gで20分間遠心分離し、細菌をペレット化します。その後、上清を新しい遠心チューブに移します。細菌ペレットを廃棄し、サンプルの遠心分離を再度行い、その後もう一度遠心分離ステップを繰り返します。次に、残った上清をフィルター滅菌で2回ろ過します。次に、細菌を除去した上清を超遠心管に移し、4 °Cで100,000 gにて3時間遠心分離します。上清をデカンテーションで除去して廃棄してください。その後、滅菌済みPBSを用いてOMVペレットを再懸濁し、それらをまとめます。不純物として混入しているタンパク質および遊離LPSを除去するため、超遠心分離の手順を繰り返します。次に、上清を廃棄し、滅菌綿棒で超遠心管内を乾燥させます。OMVペレットを500 µLの滅菌PBSで再懸濁します。次に、調製したベシクルの細菌汚染を除外するため、血液寒天培地およびBCYE寒天培地のそれぞれに20 µLずつ塗抹します。血液寒天培地は一晩、BCYE寒天培地は3日間インキュベートします。得られたOMV調製物のタンパク質量を定量するために、製造元の指示に従ってBCYEアッセイを行います。本文のプロトコルに従ってTHP-1細胞をマクロファージに分化させた後、500 µLの新鮮な培地で分化培地を置換し、37 °Cでさらに24時間インキュベートします。THP-1またはマウスBMDM細胞をOMVで処理するには、あらかじめ調製したOMVを融解し、適切な量を細胞に添加します。培地を交換することなく、マクロファージをOMVとともに37 °Cで少なくとも20時間インキュベートし、前処理済みまたは未処理のTHP-1細胞に野生型L.pneumophila strain core Bを、あるいはマウスBMDM細胞に同株の鞭毛欠損変異株を感染させます。MOI 0.5（1ウェルあたり1×10⁵のL.pneumophilaに相当）で細菌を添加します。培養物をそれぞれ24時間および48時間インキュベートします。細胞を溶解させるため、最終濃度0.1%になるようにサポニンを添加し、細胞を5分間インキュベートします。次に、ピペッティングによって溶解したマクロファージを再懸濁し、懸濁液を反応容器に移します。滅菌PBSを用いて、L.pneumophila懸濁液の段階希釈系列を調製します。その後、必要な希釈段階の液を50 microlitersずつBCYE寒天平板に塗抹し、プレートを3日間培養します。形成されたコロニーを目視でカウントし、テキストプロトコルに従って計算を行います。本実験では、L.pneumophila OMVの炎症惹起能を検討しており、PMA分化THP-1細胞は、時間および用量依存的にIL-8およびIL-6の分泌を増加させます。ここでは、L.pneumophila OMVの認識に対する異なるtoll-like receptorの影響を、異なる遺伝的背景を持つマウスBMDMにおいてCXCL-1 ELISAアッセイを用いて解析しました。野生型マウス由来のマウスBMDMは、OMV刺激後にCXCL-1を分泌しましたが、TLR2/4ダブルノックアウトマウス由来のマウスBMDMでは分泌量が有意に低下しました。THP-1マクロファージにおける細菌複製に対するL.pneumophila OMVの影響を調べるため、細胞をOMVで20時間前培養した後、さらにL.pneumophilaを感染させました。THP-1由来マクロファージへの事前刺激は、感染後24時間では細菌複製を用量依存的に減少させましたが、より後期の時点ではCFU数が2倍に増加しました。本実験で示されたように、マウスBMDMをOMVで事前刺激すると、野生型動物由来のマウスBMDMではCFU数が10倍に増加しますが、TLR2ノックアウトおよびTRIF/MyD88欠損マクロファージでは、OMVの事前インキュベーション後のL.pneumophila複製においてこの増加は見られません。本手順を行う際は、無菌条件下で作業し、精製したOMVに細菌汚染がないか確認することが重要です。さもなければ、後続の解析で決定的な結果を得ることはできません。本手順に続き、どのLegionella変異株がより多く（あるいは少なく）OMVを産生しているかという追加の疑問への回答や、異なるストレス条件がOMVの分泌に及ぼす影響を調査するために、ナノ粒子トラッキング解析などの他の手法を行うことができます。本手法の開発により、OMV研究分野の研究者が、in vitroおよびその後のin vivoにおける宿主・病原体相互作用へのOMVの影響を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、OMVの精製方法、およびマクロファージへのその後の感染に対するOMVの影響の解析を開始する方法について、十分に理解できたはずです。このプロトコルは、培養および増殖時間を調整することで、異なるグラム陰性菌およびそれぞれの宿主細胞に適用することが可能です。Legionella pneumophila の取り扱いはヒトに対して極めて感染性が高いため、Legionella を扱う際および本手順を実施する際は、常に無菌ベンチ内で作業を行うことを忘れないでください。

legionella-pneumophila-outer-membrane-vesicles-isolation-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

この資料では、無傷の単離および精製する方法を説明します...

病原体胞の精製から<em&gt;レジオネラ菌</em&gt;感染した食細胞

出典: Jung, A. L. et al., Legionella pneumophila 外膜小胞: マクロファージにおける炎症誘発性の分離と分析。J. Vis.

外膜小胞で前処理されたマクロファージにおけるレジオネラニューモフィラ複製のアッセイ

出典:ユング、A. L.、他レジオネラ肺炎菌外膜小胞:マクロファージにおける炎症促進作用の単離と解析。J. Vis. Exp.(2017年)このビデオは、逐次遠心分離、無菌ろ過、超遠心分離を用いて レジオネラ...

レ ギオネラ・ニューモフィラ 外膜小胞の超遠心分離による分離

この動画では、細胞内病原菌であるリステリア菌が培養マクロファージに感染した後、フローサイトメトリーを用いて細胞内および細胞外リステリア菌を定量しています。...

In vitroでの細胞内および新興細胞外リステリア菌のフローサイトメトリー解析

この手法は、収穫する方法を提供するものであり、哺乳動物細胞の感染に先立って自然原虫の宿主細胞にあらかじめ栽培されている細菌性病原体の細胞内増殖を正常化し、定量化する。このメソッドは、プライミング段階のための宿主細胞、ならびに標的細胞の種類の多種多様に対応するように変更することができます。...

原虫でプライミング細菌で扱いやすい哺乳動物細胞感染

ワックス蛾ハチノスツヅリガの幼虫は、最近、 レジオネラ·ニューモフィラ感染を研究するためのin vivoモデルとして設立されました。ここでは、接種、細菌の病原性とレプリケーションの測定だけでなく、感染した血球の抽出と分析を含む幼虫にレジオネラ症の病因を特徴づける基本的な技術を実証する。...

使用<em&gt;ハチノスツヅリガ</em&gt;モデル生物として研究する<em&gt;レジオネラ·ニューモフィラ</em&gt;感染症

マクロファージは、長い自然免疫と獲得免疫応答の重要な構成要素として認識されている。マクロファージや微生物間の相互作用の進化遺伝的、および生化学的な側面に関する知識の最近の爆発はマクロファージへの科学的関心をリニューアルしました。この記事では、マウスの骨髄からマクロファージを差別化する方法を説明している。...

骨髄由来マクロファージの生産

プローブに細菌の病原体を用いた細胞・生体レベルのホスト応答

細菌細胞のイメージングは、大きな高分子機械の機能を決定する静的および動的プロセスの定義に焦点を当てた新しいシステム生物学アプローチです。ここでは、定量的ライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の統合により、レジオネラ菌型肺炎球体系IV型分泌系のアーキテクチャと機能を研究しています。...

レジオネラ肺球菌ドット/Icm分泌系の空間的特徴を解決するためのライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の適用

提案されたプロトコルには、細胞培養上清から細胞外小胞を単離する際にエンドトキシンによる汚染を回避する方法と、それらを適切に評価する方法に関するガイドラインが含まれています。...

がん細胞株由来の低エンドトキシン含量細胞外小胞の単離

学ぼう、Legionella pneumophilaから外膜小胞を単離し、マクロファージにおける炎症誘発ポテンシャルを解析する標準化手法。この方法は細菌病原性の理解を深め、宿主-病原体相互作用の研究に貢献します。

レジオネラ・ニューモ外膜小胞：マクロファージ上における炎症誘発ポテンシャルの単離と解析

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