マウス子宮内膜上皮と間質細胞の単離のために

本プロシージャの全体的な目的は、in vitroでの脱落膜化の研究のために、マウス一次子宮内膜の間質細胞および上皮細胞を単離・培養し、それらを共培養することです。この手法は、脱落膜化や栄養膜細胞の浸潤といった重要な過程において、上皮細胞と間質細胞の間でどのようなパラクリンシグナリングが行われているか、またそのシグナル伝達経路がどのように制御されているかなど、生殖医療分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。これらの技術を用いることで、上皮細胞と間質細胞の共培養システムにおける脱落膜化のプロセスを研究することが可能です。

このシステムを用いることで、2つの細胞のうち一方から分泌されるシグナル分子が、このプロセスに影響を与えるかどうかを評価できます。子宮を採取する前に、腟刷道試験を行い、動物のサイクル相を確認してください。これにより、発情期にあるマウスのみを選択します。

膣洗浄液中に角質細胞が存在することで定義されます。次に、鉗子と鋏を用いて第1発情期の動物の腹部を開き、腸管を脇に寄せて両側の子宮角を視認できるようにします。卵管の下にある子宮角の最遠位端を掴み、解剖用鉗子を用いて子宮組織を卵管から剥離させ、Dumont 5番鉗子で脂肪組織および結合組織を除去します。

次に、子宮体の上方にある遠位端の角を切り離します。子宮角を切り離した後、3 mLのHBSSを入れた35 mmペトリ皿に配置します。すべての子宮角を回収したら、皿を実体顕微鏡下に移動させ、ピンセットを用いて残存している脂肪組織および結合組織を除去します。

次に、Dumont 5番ピンセット、解剖用ピンセット、および小型スプリング剪刀を用いて、子宮角を縦方向に切開して管腔を露出し、新鮮なHBSSを入れた新しいペトリ皿で組織を洗浄します。その後、すべての子宮角をパンクレアチンとトリプシンを含む15 milliliterチューブに移します。そして、組織を水平に配置し、オービタルシェーカーを用いて4 degrees celsius、50 rpmで60分間インキュベートします。

1時間後、チューブをベンチ上に移し、振盪せずに45分間水平状態でインキュベートし、続いて37 °Cの恒温水槽で振盪せずに15分間水平状態でインキュベートします。水槽でのインキュベーション終了後、上清を注意深くデカンテーションし、子宮を冷やしたマウス子宮内膜上皮細胞培地を含むペトリ皿に移して5分間静置し、トリプシンの活性を失活させます。次に、組織を3 mLの冷えたHBSSを含む15 mLチューブに移し、10秒間ボルテックスして上皮シートを剥離させます。

次に、3 mLの新鮮なHBSSを入れた新しいペトリ皿で子宮を洗浄し、先ほど示した方法でさらに2回、上皮シート懸濁液を2本の新しい15 mLチューブに回収します。3回目の組織ボルテックス後、子宮をマウス子宮内膜基質細胞消化液を含む15 mLコニカルチューブに移し、37 °C、200 rpmで30分間インキュベートします。3つの細胞懸濁液を100 µmナイロンメッシュで静かにピペッティングして組織片を除去し、得られた細胞懸濁液を遠心分離して上皮シートを回収します。

ペレットを12 mLのマウス子宮内膜上皮細胞用培地に再懸濁し、十分に混合した後、5分間静置して、残っているマウス子宮内膜間質細胞を重力で分離させます。沈降後、5 mLピペットを用いて上清の上部2 mLを慎重に回収し、回収した細胞を遠心分離します。その後、マウス上皮細胞のペレットを、緩やかなピペッティングにより上皮細胞用培地で再懸濁します。

そして、計画している後続の解析に適した密度で、コラーゲンコートしたカバースリップに細胞を播種します。上皮細胞の分離後、間質細胞の処理に進み、子宮が入ったマウス間質細胞消化チューブをインキュベーターから取り出します。30分間のインキュベーション後、先ほど示したように、チューブを手で10秒間静かに振り、子宮を3 mLの4 °C HBSSが入ったペトリ皿に移します。

組織を十分に洗浄し、消化チューブにストローマ細胞培地を3 mL加えてトリプシンの活性を停止させ、その後、新鮮なマウス子宮内膜ストローマ細胞培地3 mLを含む15 mLコニカルチューブに子宮を移します。組織が入ったチューブを10秒間、穏やかに振盪します。次に、子宮を冷やしたHBSSが入ったディッシュに移し、続いて新しいストローマ細胞培地を入れた15 mLチューブに移します。

組織を3回目に洗浄して移した後、新鮮なマウス子宮内膜間質細胞消化ミックスを用いて、37°Cで30分間、子宮組織をインキュベートします。消化終了後、チューブ1から3およびトリプシンチューブから細胞懸濁液を40 µmのナイロンメッシュに通し、さらに5 mLのマウス子宮内膜間質細胞培地でメッシュを洗浄します。その後、遠心分離によって細胞を回収します。

ペレットを新鮮なマウス子宮内膜間質細胞培地で再懸濁し、予定しているダウンストリーム解析に適した密度で、ポリリシンコートしたカバースリップに播種します。初代細胞培養の純度は、vimentinとcytokeratinの発現量の差によって評価できます。vimentinレベルはマウス子宮内膜間質細胞で高く、マウス子宮内膜上皮細胞では低いのに対し、cytokeratinレベルはマウス子宮内膜上皮細胞で高く、マウス子宮内膜間質細胞では低いためです。

mentinとサイトケラチンの二重染色は、ストローマ細胞によるmentinの発現と、上皮細胞によるサイトケラチンの独占的な発現をさらに明確に示しています。cyclic adenosine monophosphateおよびMPAの投与によるストローマ細胞培養における脱落膜化の誘導により、対照のストローマ細胞培養と比較して、5日間の処理後にプロラクチンmRNAレベルが劇的に上昇することが明らかになりました。細胞培養インサート内の上皮細胞は可視化が困難であるため、5日間の脱落膜化シミュレーションの直後に生存率アッセイを実施することができ、色が青から鮮やかなピンクに変化することで生存している上皮細胞の存在が示されます。

この手法に続いて、胚盤胞の存在下で上皮細胞から分泌される因子がストローマ細胞の脱落膜化を誘導できるかどうかを評価するために、胚盤胞付着アッセイなどの他の手法を実施することができます。