Name: マウス子宮内膜上皮と間質細胞の単離のためにインビトロ脱落膜化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学ぶマウス子宮内膜上皮細胞と間質細胞の単離培養法。インビトロ脱落膜化の研究に用いる共培養システムを確立し、細胞間パラクリンシグナリングを解析する。生殖医学の基礎研究に応用可能です。

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この作品は、研究財団・フランダース（FWO G.0856.13N）とKUルーベン（OT / 113分の13）の研究評議会からの助成金によってサポートされていました。 KDCはFWOベルギーによって運営されています。 AHはOT / 113分の13によって運営されています。我々は、共焦点顕微鏡を使用するためKUル​​ーベン（http://gbiomed.kuleuven.be/english/corefacilities/microscopy/cic/cic.htm）の細胞イメージングの中核施設に感謝したいと思います。

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著者らは、開示することは何もありません。

脱落膜化は脱落膜細胞を分泌ラウンドに子宮内膜間質細胞のプロゲステロン依存分化です。ヒトでは、このプロセスは、月経周期の黄体期の間に自然に発生し、predeciduaを形成する血管細胞を取り囲む間質細胞で開始されます。しかし、げっ歯類では、胚盤胞の存在が脱落膜化を誘導することが不可欠です。脱落膜化のみ子宮内膜上皮細胞との接触後に生じるということは重要な要因は、基礎となる間質に脱落膜化を誘導するために上皮細胞によって分泌されることを意味します。脱落膜化プロセスの開始におけるこの差は認められるべきであるが、ヒト脱落膜が胚移植時よりロバストになるという事実は、同様のメカニズムが関与している可能性を示唆しています。 インビトロでの細胞培養は、しばしば脱落膜化のプロセス中に特定の分子の効果を研究するために使用されます。それにもかかわらず、回収することができる可用性およびヒト組織の量は、多くの場合、限定されるものではなく、 例えばバリエーション、周期相、妊娠回数および子宮内膜症や腺筋症などの婦人科疾患の存在を伴っています。これらの問題の多くは、容易にアクセスおよびサイクルフェーズは独立しているマウスの組織を使用することによって防止することができます。マウス組織を使用する別の強力な利点は、遺伝的に修飾されたげっ歯類を使用する機会実験多数の設定の可能性です。現時点では、多くの異なるアイソレーションプロトコルが使用する瞬間に、動物の年齢および発情期中期間に高い変動と文献に記載されています。 この研究は、利点は、分離前のエストロゲンの毎日の注射によって標準化された発情周期を撮影した間質および上皮細胞の初代子宮内膜共培養するための新しい方法を提示しています。さらに、エストロゲンは、kはさらに単離当たり収量を増大させる、上皮および間質細胞において増殖を誘導することがノウン。このホワイトペーパーで説明する単離プロトコールは、グラントらに基づいていました。 図7に示すように 、しかし、さらなる最適化のステップは、異なる細胞培養物の収量、純度および生存率を増加させることが含まれていました。まず、HBSSは常に一次培養物の汚染を避けるために抗生物質を補充しました。 MEECの単離の間、温度適応が最初に消化中の上皮細胞の収穫を増加させる（37℃、15分）を行いました。次に、追加のステップは、その活性を阻害するためにFBSを含有する培地を添加することによってトリプシン消化後に酵素活性を和らげるために含めました。さらに、MEECsメッシュは、一般的に、彼らは、しばしばクラスタ、細胞シートに来るように（100ミクロン）に記載されているものよりも大きかったそれらのフィルターに通しました。また、間質細胞による汚染は、addを実行することにより減少しましたMEECsとされたmESCは、重力沈降に基づいて分離されたitionalステップ。それがコーティングされていないか、PLLでコーティングされたガラスカバースリップへの取り付けが不十分であることが明らかとなった最後に、MEECsは、カバーガラスへの細胞の付着を高めるために、コラーゲンでコーティングされたカバースリップ上に播種しました。たmESCの単離の間、コラゲナーゼ（1mg / ml）を、消化を改善するために添加しました。さらに、この消化ステップは、残りMEECsの汚染を避けるために、二重に行きました。すべてのこれらの追加の工程は、均質な細胞集団の純粋な、生存培養物が得られました。 細胞集団の純度は、上皮マーカーとして間質マーカー及びサイトケラチンとしてビメンチンを使用して免疫染色し、定量RT-PCRで評価しました。明らかに、ビメンチンとサイトケラチンの反対の発現パターンはMEECとMESCで観察されました。しかし、ビメンチンおよびサイトケラチンの相対的mRNA発現はMEEC培養物において類似していることに気づいたことができます。 Similarの結果は、培養中の上皮細胞はビメンチン発現9を獲得した他の研究グループによって公開されています。より重要なビメンチンおよびサイトケラチンの間のタンパク質発現の差は、異なる細胞集団の免疫組織染色で観察された通りです。二重免疫染色は、EECSはサイトケラチン陽性であったとESCはビメンチン陽性であったことを示しました。免疫染色におけるこれらのマーカーの使用は、確立された方法であり、標準的な細胞型10を示すために使用されます。 多くの研究は、MESCの脱落膜化で実行されているが、それは、このモデルにおける上皮細胞の存在は、脱落膜化の結果を変化させることが可能なままです。第一に、MEECはMESC馴化培地の存在下で、または共培養設定で単層に成長する場合、単分子層は、（改良された上皮細胞の経上皮電気抵抗を有することが示されていますTEER）、MESC 7によって分泌される因子に起因します。また、ピエロら。 図11は、17βエストラジオールの影響を受け、上皮増殖は、間質細胞から分泌される因子によって媒介される可能性があるという証拠を提供し、あるいは、上皮細胞は、間質脱落膜12,13を調節する因子を放出することができます。全体として、上皮 - 間質共培養環境はパラクリン相互作用および通信を可能にする多くの生理学的状況を提供することは明らかです。インサート共培養系を使用して、2つの異なる細胞型を培養する方法は、14、15先に説明したおよびマウス初代細胞を使用するように適合させました。脱落膜のための読み出しなどのプロラクチンmRNAレベルの検出により、記載された技術が利用可能であり、許可脱落膜のための非常に再現読み出しを持っていますそれによって脱落膜中の上皮 - 間質関係の研究です。 MEECから媒介パラクリン信号は、間質細胞に脱落膜化の程度を変更することがあります。また、モデルは、直接、間質細胞に影響を与えることなく、上皮側の特定の変調を可能にします。したがって、MEECとMESCのこの共培養は、間質脱落膜上の読み出しと上皮細胞上などホルモン、サイトカイン、の効果を評価するための最適なツールを提供しています。この共培養系の別の利点は、研究者らは、トランスジェニック動物から単離された細胞を使用することにより、上皮または間質区画のいずれかにおける脱落膜化工程における特定のタンパク質の関与を調査することを可能にすることです。さらに、この技術は、胚盤胞の存在下で上皮細胞によって分泌されるパラクリン因子は、基礎となる間質の脱落膜化を誘導するのに十分であるかどうかを評価するために、胚盤胞の接着性を調査するために非常に有用であろう細胞。栄養膜浸潤の重要なステップは、タンパク質分解酵素の作用によって媒介される細胞外マトリックスの分解に相関していました。提案された技術は、胚盤胞、上皮細胞および支持基質間のクロストークを調査するためのインビトロモデルとして適用することができます。 しかし、現時点ではほとんどの腺としてだけでなく、管腔することができます上皮細胞の起源について知られています。したがって、上皮細胞の遺伝的および分子プロファイルのさらなる特性が要求されます。また、記載された方法は、上皮細胞の分極に関する利用可能な知識が限られています。現時点では、上皮細胞の分極を考慮していませんでした。しかし、膜タンパク質の発現の差は、頂端および基底膜に記載されています。上皮層の不適切な分極がepitheli間のパラクリン相互作用に影響を与える可能性がありますアルと間質細胞。しかし、分極した上皮細胞を得るための方法が記載されていると記載された技術15、16に含めることができます。 要するに、記載されたプロトコルは、正常マウスの子宮内膜上皮細胞と間質細胞の初代細胞培養を確立するための技術が提案されています。定量RT-PCRによって確認し、ビメンチンおよびサイトケラチンの免疫染色この技術は、純粋な細胞培養物をもたらします。最終的には、上皮および間質共培養は、脱落膜化工程でMEECおよび/またはMESCのいずれかによって媒介されるパラクリン信号の調査を可能に導入されました。

ヒト子宮内膜は、子宮の内側のライニングであり、可能な妊娠のための準備として、故障や修理の毎月のサイクルを受けます。これは、子宮内腔の内側を覆う上皮細胞の単層および卵巣ホルモンのエストロゲンとプロゲステロンの変動に応じて厚さが変化し、基礎となる間質で構成されています。黄体期の間、排卵後のプロゲステロンサージが大きく、丸い脱落膜細胞に脱落膜化1、2と呼ばれるプロセスを子宮内膜間質細胞の分化を誘導します。ヒトでは、この現象はpredeciduaを形成するために自然に起こるが、胚移植時に、より顕著になります。脱落膜化の機能的結果は、子宮は一過性胚移植の受容になることです。この間隔は、「移植の窓」としてラベル付けされています。胚移植の早期期間中、脱落膜化電子移植胚を取り囲むndometrial間質細胞は、胚3に有害な物質の通過を防止するためのバリアを提供します。胎盤形成が行われた、と後に胎盤4の母体の一部を形成する前に、妊娠中、この脱落膜は、発達中の胎児のための栄養素を提供します。 倫理的かつ実用的な考慮事項は、脱落膜化のプロセスを調査するために人間の研究の設計を制限し、動物モデルの使用を促してきました。 hemochorial胎盤グループの一員として、げっ歯類の子宮内膜はまた、胎盤5の前に脱落膜化を受けることになります。げっ歯類では、しかしながら、脱落膜化プロセスの開始は、余分な刺激が脱落膜反応6をトリガするために必要であることを示し、子宮腔における胚盤胞の存在に依存します。これは、番目の間の複雑な通信を意味します電子胚盤胞との直接接触を持っている子宮内膜上皮細胞、および基礎となる間質細胞。それにもかかわらず、脱落膜化は、人為的に機械的なスクラッチやホルモンプライミングされた子宮内のオイルの点滴などの刺激を用いて誘導することができます。人工脱落膜化モデルを用いたin vivo研究は、私たちが脱落膜化の複雑なシグナル伝達過程で私たちの洞察力を向上させているが、機構的で詳細な研究、 例えば、上皮細胞と間質細胞間の不可欠なコミュニケーションの調査は、限られています。したがって、 インビトロの脱落膜化の研究は、重要な経路を操作し、基本的なプロセスを研究するために使用することができます。この目的を達成するために、主要な子宮内膜間質細胞培養物は、ヒトまたは齧歯類子宮内膜から設定することができます。げっ歯類を採用する脱落膜化工程中の関心の特定のタンパク質の役割を調べるために遺伝子改変動物の使用を納得します。しかし、未熟、prepuberTYマウスは、しばしば他の場合には子宮は培養における不均一が生じる発情周期の全ての段階から収集され、一方、発情周期の合併症を回避するために使用されます。また、脱落膜化のプロセスは、培養培地への、または、マウスからの脱落膜細胞の（ii）の単離によって（I）補充ホルモン（エストロゲン、プロゲステロンまたは環状アデノシン一リン酸（cAMP））により、例えば 、異なるプロトコルで研究されていますプラグチェックや精管切除した男性のための追加の必要性を要求する（擬似）妊娠、一日4.5。これらの制限は、 インビトロ脱落膜で勉強する標準化された方法の必要性を実証します。本研究では、生理学的モデルは、大人から始まるin vitroでの脱落膜化を調べるために、非（擬似）妊娠マウスが表示されます。この方法では、17βエストラジオール（E2）の毎日の注射は、均質とpの増加収率で得られ、子宮内膜細胞の増殖を誘導しますURE細胞集団。さらに、共培養システムの使用は、上皮 - 間質性クロストークの研究と異なるレベルで脱落膜化のプロセスを操作する能力を可能にします。

<table><tbody><tr><td>ThinCert Tissue culture insert for 24 well plates; 1 & micro;m孔径;transparant</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662610</td>インサート<td>は、他のマルチウェルプレートや他の細孔サイズにも対応しています。その他のサプライヤー: Merck Millipore. https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/ 0110_0110_0090_0030/13408/&nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc細胞培養処理済み24ウェルプレート</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475</td></tr><tr><td>8-ブロモアデノシン 3&prime;,5&prime;-環状一リン酸ナトリウム塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B7880</td><td>Milli Q水に100 mMのストック溶液を調製します。アリコートは -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en&region=BE&nbsp; で保存してください。</td></tr><tr><td>メドロキシプロゲステロン17-アセテート</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>M1629</td><td>250 & microのストック溶液を準備します。エタノール中のM。アリコートは-20°C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en&region=BE&nbsp; で保存</td></tr>してください<tr><td>アラチスオイル</td><td>スーパーマーケット</td><td></td><td>すべてのスーパーマーケットで見つけることができる標準的な調理用アラキスオイルは、</td></tr><tr><td>PrestoBlue細胞生存率試薬</td><td>Thermo Scientific</td><td>A13261</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1</td></tr><tr><td>HBSS 1x、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドなし</td><td>Gibco</td><td>14175-046</td><td>を使用していますできるだけ冷蔵庫に保管してください。プロトコル中はコールドHBSS+を使用してください. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046&nbsp; </td></tr><tr><td>17-&ベータ;エストラジオール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>E8875</td>アラ<td>キスオイル(1:1,000)で希釈する前に、EtOHで1 mg / mLのストック溶液を準備します。. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en&amp;region=BE</td></tr><tr><td>Cell medium filter Stericup, 0.22 &micro;m、ポリエーテルスルホン、500 mL、放射線滅菌済み</td><td>メルクミリポア</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE ペニシリン-ストレプトマイシン(5,000 U / mL)</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063</td></tr><tr><td>DMEM / F12、フェノールレッド、L-グルタミン、HEPES</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、認定、熱不活性化、EU承認、南米原産地</td><td>Gibco</td><td>10500-056</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン (50 mg/mL)</td><td>Gibco</td><td>15750-037</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037 DMEM, 低グルコース, ピルビン酸, グルタミン, フェノールレッド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5921</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>MCDB-105</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6395</td><td>Milli Q水で希釈し、NaOHでpHを7に調整し、ろ過してから使用してください。暗闇に保管. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en&region=BE&nbsp; </td></tr><tr><td>ウシ膵臓からのインスリン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1882</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>カバースリップ、ガラス、18 mm &Oslash;</td><td>GlaswarenfabrikカールHecht</td><td>1001/18</td><td>http://www.hecht-assistant.de/187/?L=1&tx_rmproducts_pi1[g]=937 &tx_rmproducts_pi1[p]=3504 &tx_rmproducts_pi1[v]=20088 &cHash=abd12065683fe74b00eaa 5e562824d06</td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2636</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2674</td><td></td></tr><tr><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en&region=BE DPBS、カルシウム、マグネシウムなし</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094 牛膵臓からのトリプシン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7409</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.05%)、フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>使用前に室温まで温めてください. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054&nbsp; </td></tr><tr><td>セルストレーナー、40 & マイクロ;mメッシュ、使い捨て</td><td>BDファルコン</td><td>352340</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680</td></tr><tr><td>セルストレーナー、100&マイクロ;mメッシュ、使い捨て</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680</td></tr><tr><td>Millex-GPシリンジフィルターユニット、0.22&nbsp;&マイクロ;m、ポリエーテルスルホン、33&nbsp;mm、ガンマ滅菌メル</td><td>クミリポア</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1 酢酸(氷)100%</td><td>メルクミリポア</td><td>1.00063</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063</td></tr><tr><td>コラーゲンI</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>354236</td><td>ラットテールから. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=&amp; productid=354236%28 Lifesciences%29#&nbsp; </td></tr><tr><td>ブタ由来の膵臓からのパンクレアチン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3292</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>35 mm 組織培養皿、ポリスチレン、滅菌</td><td>BD Falcon</td><td>353001</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630</td></tr><tr><td>エタノール アブソリュート AnalaR NORMAPUR ACS、Reag. Ph. Eur. 分析試薬</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821296</td><td>https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP</td></tr> モノ<tr><td>クローナルウサギ抗ヒトビメンチン(D21H3)&nbsp;</td><td>Cell Signalling Tech</td><td>#5741</td><td>1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741 を使用</td></tr><tr><td>モノクローナルマウス抗ヒトパンサイトケラチン&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>C2562</td><td>使用 1/1,000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en&amp;region=</td></tr><tr><td>BEパラホルムアルデヒド溶液、PBS</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td>http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>に4%http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en&region=BE&gclid= Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIw BEiQAI8rq 879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f 8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k 8P8HAQ</td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>Σ Aldrich</td><td>G9023</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ Alexa Fluor 488</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>A-11034</td><td>http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488&amp; resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& searchMode=keyword& productTypeSelect=抗体& targetTypeSelect =antibody_secondary& species=ltechall&keyword= 488#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Oryctolagus%20cuniculus\%22$;;コンジュゲート:^\%22Alexa%20Fluor&登録;%20488\%22$;;</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス アレクサフロー 594</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>A-11032</td><td>http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594&amp; resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& priorSearchTerms=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect= antibody_secondary& species=ltechall& keyword=594#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Mus%20musculus\%22$;;</td></tr><tr>DAPI <td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html</td>DPBSとカルシウムおよびマグネシウムGibco 14040174 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133 を含む<td>VECTASHIELD封入剤</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウス子宮内膜上皮と間質細胞の単離のために<em&gt;インビトロ</em&gt;脱落膜化

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

脱落膜化は、子宮内膜間質細胞のプロゲステロン依存分化のプロセスであり、成功した胚移植のための前提条件です。多くの努力が脱落膜化の基礎となるメカニズムを明らかにするために行われてきたが、胚に接触している上皮細胞とその下にある間質細胞との間の正確なシグナリングは、十分に理解残ります。したがって、脱落膜の分子の詳細については、私たちの知識を向上させることができ、アカウントに上皮および間質細胞の両方を取る方法で脱落膜化を研究。この目的のために、人工的な脱落膜化のインビボモデルは、生理学的に最も関連しています。しかしながら、細胞間コミュニケーションの操作が制限されます。現在、子宮内膜間質細胞のインビトロ培養物を、いくつかのシグナル伝達分子によって脱落膜化の調節を調査するために使用されています。従来、ヒトまたはマウスの子宮内膜間質細胞であります中古。しかし、ヒトサンプルの利用可能性は非常に頻繁に限られています。さらに、マウスの組織の使用は、培養方法における様々な伴います。この研究は、純粋な子宮内膜上皮細胞（EEC）と3日間連続してエストロゲンで処置した大人無傷のマウスを使用して、間質細胞（ESC）の文化を取得するために検証され、標準化された方法を提供します。プロトコルは、細胞の収量、生存性、および純度を改善するために最適化され、さらにEECとESCの共培養中に脱落膜化を研究するために拡張されました。このモデルは、脱落膜の両方の細胞型の重要性を利用すると間の通信中にEECまたはESCによって分泌される重要なシグナル伝達分子の寄与を評価するために適切であり得ます。

議定書の一般的な概要 図1Aは、プロトコルの一般的な概要を示しています。 3日間連続E2（100 NG）の毎日の注射は、動物を同期し、発情周期の位相を標準化するために使用されました。発情周期は、膣洗浄液によって評価することができ、発情前期、発情、発情間期、および発情後期段階に分割されています。サイクル段階は、ホルモンの変化に供される洗浄液中落屑細胞の割合に応じて指定することができます。エストロゲンのレベルを増加させると、動物が発情期に進化いたします。この相は、容易に排他的に角化上皮細胞の存在及び白血球の非存在下（ 図1B）によって検出することができます。 4日目に、発情期にある動物の子宮を回収し、MEECとMESCは（ 図1C）分離されています。脱落膜化C5日間のインキュベーション期間中、2％FBS培地に0.5mMのcAMPおよび1μMMPAを添加することによって誘導されます。 MEECとMESC文化の品質管理初代細胞培養物の純度は、ビメンチンおよびサイトケラチンの発現の差によって評価することができます。ビメンチンは、したがって、子宮内膜間質細胞は、間葉系細胞で発現される中間フィラメントです。サイトケラチンは、上皮組織の細胞骨格に見られる中間径フィラメントです。 図2Aは MEECとMESCにおけるビメンチンとサイトケラチンのmRNA発現レベルは、定量RT-PCRを用いて評価を示しています。ビメンチンのレベルはMEECにMESCが高く、低い（高い2.2倍、P &lt;0.001）、サイトケラチンレベルはMESCにMEECが高く、低いながら（36倍高く、P &lt;0.001）。ビメンチン/サイトケラチン二重染色を行い、間質細胞はEPIT一方ビメンチンを発現することが示されましたhelial細胞はサイトケラチン（ 図2B、C）を発現します 。一次抗体の非存在は、免疫染色（ 図2D、E）の陰性対照として使用しました。これらの免疫組織学的染色は、両方の子宮内膜細胞培養（MEECとMESC）は最大90％の純度を有することを示します。 MEEC / MESC共培養における脱落膜化単離後、マウスの子宮内膜間質細胞は、子宮内膜の環境を模倣するために共培養系に播種しました。上皮細胞は、細胞培養インサート（800のTEER値 - 1,000 /ウェル）で単層を形成されるまで細胞を培養し、間質細​​胞がサブコンフルエント状態に達しました。脱落膜化は、0.5mMのcAMPおよび1μMMPAのアプリケーションとの間質細胞において誘導しました。インキュベーションの5日後、プロラクチンmRNAレベルはdecidための指標として定量RT-PCRにより、間質細胞において評価しました。ualization（ 図3A）。プロラクチンレベルは非常に対照培地（P &lt;0.01）を用いてインキュベートした細胞におけるホルモンおよび検出不可能に供する細胞で発現させました。 上皮細胞は、細胞培養インサートの内部視覚化するのが困難であるため、生存率アッセイは、5日間のインキュベーション期間（ 図3B）の直後に実施しました。通常の増殖培地および生存度試薬の混合物をウェルに添加し、最小8の期間インキュベートした - 12時間。鮮やかなピンク色の青から色ずれが生存上皮細胞の存在を示しました。生存細胞が存在するときに色ずれがのみ発生することに注意してください。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig1.jpg" /> 図1：プロトコルの総括。 （A）単離プロトコールのスキームが3で始まりますエストロゲン注射の連続した日。 3日目に、必要な準備を準備する必要があります。 4日目に、発情期は、膣洗浄を行うことにより、（星で示されている）を評価します。 MESCとMEECは異なる消化の手順を用いて単離されています。細胞がコンフルエントである場合に6日目に、または、脱落膜化培地と5日間のインキュベーション期間（ - 11日目6）にcAMPおよびMPAを添加することによって、共培養系に誘導することができます。 （B）膣洗浄液中角化上皮細胞の存在を特徴と発情期の代表的な画像（倍率10×）。 （C）MESCとMEEC（倍率20倍、スケールバー：100μm）での代表的な画像。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig2.jpg" /> <stronグラム&gt;図2：MEECとMESCにビメンチンとサイトケラチンの免疫染色および定量的RT-PCR。文化の純度を示すために、（A）ビメンチンとサイトケラチンの発現のメッセンジャーRNAレベル。 RNAレベルは比較的ハウスキーピング遺伝子ACTBとTBPの幾何平均に定量化しました。データは、平均±SEMとして示されました。 MESC培養（B）とMEEC文化（C）上ビメンチン/サイトケラチン二重染色。 63X倍率図を示し、左側に挿入します。 MESC（D）とMEEC（E）のために省略した一次抗体陰性対照（スケールバー：50μm）を。 ***：P &lt;0.001双方向ANOVAを持つ複数のテストのためのボンフェローニ補正しました。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図3：RT-PCRによる脱落膜化の検証。間質細胞におけるプロラクチンの発現（A）mRNAレベルは、脱落膜化を評価します。 RNAレベルは比較的ハウスキーピング遺伝子PGK1及びTBPの幾何平均に定量化しました。制御または脱落膜培地で培養した細胞の変化倍率は平均±SEMとして示されています。 （B）（上）及び後（下部）脱落膜化刺激前間質細胞の例示的な絵。右側のインサートが脱落膜化間質細胞の倍率を示しています。脱落膜化を黒矢印で示されている多核細胞の存在によって特徴付けられます。 （C）アッセイ後のインサートにおける上皮細胞生存率の評価の代表的な画像。写真は生存性試薬の投与（Prestoblue）（0時間）とfの直後に撮影されましたollowingの朝（ON）。 **：p &lt;0.01、マンホイットニーU検定です。 ON：一晩。スケールバー：100μmです。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

本研究では、in vitro脱落膜で勉強するために共培養システムで使用することができ、一次マウス子宮内膜間質および上皮細胞の単離および培養のための標準化および検証方法を提示します。

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

本プロシージャの全体的な目的は、in vitroでの脱落膜化の研究のために、マウス一次子宮内膜の間質細胞および上皮細胞を単離・培養し、それらを共培養することです。この手法は、脱落膜化や栄養膜細胞の浸潤といった重要な過程において、上皮細胞と間質細胞の間でどのようなパラクリンシグナリングが行われているか、またそのシグナル伝達経路がどのように制御されているかなど、生殖医療分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。これらの技術を用いることで、上皮細胞と間質細胞の共培養システムにおける脱落膜化のプロセスを研究することが可能です。このシステムを用いることで、2つの細胞のうち一方から分泌されるシグナル分子が、このプロセスに影響を与えるかどうかを評価できます。子宮を採取する前に、腟刷道試験を行い、動物のサイクル相を確認してください。これにより、発情期にあるマウスのみを選択します。膣洗浄液中に角質細胞が存在することで定義されます。次に、鉗子と鋏を用いて第1発情期の動物の腹部を開き、腸管を脇に寄せて両側の子宮角を視認できるようにします。卵管の下にある子宮角の最遠位端を掴み、解剖用鉗子を用いて子宮組織を卵管から剥離させ、Dumont 5番鉗子で脂肪組織および結合組織を除去します。次に、子宮体の上方にある遠位端の角を切り離します。子宮角を切り離した後、3 mLのHBSSを入れた35 mmペトリ皿に配置します。すべての子宮角を回収したら、皿を実体顕微鏡下に移動させ、ピンセットを用いて残存している脂肪組織および結合組織を除去します。次に、Dumont 5番ピンセット、解剖用ピンセット、および小型スプリング剪刀を用いて、子宮角を縦方向に切開して管腔を露出し、新鮮なHBSSを入れた新しいペトリ皿で組織を洗浄します。その後、すべての子宮角をパンクレアチンとトリプシンを含む15 milliliterチューブに移します。そして、組織を水平に配置し、オービタルシェーカーを用いて4 degrees celsius、50 rpmで60分間インキュベートします。1時間後、チューブをベンチ上に移し、振盪せずに45分間水平状態でインキュベートし、続いて37 °Cの恒温水槽で振盪せずに15分間水平状態でインキュベートします。水槽でのインキュベーション終了後、上清を注意深くデカンテーションし、子宮を冷やしたマウス子宮内膜上皮細胞培地を含むペトリ皿に移して5分間静置し、トリプシンの活性を失活させます。次に、組織を3 mLの冷えたHBSSを含む15 mLチューブに移し、10秒間ボルテックスして上皮シートを剥離させます。次に、3 mLの新鮮なHBSSを入れた新しいペトリ皿で子宮を洗浄し、先ほど示した方法でさらに2回、上皮シート懸濁液を2本の新しい15 mLチューブに回収します。3回目の組織ボルテックス後、子宮をマウス子宮内膜基質細胞消化液を含む15 mLコニカルチューブに移し、37 °C、200 rpmで30分間インキュベートします。3つの細胞懸濁液を100 µmナイロンメッシュで静かにピペッティングして組織片を除去し、得られた細胞懸濁液を遠心分離して上皮シートを回収します。ペレットを12 mLのマウス子宮内膜上皮細胞用培地に再懸濁し、十分に混合した後、5分間静置して、残っているマウス子宮内膜間質細胞を重力で分離させます。沈降後、5 mLピペットを用いて上清の上部2 mLを慎重に回収し、回収した細胞を遠心分離します。その後、マウス上皮細胞のペレットを、緩やかなピペッティングにより上皮細胞用培地で再懸濁します。そして、計画している後続の解析に適した密度で、コラーゲンコートしたカバースリップに細胞を播種します。上皮細胞の分離後、間質細胞の処理に進み、子宮が入ったマウス間質細胞消化チューブをインキュベーターから取り出します。30分間のインキュベーション後、先ほど示したように、チューブを手で10秒間静かに振り、子宮を3 mLの4 °C HBSSが入ったペトリ皿に移します。組織を十分に洗浄し、消化チューブにストローマ細胞培地を3 mL加えてトリプシンの活性を停止させ、その後、新鮮なマウス子宮内膜ストローマ細胞培地3 mLを含む15 mLコニカルチューブに子宮を移します。組織が入ったチューブを10秒間、穏やかに振盪します。次に、子宮を冷やしたHBSSが入ったディッシュに移し、続いて新しいストローマ細胞培地を入れた15 mLチューブに移します。組織を3回目に洗浄して移した後、新鮮なマウス子宮内膜間質細胞消化ミックスを用いて、37°Cで30分間、子宮組織をインキュベートします。消化終了後、チューブ1から3およびトリプシンチューブから細胞懸濁液を40 µmのナイロンメッシュに通し、さらに5 mLのマウス子宮内膜間質細胞培地でメッシュを洗浄します。その後、遠心分離によって細胞を回収します。ペレットを新鮮なマウス子宮内膜間質細胞培地で再懸濁し、予定しているダウンストリーム解析に適した密度で、ポリリシンコートしたカバースリップに播種します。初代細胞培養の純度は、vimentinとcytokeratinの発現量の差によって評価できます。vimentinレベルはマウス子宮内膜間質細胞で高く、マウス子宮内膜上皮細胞では低いのに対し、cytokeratinレベルはマウス子宮内膜上皮細胞で高く、マウス子宮内膜間質細胞では低いためです。mentinとサイトケラチンの二重染色は、ストローマ細胞によるmentinの発現と、上皮細胞によるサイトケラチンの独占的な発現をさらに明確に示しています。cyclic adenosine monophosphateおよびMPAの投与によるストローマ細胞培養における脱落膜化の誘導により、対照のストローマ細胞培養と比較して、5日間の処理後にプロラクチンmRNAレベルが劇的に上昇することが明らかになりました。細胞培養インサート内の上皮細胞は可視化が困難であるため、5日間の脱落膜化シミュレーションの直後に生存率アッセイを実施することができ、色が青から鮮やかなピンクに変化することで生存している上皮細胞の存在が示されます。この手法に続いて、胚盤胞の存在下で上皮細胞から分泌される因子がストローマ細胞の脱落膜化を誘導できるかどうかを評価するために、胚盤胞付着アッセイなどの他の手法を実施することができます。

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Research

JoVE Journal

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学ぶマウス子宮内膜上皮細胞と間質細胞の単離培養法。インビトロ脱落膜化の研究に用いる共培養システムを確立し、細胞間パラクリンシグナリングを解析する。生殖医学の基礎研究に応用可能です。

マウス子宮内膜上皮と間質細胞の単離のために

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