ヘアレスマウスの耳たぶにおける生体顕微鏡および血栓誘導

本実験の全体的な目的は、生体内（in vivo）における微小血管血栓形成に対する潜在的な血管活性薬の影響を研究することです。この手法は、敗血症や組織移植における主要な合併症の一つである微小血管血栓の形成を防止し得る新たな抗血栓物質の同定など、血栓形成に関する重要な課題の解決に寄与します。本手法の主な利点は、無毛マウスの耳モデルを用いることで、調査対象となる微小血管床への事前の外科的手術を必要とせずに、生体蛍光顕微鏡観察および光毒性による血栓誘発が可能である点にあります。

まずマウスを計量し、体重を記録します。次に、適切な量の試験物質をインスリン注射器に充填します。血栓誘導の30分前に薬剤を投与してください。

血栓誘発の15分前にマウスを麻酔し、麻酔が効き始めるまでケージに戻します。十分な麻酔状態であることを確認するため、ピンセットで尾をつまみ、反応がないことを確認します。次に、解凍した50 Dextran 0.05 mlをインスリン用注射器に採取します。

シリンジに充填した後、気泡が残っていないことを確認してください。静脈内に投与されたわずかな気泡であっても、動物にとって致命的となる可能性があります。麻酔をかけたマウスを、加熱プレート一体型のacroglassパッドの上に腹臥位で置きます。加熱プレートを37 °Cに調整してください。

マウスの眼角膜に眼用軟膏を塗布します。次に、右耳の頭側端と尾側端にポリプロピレン 7.0 の縫合糸で2箇所縫合します。縫合糸は、できるだけ端に近く、かつ付け根に近い位置に配置してください。

マウスを背側向に移動させます。すべての肢を粘着テープを用いてプラットフォームに固定します。前歯の下に縫合糸をかけ、その縫合糸を粘着テープでプラットフォームに固定することで、頭部を背屈させます。

動物を実体顕微鏡下のプラットフォームに置きます。10倍の倍率を使用してください。右耳を顕微鏡観察する場合、まず頸部の皮膚を頭尾方向に5 mm切開し、左頸静脈を準備します。

次に、マイクロフォーセップスとマイクロシザースを使用して皮下組織を剥離します。その後、血管に触れないように注意しながら、外膜から静脈を遊離させます。ここで、あらかじめ準備しておいたインスリン用注射器を用いて、蛍光色素を注入します。

静脈を穿孔しないように、マイクロフォーセプスで血管壁を慎重に把持します。膨張した血管壁にシリンジ針を刺入し、50 Dextranを静脈内に注入します。針を抜き、綿棒を用いて止血します。

耳への血液や染料の混入を避けてください。動物をヒートプレート上の、ヒートプレート用のスリットと耳を配置するための高さ0.5 cmの平面を備えたアクログラス製構造体に移動させます。粘着テープを用いて、動物をヒートプレート上で腹臥位に固定します。

耳の平面的なパーツを平面上に平らに配置できるよう、耳の基部にある凸状の軟骨を平面の横に置きます。アクログラスプレートに室温の精製水を1滴加えます。綿棒を用いて精製水の滴を吸収させ、毛細管現象によって耳の平面パーツをアクログラスに接着させます。

耳介には軟骨があるため凸状になりますが、できるだけ平らに配置する必要があります。そのため、耳介の中でもより柔軟な遠位部のみをアクリルガラスプレート上に配置してください。組織の損傷や、液体および染料の血管外漏出を防ぐため、ピンセットで耳に触れる回数は最小限に留めてください。

次に、耳の凸状の背側にアクアを1滴滴下します。耳に進入する基底血管を圧迫しないように注意しながら、カバーガラスを1枚、耳の上に載せます。綿棒を使用して、カバーガラスの下からできるだけ多くのアクアを取り除き、カバーガラスと標的とする耳の血管との距離を最小限にします。

まず、50 Dextranを可視化するために生体蛍光顕微鏡を調整します。準備した動物を生体蛍光顕微鏡のステージに移動させます。5倍、10倍、20倍の倍率および20%の光強度を用いて、直径50〜60 µmで順行性の血流を持つ静脈を探します。

63倍の浸液式対物レンズを使用するため、カバーガラスに室温の水を1滴滴下します。水を滴下した後、直ちに血管の記録を20秒間行い、直径と血流のベースライン評価を行います。50 Dextranの注入から5分後に、血栓誘発を開始します。

この目的のために、光強度を100%まで上げます。光毒性血栓誘導の間、血流の閉塞を確認するため、30秒の期間内に顕微鏡の絞りを2秒間閉じます。血流が持続している場合は、再び絞りを開きます。血流が30秒以上停止したか、あるいは血流が逆流している場合に、血管は閉塞したと判定されます。

50 Dextranの注入後1時間以内に、耳あたり5本の血管を選択して閉塞させる。本実験では、血栓誘導前の50 Dextran注入前に、動物に溶媒またはカンナビノイド（anandamide、WIN 155, 212-2、またはcannabidiol）を投与した。溶媒コントロールと比較して、1回の投与により、CBDではなくanandamideおよびWIN 155, 212-2が血栓の成長を有意に促進した。

別の設定では、アナンダミドをインドメタシンと併用し、シクロオキシゲナーゼ依存性産物がアナンダミドを介した血栓形成に及ぼす影響を評価しました。インドメタシンを併用投与したところ、アナンダミドの血栓形成促進作用が消失しました。したがって、アナンダミドへの急性曝露は、in vivoにおいてシクロオキシゲナーゼ依存的な血栓形成促進作用を誘発します。

習得すれば、準備を含めて90分で狭い血管内への血栓誘導を行うことができます。この手順を実施する際は、液体や染色の漏出を防ぐため、耳介に触れるたびに非常に慎重に取り扱うことが重要です。この手法は血栓形成の知見を得るために有効であるだけでなく、創傷治癒、皮弁壊死、血管新生などの他のシステムにも応用可能です。

このビデオを視聴することで、生体内光毒性血栓誘導を行うために必要な、静脈内蛍光色素の投与、耳介の位置、および特定の血管への照射について深く理解することができます。