のシナプス変調を分析キイロショウジョウバエ長時間の光照射後の感光体

この実験手順の全体的な目標は、異なる活性化条件下での単一のニューロンのシナプスダイナミクスを理解することです。この方法は、ニューロンの活動の成熟に伴うシナプスの分子組成の変化を明らかにするなど、シナプス可塑性分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、シナプスの数、分布、シナプス後の分子成分の濃縮レベルなど、シナプスの複数の側面を半自動で分析できることです。

この実験では、溶出後6時間以内にハエを正常なバイアルに集めます。コレクションバイアルを透明なアクリルラックに入れます。摂氏25度に設定された小さなインキュベーターで、光の露出が平均1000ルクスのLEDパネルから正確な距離にラックを配置します。

次に、一定の暗闇、12 時間の光と 12 時間の暗闇、または一定の光のいずれかの条件を使用して 1 〜 3 日間後方飛行します。その後、標準的な技術を使用して脳を解剖し、染色します。ハエの脳をマウントするには、マイクロピペットに封入剤をロードし、顕微鏡スライドの中央に約2cm間隔で2マイクロリットルの滴を2滴堆積させます。

各液滴と約0.2mmの間の隙間にカバースリップを置きます。次に、15マイクロリットルの封入剤をカバーの上に堆積させ、その隙間に堆積させます。解剖顕微鏡下で、マイクロピペットの隙間に脳を沈着させます。

そして、脳を腹側を上にして配置します。最後に、カバースリップを取り付け、透明なマニキュアを使用して端に沿って密封します。その後、標準的な技術を使用して脳を画像化し、3D画像を再構成できます。

この場合、スター法を用いて、活性なBrp発現を有する細胞においてGFP発光が実証されます。また、この例では、R7およびR8の視細胞軸索をanticiaoptinで免疫化し、RFPタグ付き二次抗体を用いて観察しました。Brp GFP点状の最初の負荷の数、分布、および非局在化レベルを定量化するために、画像スタックから作成された脳の3D画像を再構成しました。

BRPのプンクタは白で表示されます。次に、関心のある領域を見つけます。この場合、R8軸索の末端は、M3髄質層への入口点でアンチアオプチン正軸索が薄くなるのをたどることによって位置付けられます。

各R8軸索末端で、スポット検出モジュールを使用してBrp GFP点を同定します。[新しいスポットを追加] を選択し、アルゴリズム設定で関心のある領域のみをセグメント化します。解析領域を定義したら、ソースチャンネルをBrp GFPに設定し、推定XY直径を0.35ミクロンに設定します。

次に、スポット検出でバックグラウンド減算をオンにします。次に、フィルターの種類として品質を選択すると、句読点が自動的にフィルタリングされます。「完了」をクリックして、このステップを完了します。

データセット内のすべてのR8軸索に対してスポット検出方法を繰り返します。次に特定する領域は軸索細胞質です。まず、surface関数を使用してサーフェスオブジェクトを生成します。

次に、新しいサーフェスの追加を選択し、アルゴリズム設定の下で、関心領域のみをセグメント化します。次に、関心のある領域を手動で選択します。次に、計算範囲を設定します。

視細胞チャネルをソースとして見つけるには、スムーズオプションを選択します。しきい値には、絶対強度を選択します。[接触するオブジェクトの分割]オプションを有効にします。

シート ポイントの直径を 0.5 ミクロンに設定し、ボクセルの品質と数に既定のフィルタ設定を使用します。その後、フィルターが自動的に適用されます。次に、関心領域の外側に生成されたサーフェスのピースを編集して削除します。

この場合、他の軸索。データセット内のすべてのR8軸索に対して軸索領域検出を繰り返した後、すべてのBrp点軸索とR8軸索がスポットオブジェクトのセットとして識別されます。そして、対応する細胞質領域は表面物体として識別されます。

次に、各軸索の向きと空間を手動で定義します。これは、髄質ニューロピルの各ニューロンに沿ったBrp GFP密度を後で定量化するために重要です。これを行うには、まず開始点と終了点を定義します。

[新しい測定点の追加] を選択し、[編集] を選択してから [オブジェクトの表面を選択] を選択し、サーフェス オブジェクトの上部を操作します。始点を定義するには、M1層内のR軸索のすべての表面オブジェクトに測定点を置きます。これらのポイントを体系的に再現可能な順序で配置します。

次に、終点を定義します。[新しい測定点の追加]を選択し、編集して、オブジェクトのサーフェスを再度選択します。次に、同じ系統的な順序を繰り返して、M3層のR軸索の底に測定点を配置します。

Brpバックグラウンド強度を定量化するには、2つのR7軸索の細胞質領域を分析します。add new surfacesを選択し、R8軸索の場合と同様にR7軸索の領域を手動で定義します。[タッチするオブジェクトの分割を有効にする]オプションをオンに切り替えないことを除いて、同じ設定を使用します。

これはオフのままにします。次に、定義されたR7軸索領域内にダミースポットオブジェクトを追加します。[新しいスポットを追加] を選択し、[自動作成をスキップして手動で編集する] を選択します。

次に、オブジェクトの中心を選択し、表面オブジェクトをクリックして、ダミースポットオブジェクトをR7軸索内に配置します。次に、2番目のR7軸索について、表面検出とスポット検出の手順を繰り返します。次に、R8軸索の場合と同様に、R7軸索の開始点と終了点を定義します。

この分析では、正しいソフトウェアがインストールされていることを確認してください。スポット データ、サーフェス データ、および 2 つの測定ポイント オブジェクト (それぞれに同じ数の測定ポイントを含む) を含むデータセットを開きます。データを検査します。

計算を機能させるには、両方の測定点オブジェクトに同じ数の計測点が必要です。スポット、軸索領域、開始点と終了点を定義したら、プラグインを起動します。まず、メタデータ、特にボクセルサイズを確認します。

編集から画像プロパティを開き、ジオメトリの座標の下にあるボクセルとミクロンの3次元を確認します。次に、強度解析のチャンネルを選択します。この場合、Brp GFPを示すチャネルが選択されます。

次に、結果のファイル名を定義します。次に、ビンの数を10として定義し、軸索の長さを100%に設定します次に、スポット半径を0.35ミクロンに、周囲の細胞質領域を50ミクロンに設定して、点の領域を定義します。最後に、synapse 検出コマンドを実行し、後で出力を統計的に分析します。

記載されたプロトコルに従って、Brp GFP点状を、一定の暗闇、一定の光、または通常の光/暗サイクルに曝露されたハエのR8シナプスで分析した。一定の光に照らされたハエのR8光受容体では、Brp puncta の数が有意に減少しました。プンクタの分布は、カスタムプラグインを使用して計算されました。

R8シナプスは、M1層からM3層までの軸索軸に沿って全体に分布していましたが、M1層とM3層では密度が高かった。同様に、punctaの非局在化レベルが計算されました。それらはすべての条件で変化しなかったが、Brp GFPの非局在化レベルは、一定の光の下で明らかに解消されるBrp-short-cherryのように、他のレポーターとは異なっていた。

AZから分解した後、Brpショートフラグメントの不適切な処理が存在する可能性があります。このビデオを見れば、1つのニューロンのシナプス可塑性特性を解析する方法を十分に理解できるはずです。このような可塑性には、シナプス数、それらの分布、およびシナプス後の特定の分子成分の濃縮の標識が含まれます。