免疫調節薬を同定するためのTリンパ球におけるマイトジェン誘導性の幼若の迅速定量

この手順の全体的な目標は、Tリンパ球の芽球形成または芽球形質転換を測定することにより、自動セルカウンターを使用して免疫調節薬の効力を評価することです。このアッセイは、細胞径を測定するために装備された自動セルカウンターを使用して、Tリンパ球の活性化を定量するための迅速な方法を提供します。この技術の主な利点は、一般的なTリンパ球増殖アッセイとは異なり、単一細胞からの迅速かつ簡単で直接的な測定を可能にすることです。

リンパ球を免疫調節薬で治療すると、細胞芽球形成の速度と程度が増加または減少します。セルカウンターアッセイを使用すると、この胞子生成の程度をサンプルあたり約4分で測定できます。犠牲から10分以内に、マウスの腹部に70%のエタノールをスプレーし、はさみを使用して動物の左側の毛皮と皮膚を切開します。

皮膚を離して後ろに保持すると、腹膜が現れます。次に、切開部位に4%のクロルヘキシジンを塗布します。はさみと鉗子の2番目のセットを使用して、腹膜を開くために中央腹部に沿って2〜3センチメートルの切り込みを入れます。

次に、脾臓を囲む内臓の付着物と余分な脂肪を取り除き、組織をDPBSの容器に移します。次に、10ミリリットルのRPMI 1640培地を10cmの培養皿に加え、滅菌した2枚のすりガラススライド板の間で脾臓を粉砕します。無菌の40ミクロンナイロン細胞ストレーナーで組織スラリーをろ過し、新しい10cm培養皿に入れて結合組織と破片を取り除き、単一細胞懸濁液を50ミリリットルの円錐管に移して遠心分離します。

ペレットを20ミリリットルの赤血球溶解緩衝液に再懸濁します。室温で10分間静かに揺さぶった後、別の遠心分離で細胞を回収し、ペレットを10ミリリットルの新鮮な培地に再懸濁します。次に、細胞を再度遠心分離し、摂氏37度の完全な培地2ミリリットルで再懸濁します。

T細胞を精製するには、まず脾臓あたり1〜2本のナイロンウールカラムを5ミリリットルの完全RPMIで2回洗浄し、カラムを摂氏37度および5%二酸化炭素の細胞培養インキュベーターに1時間置きます。インキュベーションの終わりに、単離された脾細胞懸濁液の2ミリリットルを各カラムの上部にロードし、液体がウールの上部に到達するまで細胞をカラムに通過させます。次に、2ミリリットルの新鮮な37°Cの完全培地を柱の上部に加え、柱の上部にある液体がウールの上部に到達するまで、培地がナイロンウールを通過するようにします。

次に、37°Cの完全な培地の3ミリリットルでウールを覆い、カラムを細胞培養インキュベーターに戻し、すべてのB細胞、線維芽細胞、および付属細胞にウール繊維に付着させます。1時間後、新しい50ミリリットルのコニカルチューブで、5ミリリットルの新鮮な完全培地でカラムを2回洗浄し、非接着性T細胞を溶出します。次に、遠心分離によって細胞を回収します。

T細胞を10ミリリットルの完全培地で1回洗浄した後、ペレットを2ミリリットルの新鮮な完全培地に再懸濁します。次に、細胞をカウントし、懸濁液を新鮮な完全培地で1ミリリットルあたり10倍から6細胞に希釈して、実験的に適切な6ウェルまたは24ウェルの細胞培養プレートに播種します。単離後24時間以内に、ナイロンウールカラムで単離したT細胞を適切な刺激と目的の実験薬で活性化します。

12〜72時間後、1ミリリットルのピペットを使用して、活性化された処理済み細胞を穏やかに混合し、塊を取り除きます。自動セルカウンターでセル径を測定するには、各ウェルから処理したセルの1ミリリットルを個々のサンプルカップに移し、サンプルカップを自動セルカウンターのサンプルカルーセルに置きます。サンプル ID とセル・タイプ情報を入力してサンプルをログに記録し、サンプルの実行を開始します。

トリパンブルーを細胞懸濁液と混合した後、各サンプルから約100枚の細胞画像が収集されるまで、細胞をイメージングフィールド上を通過します。ソフトウェアは、検出されたトリパンブルー染色細胞と未染色細胞のそれぞれの周りに円を描き、細胞径を決定します。すべてのセルが測定されると、データはスプレッドシートにエクスポートされ、測定された各直径の合計セル数と生存細胞数として結果が表示されます。

その後、データをヒストグラムとして表示できます。PMAとイオノマイシンによる2日間の刺激後、周波数分布の中央値がより大きな細胞径に大きくシフトし、それに応じて直径の小さいT細胞の数が減少することが観察されました。固定濃度が250ナノモルのイオノマイシン濃度では、活性化刺激の濃度をミリリットルあたり2〜250ナノグラムに上昇しても、PMA効果は大きく変化しません。

また、観察されたT細胞の増殖にも顕著な違いはありません。カルシニューリン阻害薬は、T細胞の芽球形成と増殖の両方を部分的に抑制します。活性化T細胞のカルシニューリン核因子を標的とする免疫抑制化合物によるT細胞処理は、胚盤葉反応を約72%抑制します。

ラパマイシンとFTY720は、芽球形成に対して中等度ですが統計的に有意な効果を示します。一方、TRAM34は、700ナノモル濃度でもマウスT細胞の増殖に影響を与えないようです。ラパマイシンとシクロスポリンAを一緒に使用すると、胞子形成が完全に阻害されます。

同様の結果は、抗CD3および抗CD28標識磁気ビーズで活性化されたマウスT細胞でも観察されます。このアッセイは、さまざまな免疫調節薬の効果をうまく定量化するために使用できるため、アポトーシス細胞や壊死細胞からの寄与も含む一般的な増殖アッセイと比較して、薬物の効力をより適切に評価できます。この方法では、最大15個のサンプルをインおよびアウトで測定できるため、芽球発生速度と増殖速度の両方を同時に、およびその後の定量化が可能です。

時折、気泡がフローセルに入り込み、測定が使用できなくなる可能性があるため、各試行のデータを分析に受け入れる前に、すべての画像に気泡がないか調べる必要があります。この手順の1つの制限は、サンプルにデブリが多すぎる場合、測定でデブリが生細胞として扱われる可能性があることです。適切な変更を加えれば、このアッセイは好中球および肝細胞の細胞サイズ変化の研究に適合させる可能性があります。