Name: 免疫調節薬を同定するためのTリンパ球におけるマイトジェン誘導性の幼若の迅速定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 学ぶ Tリンパ球の幼若化を自動細胞計数器で迅速定量する手法。マウス脾細胞からT細胞を精製し、免疫調節薬の効力を評価できます。従来の増殖アッセイより正確な薬剤効果測定が可能です。

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プレートリーダーの使用に対してLucile Wrenshall氏、有益な議論に対してNancy Bigley氏、そしてICRマウスの贈り物に対してTom Brown氏に感謝します。この研究は、国立アレルギー感染症研究所からの助成金1R01AI114804とWSUファカルティディベロップメントファンド(J.A.K.へ)によって資金提供されました。J.N.G.は、国立総合医科学研究所の助成金R25GM090122によって部分的に支援されました。

すべての実験はライト州立大学研究室動物実験委員会及び治験審査委員会によって承認されたプロトコルに従って実施されています。 注：ヒトPBMCを、Ficoll密度勾配遠心分離法5によって分離されています。 1.脾臓収穫<ol><li> ハウス大人の種に固有の食料、水、および寝具の要件に標準的な実験室条件の女性ICRマウス。 注：動物は安楽死の時点で2.9ヶ月の平均年齢および30.4グラムの平均重量を有していました。 </li><li>アイソレーション（DOI）の日に、個別に存在する他の同種の動物せずに動物を安楽死させます。マウスに最小限のストレスを確保するためにあらゆる努力を行います。死を確実にするために、二頸椎脱臼でCO 2を使用して安楽死させます。 <ol><li> CO 2室と駅に、まだ転送ケージの内側に、動物を置きます5L /分のガス流量を室温。この流量は、毎分推奨10~30％の酸素を置換します。 </li><li>動物が意識不明になった後、15L /分にCO 2流量を増加させます。呼吸停止のために動物を確認し、さらに2分間チャンバー内に残します。 </li><li>死を確実にするために伸延力で頸椎脱臼を適用します。 </li></ol></li><li> 死の10分以内に、無菌技術を用いて動物から脾臓を収穫。 <ol><li>使用するオーブン前にオートクレーブ中で脾臓の除去のためにハサミやピンセットの2セットを滅菌します。 70％エタノールを適用することによって、切開面を滅菌します。 </li><li>マウスの腹部に70％エタノールを適用します。はさみや鉗子の1セットを使用して、腹部の左側から毛や皮膚にカットを行い、その後引き離すと腹膜を明らかにするために皮膚をバック剥離。暴露されると、腹膜を開く前に、4％クロルヘキシジン溶液を適用します。 </li><li> SCIの第2のセットを使用してssorsと鉗子、中央の腹部に沿って2〜3 cmのカットを行います。腹膜を開き、内臓添付ファイルや余分な脂肪を切り欠いて脾臓を除去します。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で脾臓を置きます。 </li></ol></li></ol>生脾細胞の調製注：無菌技術を用いて、層流生物学的安全キャビネットの下にあるすべての手順を実行します。 <ol><li> 表面の赤血球を溶解するために10cmの培養皿に5分間、脱イオン滅菌H 2 O 10ml中に回収した脾臓を浸します。 注：脾臓が単離中に破損した場合は、この工程を省略することができます。 </li><li>脾細胞を解放するには、新鮮な10cmの培養皿上で2滅菌ガラススライド（脾臓に面したつや消し側）との間に脾臓をつぶします。呼ば下に（10％ウシ胎児血清を補充したRPMI-1640 10mlを、2mMのL-グルタミン、50 IU / mlのペニシリン、及び50μg/ mlのストレプトマイシンを混ぜます）RPMI完全秒。 </li><li>結合組織および破片を除去するために、新しい10cmの培養皿に滅菌40μmのナイロン細胞ストレーナーを通して細胞をフィルタリングします。 </li><li> 溶解pHが7.4〜300ミリオスモル/ Lで155 mMのNH 4 Cl を 、10mMの炭酸水素ナトリウム、および0.1mM EDTAからなるRBC溶解緩衝液を20mlを加えることにより、残りの赤血球。 注：浸透圧は、凝固点または蒸気圧浸透圧計によって測定されます。 <ol><li> 10分間（4℃）250×gで50ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に10 cmのプレートから細胞を転送します。 </li><li>上清を除去し、RBC溶解緩衝液の20ミリリットルを追加し、ピペッティングによりペレット化した細胞を再懸濁します。 </li><li>穏やかに揺り動かしながら10分間、溶解緩衝液中で、室温でインキュベートします。 </li><li>細胞をペレット化するために250×gで（4℃）で10分間遠心分離します。溶解バッファーを捨てます。 </li><li>再び完全RPMIと遠心分離機の10ミリリットル（250×gで、10分間、4℃）中で細胞を再懸濁します。ディスク上清をARD。 </li></ol></li><li>完全RPMIを2mlに再懸濁脾細胞をナイロンウール繊維カラムへの転送のために37℃に温めました。 </li></ol> Tリンパ球の3精製<ol><li> 完全RPMI 5mlで二回ナイロンウールカラムを洗浄します。 1時間、5％CO 2細胞培養インキュベーター中で37℃でインキュベートします。 注：これは、実験期間中湿潤ナイロンウールを維持するために、完全RPMIすべてナイロンウール分離工程のために37℃に温め使用することが必須です。 </li><li> カラムに単離された脾細胞を追加し、B細胞、線維芽細胞、およびアクセサリー細胞は、ナイロンウールに付着できるようにするために、1時間インキュベートします。 <ol><li>カラムに脾細胞を含むRPMIの2ミリリットルを追加し、ナイロンウールの最上部に到達するまでに通過。 </li><li>完全RPMIの2mlをナイロンウールの上に37℃に温め、追加ウールを通して媒体を通過液面が上面に達するまで。 </li><li>完全にナイロンウールをカバーするために列に暖かい完全RPMIの3ミリリットルを追加します。 </li><li> 1時間、37℃、5％CO 2細胞培養インキュベーター中で平静充填したカラムをインキュベートします。 </li></ol></li><li> 完全RPMI 5mlで二回カラムを洗浄することにより細胞を溶出させます。遠心分離により溶出した細胞の追加の洗浄を行います。 <ol><li>完全RPMIでトップ2倍に列を記入し、カラム内の溶液を50mlの滅菌コニカルチューブに流れることを可能にします。 注：ナイロンウールに付着したB細胞、補助細胞、および線維芽細胞を取り除くことができ、列をタップするかぶつけないでください。 </li><li>細胞をペレットに10分間（4℃）を250×gでのフロースルー画分とスピンを収集します。完全RPMI 10mlで1回洗浄。 （250×gで、10分間、4℃）、再び細胞をペレット化し、完全RPMI 2mlに再懸濁します。 </li><li> Cを測定します<html>エル密度血球計数器を用いて0.5×10 6細胞/ mlに完全RPMIに希釈します。 </li><li>種子1またはそれぞれ24-または6-ウェル細胞培養プレートの各ウェルに細胞を2mlのアリコートを、培養5％CO 2で37℃で細胞。 注：1mMの1,4-ジチオスレイトール（DTT）は、T細胞の生存率を向上させるために、この段階で各ウェルに添加することができます。 </li><li>オプション：フローサイトメトリーにより単離プロトコールの効率を確認してください。このプロトコルは、通常、Tは23リンパ球〜80％が得られます。 注：ナイロンウール精製された細胞は、約50％のCD4 +および23％のCD8 +細胞を含みます。さらに、CD4 +及びCD8 +亜集団を精製するために、単一の免疫枯渇段階は、8つの抗体および磁気ビーズ24を用いて行うことができます。代替的に、より純粋なCD4 +およびCD8 + T細胞集団は、特異的抗体を用いて陽性または陰性選択によって単離することができます。 </li></ol></li></ol>_title &quot;&gt; 4。Tリンパ球の活性化と実験的薬物暴露<ol><li> PMAの添加によりカルシウム塩または抗CD3および抗CD28抗体23,25,26で被覆した磁気ビーズイオノマイシン分離の24時間内のTリンパ球を活性化します。起動時に実験的な薬物（ 例えば、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、TRAM-34、及びFTY720）を追加します。 注記：ここでは、PMAの濃度は、2〜250 ng / mlでの変化、及びイオノマイシン濃度を250 nmで維持しました。可能な場合、細胞の各ウェルに添加量が再現性を確保するために≥1μLになるように、希釈液を各薬物のストックのアリコートから調製されるべきです。 1のビーズ対細胞比の抗CD3 /抗CD28でコーティングした磁気ビーズは1で添加します。細胞あたりのビーズの数（ すなわち、ビーズ対細胞の比）を大きくすると、刺激25,26の強度を増加させます。ビーズを洗浄し、細胞へのそれらの添加前に、完全RPMI中に再懸濁させます。なお、トリパン青いビーズを染色します。 </li><li>文化自動細胞カウンターを用いて分析する前に、5％CO 2で37℃で12-72時間のための細胞。 </li></ol> 5.自動セルカウンターデータの収集<ol><li> サンプルを実行する前に、細胞を穏やか塊を回避するために、血清学的ピペットで混合されていることを確認してください。これは、その増加した接着性の活性化リンパ球のために特に重要です。 <ol><li>ピペッティングした後、抗CD3 / CD28ビーズで活性化された培養物については1.5 mlまたは2mLの遠心管に試料を移します。 1-2分間磁石上にチューブを保持することによりビーズを分離します。分析のための細胞を含む上清を使用してください。 注：培養培地中に存在血清により休止細胞のいずれかのプレ活性化を考慮して1時間以内に休止および活性化細胞の両方を分析します。 PMA /イオノマイシン刺激の12時間後、細胞サイズの小さな増加（ 図2検出可能でした</強いです&gt;）。 72時間目、48時間と比較して有意なセルサイズの増加は、（データは示さない）が観察されませんでした。 </li></ol></li><li> サンプルカップへの転送細胞懸濁液の1ミリリットルを、マニュアルの指示に従って自動セルカウンターを介して実行。 注：試験のそれぞれについて、細胞培養物1ml（2 mlで最大値）の最小値を使用すべきです。自動細胞計数は、細胞懸濁液を、トリパンブルーを混合するために注射器を使用して画像化し、ソフトウエアにより解析されたフィールド上に細胞をトリパンブルー混合物を通過させます。ソフトウェアは、トリパンブルー染色細胞を検出し、各セルの周りに円を描画し、直径を決定します。 100画像は、各サンプルから回収され、そして細胞の生存率およびサイズが決定されます。ここで使用されるセルカウンタの検出閾値は、5ミクロンの下限を有します。 </li><li>各のデータを転送して、さらなる分析のためにスプレッドシートに実行します。 </li><li> 1を使用して、定期的に装置のキャリブレーション6ミクロンと8ミクロンの直径のポリスチレンビーズmlのサンプル。 注：各バッチの製造業者によって測定された実際のビーズサイズが使用されるべきではなく、公称サイズ。これらの直径は、安静時の予想直径および活性化T細胞に近いので、6と8μmのビーズは、（ 図1を参照）便利です。 </li></ol> 6.データと統計解析<ol><li> 適切な統計やグラフソフトウェアを使用してデータを分析します。 注：（：5ミクロン〜70ミクロンの範囲）それぞれの実行のためのスプレッドシートは、各直径の細胞の数が含まれています。 17μmの直径、上記細胞は、塵埃粒子及び器具などによって生細胞を読み出すことができる小さな気泡を排除するために分析から除外されています。 </li><li>仮説は不等分散を持つデータ・セットのウェルチのt検定を使用してテストを実行します。 P &lt;0.001場合の結果は統計的に有意であると考えています。使用される式があって、 <imグラムのALT = &quot;式1&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 55212 / 55212eq1.jpg&quot; /&gt; どこ<img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq2.jpg" />そして<img alt="式3" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq3.jpg" />サンプル手段であり、 <img alt="式4" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq4.jpg" />そして<img alt="式（5）" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq5.jpg" />サンプルの分散であり、 <img alt="式6" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq6.jpg" />そして<img alt="式（7）" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq7.jpg" />各データ・セットのサンプルサイズです。自由度の数は、保存的にそれぞれの比較のために2つのサンプルサイズの小さい方を使用して推定されます。棒グラフは平均±SEMとして提示されています。 </li></ol> 7.脾臓Tリンパ球増殖アッセイ<ol><li> MTS-またはMTTに基づく比色プレートリーダー増殖アッセイを使用して、T細胞増殖を測定します。 注：このアッセイは、ベースでありますNADPHまたはNADHによって可能性がMTSテトラゾリウム化合物（オーエン試薬）可溶性ホルマザン産物への還元、上のdは脱水素酵素により代謝的に活性な細胞で産生さ。 </li><li> 血球計数器を用いて精製したT細胞をカウントし、1×10 6細胞/ mlの最終濃度で完全RPMI-1640で再懸濁します。 注：1 mMのDTT、この段階で細胞に添加することができます。 </li><li> （工程4と同様に）必要であれば、試験薬と一緒にPMAおよびイオノマイシンで細胞を活性化し、穏やかに混合します。 </li><li>プレート96ウェル細胞培養プレートを処理し、48時間、5％CO 2で37℃でインキュベートの各ウェル中の細胞100μl。バックグラウンド吸光度の読み取りを得るために、1つのウェルに細胞を含まないRPMI-1640培地100μlのを追加します。 </li><li>各ウェルにMTSベースの試薬を20μlを添加して、4時間、5％CO 2で37℃でインキュベートします。 </li><li> プレートリーダーを用いて490nmでの吸光度測定を行います。 Absorbance測定は、各ウェル中の代謝活性細胞の数に相当します。 注：必要に応じて、バックグラウンドレベルを減算します。バックグラウンド吸光度の値は、光に、培養培地、血清、外部pH、およびMTS試薬の曝露期間の種類に依存します。 MTSベースの試薬は光に敏感であり、数時間のための光への暴露は、より高いバックグラウンド吸光度の値になることがあります。 </li></ol>

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著者には競合する金銭的利益はありません。

ここでは、自動細胞カウンターを用いてT細胞幼若形質転換の迅速な検出および定量するための技術を記載します。我々の条件（250 ngの/ mlのPMAおよびイオノマイシン刺激250 nM）を下に、細胞の表面積は活性化の48時間後に2倍とボリューム3倍に増加しました。アッセイは、細胞体積は（ 図2D）を安静時と比較して、唯一の1.25倍に増加した活性化の最初の12時間、中に爆破を検出するのに十分な感度です。抗CD3および抗CD28抗体でコーティングした磁気ビーズを使用してT細胞活性化のより生理学的に関連する機構は、体積平均2.3倍の増加（活性化後72時間で、 図3D）との有意な幼若応答を生じました。ヒト単核細胞を48時間（ 図4）のためのPMAの際に体積の2.6倍の変化/刺激イオノマイシンを示しました。 ICRマウス脾臓T細胞の平均直径及び体積があると決定されましたそれぞれ6.9ミクロンと1.9×10 -4 NL、。 （1健康なドナーからの）ヒトPBMCは、7.7ミクロンと2.7×10 -4 NLの平均体積の平均直径を有していました。このプロトコルを使用して、我々はまた、T細胞を活性化する能力について、PMAの濃度を増加させる試験しました。これらの単セルの結果は、同様のPMA濃度で行わ増殖アッセイと一致していました。 細胞増殖に影響を与えることが報告され、いくつかの化合物を試験した：FTY720 31,32。免疫抑制剤のシクロスポリンA、FK506、及び27,28ラパマイシン ;そして、TRAM-34、カルシウム活性化KCa3.1チャネル33,35のブロッカー。私たちは、試験した濃度で、幼若化の最も強力な阻害剤は、CsAおよびFK506た、ことがわかりました。ラパマイシンは、幼若に小さいが統計的に有意な抑制効果を持っていました。 TRAM-34は、他の一方で、幼若化に影響を及ぼしませんでした。 シクロスポリンは、幼若およびpの両方を抑制しました自動細胞カウンター測定は、T細胞増殖における薬物の効率の良い相関であることを実証roliferationはなく、完全に（ 図2Bおよび2C）。シクロスポリンと一緒にラパマイシンの存在下では、幼若はNFAT-との組み合わせにおけるmTOR媒介経路が完全にPMA /イオノマイシン（ 図3C）との分裂促進刺激によってT細胞の拡大を考慮することができることを示唆している、完全に阻害されました。 いくつかの増殖アッセイのダイナミックレンジ（ 図2参照 ）に制限されます。そのような私たちが使用している1（ 図2C）、アポトーシスおよび壊死細胞からの寄与を含む信号を報告として増殖アッセイ、。測定は唯一の生存細胞に関する限り自動化された直径の変化の測定は、その制限はありません。細胞生存率は、健康な、生細胞からトリパンブルー染色排除によって評価されます。サイズ測定では、前方に使用してダブレットセル差別フローサイトメトリーでの光の散乱は22問題となる可能性があります。自動細胞カウンターの測定では、いかなる二重集団は（ 図1）は見られませんでした。また、測定は、100と200 nmのシクロスポリン（ 表1）及びマイトジェン刺激の12時間（ 図2D）内幼若検出するための効果を区別するのに十分に正確でした。 この新しいアッセイは、サンプル数が少ないために特に有用です。最大15サンプルを1時間で測定することができます。しかし、このアッセイを軽減することができるほとんどがその限界を有します。それが効果的にセル径の小さい（&lt;1μm）の違いを解決することができるにもかかわらず、我々が使用される機械のモデルは、5ミクロンの低い検出閾値を持っています。それが効果的に小さい直径を有するすべてのセルを除外するので、この制限は、非常に小さなセルサイズの過大評価を引き起こす可能性があります。しかし、細胞カウンタの新しいモデルは、検出THRESHを有しますこの問題を軽減する必要があります〜2μmの歳、。試料中にあまりにも多くの破片がある場合は、機器は、生細胞として扱います。また、気泡が時折フローセルに入ると、マシンによって捕捉された細胞画像の歪みを引き起こす可能性があります。歪みは、生存能力の決意に影響を与えるようには見えないが、それは、測定された直径に影響を与えることができます。したがって、各試験からのデータを分析のために受け入れられる前に、すべてのイメージが気泡のための実験によって確認することをお勧めします。ソフトウェアのみの細胞の周りに円を描くので、非球形細胞の直径は、非球形の細胞を検定はあまり適して、長軸に偏ってもよいです。 このアッセイは、数時間を必要とする増殖アッセイと比較して、サンプル当たり約4分を取って、迅速です。データ収集は、デバイスに付属のソフトウェアを使用しても、かなり単純です。ソフトウェアは、SPに測定データをエクスポートすることができます分析のためreadsheet。最後に、人口、測定とは対照的に、単一のセルです。幼若および増殖の両方が測定されます。そして、それは同時に、生存細胞と死細胞を区別します。免疫応答を開始する能力のために、様々なマウス系統を評価するために使用することができます。アッセイはまた、ヒトのドナーからのT細胞における芽球の測定（ 図4）のために首尾よく使用することができ、それは他の細胞型においても使用することができます。 細胞容積の増加は、代謝の調節に寄与することが知られている：細胞膨張は、肝細胞36,37にグルタミン誘発性グリコーゲン合成および脂質生成を刺激します。走化性エージェントが38-40膨潤 10〜15パーセントを誘導しながら、好中球は、35から60パーセントの移行に関連するボリュームの増加が表示されます。現在のアッセイは、潜在的に、これらのプロセスを研究するために使用することができます。

Tリンパ球は、哺乳動物における適応免疫を担う主要な細胞です。それらは、抗原提示細胞の表面上のMHC分子によって提示される特定の抗原性ペプチドに応答することが知られています。コグネイトT細胞受容体（TCR）の活性化の際に、細胞プロセスに大きく幼若転換、または芽球と呼ばれます。刺激が1に適用された後に、この処理は、第1〜6時間で検出可能です。幼若時には、個々のT細胞の体積が2〜4倍に2-6を高めます。リンパ球クローン性増殖と呼ばれるプロセスで増殖し始め、その目的は、可能な抗原特異的なTCRを有する細胞のような多くのクローンを生成することです。子孫細胞は、次いで、細胞傷害性（CD8 +）またはヘルパー（CD4 +）エフェクターTリンパ球に分化することによってそれらの免疫学的機能を発揮します。したがって、ヒトまたはマウスの血液中のナイーブTリンパ球は、細胞のG 0（静止）期にありますサイクルおよびサポート最小限の代謝活性。抗原またはマイトジェンに曝されると、T細胞は、転写およびタンパク質合成7-10の同時刺激と、細胞周期を再入力します。例えばホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）およびイオノマイシンのようなマイトジェンは、プロテインキナーゼC（PKC）の活性化及びCa 2+依存性シグナル伝達経路1を介してリンパ球を刺激します。 PMA /イオノマイシンでのT細胞の活性化は、TCRシグナル伝達の手順をバイパスします。 インビトロでの増殖のアッセイは広くリンパ球機能及び刺激に対する応答を評価するために使用されます。増殖の測定値は、典型的には1〜3日のT細胞刺激の開始後に採取した細胞の数百または数千の集合的な状態を反映しています。 インビトロでの種々のマイトジェンおよび免疫調節薬の効力は、単に、これらの化合物の存在下での増殖速度を測定することにより評価することができます。これらのAの一部ssaysとその限界について、以下に説明します。 直接細胞数を計数するために、手順は、オペレータエラーの高い確率で、時間がかかります。 DNA合成のために、3 H-チミジン取り込みアッセイは、DNA合成を測定し、その主な制限は、その放射性毒性です。非放射性代替法は、BrdUのであるが、細胞増殖のための線形応答の範囲は限られており、抗体治療は、手順11,12のステップの数を増加させる、必要とされます。 代謝活性のために、テトラゾリウム塩（MTT、MTS、XTT、およびWST-1）と染料系比色アッセイをレサズリンは、細胞集団を分割する一般的な代謝状態を報告します。しかしながら、MTTはこのように測定誤差を組み込んだ、追加の洗浄工程を必要とする、培養培地中に溶解しません。 XTTを効率的に低減するために追加のコンポーネントを必要とします。 MTS-、WST-1-、およびレサズリンベースの測定値が影響しています培養液のpHとそのコンポーネントの血清、アルブミンまたはフェノールレッド13-16によってエド。これらのアッセイは、生存細胞の実際の数を測定するのではなく組み合わせた酵素活性を推定しません。従って、増殖速度を正確ため、細胞数及び色素還元12,17間の非線形相関の代謝アッセイによって決定されなくてもよいです。 ATP濃度を測定するために、ATPでT細胞活性化によって誘導される増加は、増殖と相関します。しかし、細胞内ATPの上昇は、T細胞活性化の初期ステップの一つです。多くの手順の背後にある実際の増殖17,18です。 色素希釈アッセイのために、CFSE蛍光色素は、共有結合、細胞内タンパク質に結合することにより細胞を染色します。色素は、細胞分裂の数を追跡することができる蛍光強度の増殖依存的な減少を示しています。しかし、共有結合タンパク質標識のために、これらの機能タンパク質が損なわれる可能性があります。色素が高濃度で細胞に対して毒性です。より低い色素濃度では、しかし、最初の蛍光強度を追跡することができる細胞分裂の数を減少させる、減少されます。また、CFSEで標識した後、このアッセイ19,20のダイナミックレンジを制限する最初の24〜48時間の期間、中に初期蛍光の増殖に依存しない〜50％の損失があります。 これらのアッセイのほとんどは、多数の細胞の集団の状態を反映し、蛍光色素を用いた細胞の処置を必要とします。彼らは化学物質や抗体で染色することによって分析から除外されない限り、壊死およびアポトーシス細胞はまた、これらの測定値に寄与する可能性があります。 リンパ芽球は、光学顕微鏡のように、種々の方法により評価又はサイトメトリー4,21,22を流すことができます。ここでは、使用したT細胞の大きさを測定するための迅速な方法を記載しますnは保存され、後で再分析することができるリアルタイムの細胞画像を収集し、細胞計数を、自動化されました。トリパンブルー染色排除によって決定される大きさの測定に加えて、このデバイスは、正確な細胞数と生存細胞の割合を提供します。このプロトコルで使用される装置は市販されており、製造業者は、3つの異なる楽器といくつかの濃度及び生存率のコントロールを使用して、機器の精度をテストしました。これらの研究の結果は、一般的には6％未満であった変動係数を示しました。プロトコールに記載されているように、装置は、6ミクロンと8ミクロンの直径のポリスチレンビーズを用いて定期的に較正されます。セル径に基づいて、休止T細胞およびTリンパ芽球を区別するために、細胞計数器を使用する利点は、使いやすさ、および分析の自動化された性質です。ソフトウェアは、各セルの周りに円を描画し、気泡径を算出することが可能です。また、イム年齢層は細胞を同定し、正しくそれらの周りに円を描くには、機器の精度を確認することができ、オペレータに表示されます。制限の面では、器具は、 それ自体は破片と細胞を区別することはできません。従って、処理されるように、オペレータがすべての画像を見ることが重要です。分析のために使用可能なフィールドの数を減少させる気泡を組み込む可能性があります。定期的なフラッシングのメンテナンスが行われる場合は、これはまれです。 この研究では、脾臓のTリンパ球のグループは、イオノマイシンで刺激し、12〜48時間、PMAの濃度を増加させます。 2 ngの/ mlの誘導された強固な幼若化反応の両方と有意な増殖という低PMA濃度。このような免疫抑制剤のシクロスポリンA（CSA）、FK506（タクロリムス）、およびラパマイシン（シロリムス）、ならびにイオンチャネル遮断薬のTRAM-34とFTY720のようないくつかの薬剤の効果の測定（fingolimodが）、芽球の増殖に報告された効果と良好な一致を示しました。抗CD3および抗CD28抗体でコーティングした磁気ビーズとPMA /イオノマイシンおよびマウスT細胞刺激に対するヒトPBMCの幼若応答も測定しました。 セルカウンタアッセイは、これらの効果の組み合わせを見て、上記の方法とは異なり、同時に、しかし別々に幼若および増殖速度（細胞密度）の両方を定量化します。提示されたプロトコルは、分裂促進や免疫調節剤の効力を評価するための迅速かつ堅牢な技術を提供します。

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640&nbsp;</td><td>ロンザ</td><td>BW12-702F</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu;m ナイロンセルストレーナー&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>ナイロンウールファイバーカラム</td><td>Polysciences, Inc.&nbsp;</td><td>21759-1</td><td></td></tr><tr><td>50 mlコニカルチューブ&nbsp;</td><td>The Lab Depot</td><td>TLD431697</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル細胞培養処理プレート</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル細胞培養処理プレート</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>MTS ベースのアッセイ</td></tr><tr><td>Cyclosporine A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30024</td><td></td></tr><tr><td>FK506</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>104987-11-3</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3504</td><td></td></tr><tr><td>TRAM-34</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6700</td><td></td></tr><tr><td>FTY720</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0700</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads マウス T-アクチベーター CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>11456D</td><td></td></tr><tr><td>ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート (PMA)&nbsp;</td><td>アクロス・オーガニックス&nbsp;</td><td></td><td></td>356150010</tr><tr><td>イオノマイシンカルシウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>MP Biomedicals&nbsp;</td><td>ICN1670049</td><td>100倍のストック</td></tr><tr><td>ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30378.02</td><td>10xストック</td></tr><tr><td>1,4-ジチオスレイトール(DTT)&nbsp;</td><td>リサーチプロダクツインターナショナル</td><td>12/3/3483</td><td>還元剤</td></tr><tr><td>8&マイクロ;m 微小粒度標準&nbsp;</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>84192-5ML-F</td><td>アクチュアル&nbsp; 8.02 &micro;メートル</td></tr><tr><td>6&マイクロ;m 微小粒度標準&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89756-5ML-F</td><td>実測 6.084 &micro;m</td></tr><tr><td>1.5 - 2 ml チューブ用 シングル磁気分離スタンド</td><td>V&Pサイエンティフィック株式会社</td><td></td><td></td>VP772F5</tr><tr><td>細胞培養インキュベーター</td><td>Forma Scientific&nbsp;</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 ハイブリッドリーダー&nbsp;</td><td>Bio Tek</td><td>BTH1M</td><td></td></tr><tr><td>Vi-CELL 細胞生存率アナライザー&nbsp;</td><td>ベックマン・コール</td><td>ター731050</td><td></td></tr></tbody></table>

免疫調節薬を同定するためのtリンパ球におけるマイトジェン誘導性の幼若の迅速定量

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

抗原または分裂刺激に応答したリンパ球増殖は、試験免疫調節のために有用な、容易に定量化現象（ すなわち、免疫抑制または免疫賦活）化学化合物および生物学的製剤です。有糸分裂中の最も初期の段階の一つは、分割前のセル体積が増加するところ、細胞肥大または幼若変換です。これは、Tリンパ球刺激の最初の数時間で通常は検出可能です。ここでは、自動細胞カウンターを用いて、マウスの脾臓及びヒト末梢血単核細胞（PBMC）から単離したTリンパ球芽球を定量するための迅速な方法を記載します。ほとんどの部分のための様々な一般的に使用される増殖アッセイは面倒であり、唯一の集団内の全体的な人口の効果ではなく、個々の細胞効果を反映しています。対照的に、提示される自動細胞計数アッセイすることができる細胞直径の、迅速な直接、正確な測定値を提供します種々のマイトジェンおよびインビトロでの免疫調節薬の有効性を評価するために使用されます。

私たちは、PMA、ホルボールエステル、およびイオノマイシン、カルシウムイオノフォアで刺激中のリンパ球芽球化を比較するために、このアッセイを使用していました。 図1Aは、休止及び薬理学的に活性化した脾臓T細胞の直径の度数分布を示す図です。 〜2日間PMA /イオノマイシンでの細胞の処理は、（例えば、文献4等参照）より大きな直径に向かって分布の中央値に有意なシフトをもたらしました。小径を有する細胞の数はそれに応じて減少しました。私たちのデバイスは正しい直径を報告したことを確認するために、我々は6ミクロンと8ミクロンの直径（ 材料 表を参照）のポリスチレンビーズで2キャリブレーションを行いました。 6μmの規格に重畳された8μmの標準および休止T細胞が重畳された活性化T細胞からの図1Bおよび1Cショーの測定値。フィギュア1Dは、製造業者によって報告されたコントロールビーズサイズは、当社の自動細胞カウンターで測定し、メジアン径に対してプロットを示しています。 6μmのサイズが若干おそらく5ミクロンの下限を持つ機器の測定閾値に、我々の測定に過大評価されたように見えました。しかし、細胞カウンタの測定値から計算されたビーズの直径の標準偏差は、製造業者によって報告された標準偏差と一致しました。我々は、このデバイスは、休止及びマイトジェン刺激したマウスT細胞の大きさを比較するために確実に使用することができ、装置が正確に実際のセル直径を測定することができることを、これらの実験から結論付けます。 私たちは、その後、PMA濃度に対する平均直径の増加の依存性をテストするために進み、250nmの固定イオノマイシン濃度で、PMAの効果は大きく、その濃度Fを上昇させることによって変更されていない、ことがわかりましたROM 2〜250 ng / mlで（ 図2A）。 MTSベースのアッセイを用いて、50および250 ngの/ mlのPMAでのT細胞増殖を測定し、私達の細胞の直径のデータと一致して、目立った差（ 図2C）が見つかりませんでした。カルシニューリン阻害剤の薬のシクロスポリンA（300 nm）をFK506（1 nM）を芽球（ 図2B）および増殖（ 図2C）の両方を抑制しました。阻害は、しかし、いずれの場合においても完全ではなかったです。 PMA /イオノマイシン添加は50 ngの/ mlおよび250 ngの/ mlのPMA、それぞれ（ 図2D）のために、直径が7.2％と6.8％の増加を示した後に測定は12時間を行いました。 48時間の刺激（ 図2Aと比較して）の場合のように、これらの2つの濃度でのサイズが増加し、有意差はなかったです。 PMA /イオノマイシン刺激の48時間後の休止から採取した細胞の直径のデータおよび活性化T細胞に要約されています<stronグラム&gt;表1。 ICRマウス脾臓T細胞を休止期の平均表面積と容積は、それぞれ、μm2で151.4と1.9×10 -4 NLました。活性化T細胞の平均表面積と体積をそれぞれ、300.6μmの2および5.9×10 -4 NLました。すべての活性化された細胞の全体的な平均直径の増加が40.92パーセント（ 表1）でした。 CSA、FK506、ラパマイシン、FTY720、およびTRAM-34：我々はまた、免疫抑制性であることが報告されている他の化合物を試験しました。 図3では、これらの薬剤の非存在下および存在下で休止で得られたT細胞を活性化細胞サイズの測定が示されています。活性化T細胞（NFAT）27,28のカルシニューリン依存性核因子を標的CsAおよびFK506は、ほぼ72％（ 図 3Aおよび3B）によって幼若化反応を阻害し、最も強力でした。興味深いことに、とPMAの濃度を増加させ、CsAおよびFK506の効力は、これらの薬物（ 図2Aおよび図2B）の非存在下での追加の細胞の直径の増加はなかったにもかかわらず、わずかに低下しました。ラパマイシン、ラパマイシン（mTORの）29,30の哺乳類標的を阻害する免疫抑制剤は、中程度のが、統計的に有意な効果（ 図3A、3Bおよび3C）を有していました。 FTY720は、循環31へのリンパ球の放出を阻害し、最近TRPM7、高度32リンパ球T中で発現陽イオンチャネルを阻害することが見出されたスフィンゴシン1-リン酸受容体アゴニストです。 FTY720およびラパマイシンの両方は、約34％の直径で52％の増加の平均値から低減、幼若に匹敵する効果を有していた（ 図3Aおよび3B）。 TRAM-34はカルシウム活性化カリウムチャネルKCa3.1 33の遮断薬です。 700 nmでテストされ、TRAM-34は、マウスT細胞において無効であった、私最近のヒトT細胞増殖試験でのn応じ。その効力は、分裂促進刺激34（ 図3Aおよび3B）の性質と強度に依存してもよいです。 700 nmのTRAM-34は、当社のパッチクランプ電気生理学実験においてKCa3.1チャネルを遮断するのに有効であった（データは示さず）。この比較は、48時間で同じ実験内の複数の試験で休息し、薬物曝露細胞との間で行われました。ラパマイシンおよびCSAが一緒に使用された場合には、芽球が（ 図3C）完全に阻害されました。 72時間、抗CD3 /抗CD28でコーティングした磁気ビーズとマウスT細胞の活性化は、CSA（ 図3D）の存在下で5％に減少した平均粒径で27％の増加をもたらしました。 （48時間PMA /イオノマイシン活性化時にヒト単核細胞を、33％径が増加し、およびCSAの存在下での活性化は、23％の応答を減少しました<stronグラム&gt;図4）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55212/55212fig1.jpg" /> 図1： マウス脾臓T細胞径の頻度分布。 （A）ブラックの列が休息を示し、赤色の列は、PMA /イオノマイシン活性化（48時間）細胞を示します。 （B）8μmの粒子サイズ較正標準に重畳された活性化された脾臓T細胞の分布。 （C）6μmの校正標準に重畳された休止T細胞の分布。使用した細胞とビーズの数は、ボックス内に示されています。セルカウンターで測定（D）メジアン径は、製造業者によって報告されたビーズ径に対してプロット。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55212/55212fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ページ内= &quot;1&quot;&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55212/55212fig2.jpg" /> 図2：PMA 濃度でマウスT細胞活性化の依存性。 （A）T細胞を一定濃度イオノマイシン（250 nm）における未処理または2、50で処理し、250 ngの/ mlのPMAのいずれかの平均直径。 （B）300 nMのCSAのか、1 nMのFK506の非存在下および存在下で休止および活性化（2、50、250 ngの/ mlのPMA）T細胞の細胞カウンタ測定を。 50および250 ngの時（C）MTS増殖アッセイ/ mlの300 nmのシクロスポリンの非存在下および存在下で250 nMのイオノマイシンとPMA。有意差（p &lt;0.001）はアスタリスクで示されています。 nが試行の合計数です。データは、3匹のマウスから単離された細胞からのものです。安静時の（D）細胞の直径と300 nmのシクロスポリンの非存在下および存在下で活性化した後、T細胞（250 ngの/ mlのPMAおよび250 nMのイオノマイシン）12時間を活性化しました。<html> PLOAD / 55212 / 55212fig2large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55212/55212fig3.jpg" /> 図3： セルサイズ上のCsA、FK506、FTY720、ラパマイシン、およびTRAM-34の効果。薬剤の非存在下および存在下での休息の（AおよびC）の平均直径およびPMA /イオノマイシン活性化マウスT細胞。濃度は、ボックスに表示されます。 Aからの（B）のデータは、休止T細胞直径％以上の増加として表しました。リンパ球の活性化は、250 ngの/ mlのPMAおよび250 nmのイオノマイシンを用いて行い、測定値は、48時間後に採取しました。 （D）休止および抗CD3 / CD28活性化T細胞の細胞計数の測定、300ナノメートルのCsAの非存在下および存在下での活性化後72時間。rge.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55212/55212fig4.jpg" /> 図4： マイトジェン刺激の際にヒトPBMCにおける幼若。 （A）ブラックの列が休息を示し、赤の列が活性化されたPBMCを示しています。 （B）休息の平均直径および非存在下で活性化したPBMCおよび300 nmのシクロスポリンの存在。細胞を、250 ngの/ mlのPMAおよび250 nmのイオノマイシンで活性化し、測定値は活性化の48時間後に採取しました。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55212/55212fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>列1 </td><td>一休みします</td><td>活性化しました</td><td> CsAを100 nMの</td><td> CsAを200 nMの</td></tr><tr><td>平均直径</td><td> 6.94ミクロン</td><td> 9.78ミクロン</td><td> 8.19ミクロン</td><td> 7.92ミクロン</td></tr><tr><td>直径の平均増加</td><td></td><td> 40.92パーセント</td><td> 17.88パーセント</td><td> 14.09パーセント</td></tr><tr><td>平均表面積</td><td> 151.37μm² </td><td> 300.61μm² </td><td> 210.56μm² </td><td> 197.22μm² </td></tr><tr><td>表面積の平均増加</td><td></td><td> 98.59パーセント</td><td> 39.00パーセント</td><td> 30.16パーセント</td></tr></tbody></table> 表1： 平均気泡径および表面積の相対的な増加のまとめ。測定は、250 ngの/ mlのPMAおよび250 nMのイオノマイシンで活性化した後、48時間実施しました。

Tリンパ球の分裂形成は、細胞分裂前に細胞体積が拡大する胚盤形質転換を伴います。ここでは、細胞径を測定できる自動セルカウンターを用いて、Tリンパ球の芽球形成を定量化する方法について述べます。

免疫調節薬を同定するためのTリンパ球におけるマイトジェン誘導性の幼若の迅速定量

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

本手順の全体的な目的は、Tリンパ球の芽胞形成または芽胞転換を測定することにより、自動細胞計数器を用いて免疫調節薬の効力を評価することです。このアッセイは、細胞径を測定できる自動細胞計数器を用いて、Tリンパ球の活性化を定量化するための迅速な手法を提供します。この手法の主な利点は、一般的なTリンパ球増殖アッセイとは異なり、単一細胞から迅速かつ簡便に直接的な測定が可能であることです。リンパ球を免疫調節薬で処理すると、細胞のブラスト形成（芽細胞化）の速度と程度が増加または減少します。細胞カウンターアッセイを用いることで、このブラスト形成の程度を1サンプルあたり約4分で測定できます。犠牲死から10分以内に、マウスの腹部を70%エタノールでスプレーし、ハサミを使用して動物の左側の被毛と皮膚を切開します。皮膚を後方に牽引して腹膜を露出させます。次に、切開部位に4%クロルヘキシジンを塗布します。2組目のハサミとピンセットを使用して、腹部中央に2～3cmの切開を加え、腹膜を開きます。次に、脾臓周囲の内臓付着物と余分な脂肪を除去し、組織をDPBSの入った容器に移します。続いて、10 cmの培養皿に10 mLの完全RPMI 1640培地を加え、滅菌済みのすりガラススライド2枚の間で脾臓をすり潰します。組織のスラリーを滅菌済みの40 µmナイロンセルストレーナーを用いて新しい10 cm培養皿にろ過し、結合組織とデブリを除去した後、単一細胞懸濁液を50 mLコニカルチューブに移して遠心分離を行います。ペレットを20 millilitersの赤血球溶解バッファーで再懸濁します。室温で10分間緩やかにロッキングした後、再度遠心分離を行い細胞を回収し、ペレットを10 millilitersの新鮮な培地で再懸濁します。その後、細胞を再び遠心分離し、37 degree Celsiusの完全培地2 millilitersで再懸濁します。T細胞を精製するために、まず脾臓1つにつき1〜2本のナイロンウールカラムを、5 mLの完全RPMIで2回洗浄し、カラムを37 °C、5% CO₂の細胞培養インキュベーターに1時間置きます。インキュベーション後、分離した脾細胞懸濁液2 mLを各カラムの上部に負荷し、液体がウールの頂端に達するまで細胞を通過させます。次に、37 °Cに温めた新鮮な完全培地2 mLをカラム上部に追加し、カラム上部の液体がウールの頂端に達するまで、培地をナイロンウールに通過させます。次に、ウールを3 mLの37 °Cの完全培地で覆い、カラムを細胞培養インキュベーターに戻して、B細胞、線維芽細胞、および副細胞をウール繊維に接着させます。1時間後、新しい50 mLコニカルチューブを用い、5 mLの新鮮な完全培地でカラムを2回洗浄し、非接着性のT細胞を溶出させます。その後、遠心分離によって細胞を回収します。T細胞を10 mLの完全培地で1回洗浄した後、ペレットを2 mLの新鮮な完全培地で再懸濁します。次に、細胞数をカウントし、実験に応じて6ウェルまたは24ウェルの細胞培養プレートに播種するため、新鮮な完全培地を用いて細胞懸濁液を0.5 × 10⁶ cells/mLの濃度に希釈します。ナイロンウールカラムで単離したT細胞は、単離から24時間以内に、適切な刺激剤および目的の実験用薬剤を用いて活性化させてください。12〜72時間後、1 mLピペットを使用して、活性化処理した細胞を静かに混合し、凝集塊を除去します。自動細胞計数装置で細胞径を測定するためには、各ウェルから処理済み細胞を1 mLずつ個別のサンプルカップに移し、サンプルカップを自動細胞計数装置のサンプルカルーセルにセットします。サンプルIDと細胞種類の情報を入力してサンプルを登録し、測定を開始します。トリパンブルーを細胞懸濁液に混合した後、各サンプルから約100個の細胞像が収集されるまで、細胞をイメージング視野内に通過させます。ソフトウェアは、検出されたトリパンブルー染色細胞および非染色細胞の周囲に円を描き、細胞径を決定します。すべての細胞の測定が完了すると、データはスプレッドシートにエクスポートされ、測定された各直径における総細胞数および生存細胞数として結果が表示されます。その後、データをヒストグラムとして提示することができます。PMAおよびイオノマイシンで2日間刺激すると、周波数分布の中央値がより大きな細胞径の方へ有意にシフトし、それに伴い細胞径の小さいT細胞数が減少することが観察されます。イオノマイシン濃度を250 nanomolarに固定した場合、活性化刺激の濃度を2 nanograms per milliliterから250 nanograms per milliliterに上げても、PMAの効果に有意な変化は見られません。また、観察されたT細胞の増殖においても顕著な差は認められませんでした。カルシニューリン阻害薬は、T細胞の芽胞形成（ブラストジェネシス）と増殖の両方を部分的に抑制します。カルシニューリンおよび活性化T細胞核因子の標的となる免疫抑制剤でT細胞を処理すると、芽胞形成反応が約72%抑制されます。ラパマイシンとFTY720は、中程度ではあるが統計的に有意な芽胞形成への影響を示します。一方、TRAM34は700 nMの濃度においてさえ、マウスT細胞の増殖に影響を与えないと考えられます。ラパマイシンとシクロスポリンAを併用すると、芽胞形成は完全に抑制されます。anti-CD3およびanti-CD28がコンジュゲートされた磁気ビーズで活性化したマウスT細胞においても、同様の結果が観察されます。このアッセイを用いることで、さまざまな免疫調節薬の効果を正確に定量化でき、アポトーシス細胞や壊死細胞の影響を含む一般的な増殖アッセイと比較して、薬効をより適切に評価することが可能です。本手法では、最大15個のサンプルを測定できるため、ブラストジェネシス（芽細胞形成）速度と増殖速度の両方を、同時または順次定量化することができます。時折、フローセルに気泡が混入して測定値が使用できなくなることがあるため、各試行のデータを解析に用いる前に、すべての画像に気泡がないかを確認する必要がある。本手順の制限の一つとして、サンプル中にデブリが多く含まれている場合、測定時にデブリが生細胞として処理される可能性がある。適切な修正を加えることで、このアッセイは好中球や肝細胞の細胞サイズの変化を研究するために応用できる可能性がある。

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Immunology and Infection

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