マウスの破骨細胞前駆体におけるNotchシグナル伝達の刺激

この手順の全体的な目標は、破骨細胞の分化プロセス中のさまざまなポイントでノッチシグナル伝達刺激の影響を観察することです。この方法は、細胞生物学の分野における重要な疑問、例えば、細胞プロセス中にノッチシグナルの役割がどのように変化するか?この技術の主な利点は、その周辺性であり、これにより他の細胞やノッチリガンドに適応させることができます。

この方法は、破骨細胞の分化に関する洞察を提供するだけでなく、細胞の生存、増殖、または他の細胞タイプの分化などの他のプロセスにも適用できます。マウスを仰臥位に固定し、70%エタノールで皮膚を消毒することから手順を開始します。次に、片方の後肢の前面に沿って切開を行い、脛骨と大腿骨を露出させます。

続いて、膝関節を切開して大腿骨の遠位端を解放します。骨盤に近い骨の端を切開して大腿骨を切除し、付着した軟部組織をすべて取り除きます。足首を切開して脛骨を切除し、軟部組織を切除します。

次に、鉗子を使用して脚の骨を15ミリリットルの円錐管に保持し、10ミリリットルの注射器に取り付けられた25と5-8のゲージの針を骨の未切断端に挿入して、骨の切断端からチューブに室温アルファMEMの2点5ミリリットルを洗い流します。骨髄をすべて取り除くと、骨はクリアなベージュ色に変わります。各骨から骨髄を採取した後、大きな破片がチューブの底に沈殿するのを待ち、上清を含む破片のない骨髄細胞を新しい15ミリリットルのチューブに移します。

遠心分離により細胞をペレット化します。次に、赤血球をゼロポイント5ミリリットルのACK溶解バッファーで摂氏37度で3分間溶解します。インキュベーションの終わりに、10ミリリットルのPBSで等張性を回復させ、遠心分離によって細胞を回収します。

ペレットを10ミリリットルの新鮮なAlpha MEMに再懸濁してめっきします。100ミリリットルの組織培養処理皿では、プロマウス。そして、加湿した組織培養インキュベーターで細胞を摂氏37度で一晩インキュベートします。

破骨細胞前駆体を濃縮した後、細胞を5ミリリットルのPBSで洗浄し、破骨細胞前駆体が穏やかに軽くたたいて取り除くことができるまで、室温で1ミリリットルの細胞解離試薬で3〜5分間処理します。次に、4ミリリットルのAlpha MEMを皿に加え、細胞を15ミリリットルの円錐管に移します。カウント後、前駆体をAlpha MEM中の1ミリリットルあたり4番目の細胞濃度の10倍の5倍に希釈します。

そして、それらをMCSFおよびRANKLで処理し、その後すぐに24ウェル組織処理プレートの各ウェルに1ミリリットルの細胞を播種します。さらにインキュベーションし、加湿組織培養インキュベーターで摂氏37度にします。2日後、培地を1ミリリットルの新鮮な破骨細胞培地と交換して、分化を続けます。

連続的なノッチシグナル伝達シミュレーションを行うには、24ウェルプレートの1ウェルに、PBS中の250マイクロリットルのヤギ抗ヒトIGG FC抗体をコーティングします。室温で1時間後、3回の洗浄と1ミリリットルのPBSで未結合の抗体を除去します。次に、PBS中のjagged1-FC融合タンパク質をウェルに加え、室温で2時間インキュベートします。

インキュベーションの終わりに、ちょうど示したように、新鮮なPBSでウェルを3回洗います。3回目の洗浄後、PBSを取り外し、コーティングされた表面にセンチメートル単位の正方形で4番目の破骨細胞前駆体に2点6×10を直ちにプレートします。次に、プレートを組織培養インキュベーターに移し、最大3日間連続的にノッチシグナル伝達を行います。

一時的なノッチシグナル伝達刺激として、まず1マイクログラムのjagged1-FCと40マイクロリットルのプロテインGアガロースビーズを1ポイント5ミリリットルのPBSに加え、摂氏4度で回転させながら2時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの最後に、遠心分離によってビーズを回収し、続いて同じ遠心分離条件下で2回の洗浄と1ポイント5ミリリットルのPBSを採取します。2回目の洗浄後、ギザギザの結合ビーズを130マイクロリットル/センチメートルの培地に再懸濁し、ビーズの全量を2点6倍10の4番目の破骨細胞前駆体に直接加え、摂氏37度と二酸化炭素5%で冷やす培養を行います。

適切な実験刺激期間の後、PBSを数回洗浄してビーズを取り除きます。その後、標的遺伝子の転写を測定することにより、Notchシグナル伝達の活性化をアッセイできます。適切に培養すると、破骨細胞前駆体は、主に細長い紡錘形の形態を示し、滑らかな細胞質を示します。

活性化すると、前駆体は広がり、泡沫状の細胞質で平らになり、RANKシグナル伝達に対する耐性を獲得し、成熟した破骨細胞に効率的に分化しません。適切な培養および分化条件下で、濃縮された破骨細胞前駆体は、治療後3日以内に分化し、大きなTRAP陽性の多核破骨細胞に注入されます。破骨細胞前駆体をギザギザのFCコーティング表面に播種して連続的に刺激すると、24時間以内に特定のノッチ標的遺伝子の発現が上部に制御されますが、他のノッチ標的遺伝子の発現は刺激によって大きく変化しません。

わずか600ナノグラムのjagged1 FCタンパク質を含むjagged1 FCコーティングビーズを介した一時的なノッチシグナル伝達刺激も、特定のノッチ標的遺伝子の発現の有意な増加を誘導します。この手順を試みる際には、破骨細胞前駆体の分化障害の一般的な原因は、取り扱い中の偶発的な活性化によるものであることを覚えておくことが重要です。これは、TNFからInosへの特定の活性化マーカーを測定することで評価できます。

このビデオを見た後、破骨細胞前駆体を区別し、一過性および連続的にノッチシグナルを刺激する方法についてよく理解できるはずです。