2017年5月11日
この原稿は、形態学的および生化学的に馬の卵母細胞を特徴付けるための実験的アプローチを記載している。具体的には、超音波誘導卵子ピックアップ(OPU)による未成熟および成熟ウマの卵母細胞の採取方法および染色体分離、紡錘体形態、全球ヒストンアセチル化およびmRNA発現を調べる方法を具体的に説明する。
この実験的アプローチの全体的な目標は、第一に、ウマの卵母細胞を形態学的および生化学的に特徴付けること、第二に、in vitroまたはin vivoで処理された同じ動物の配偶子を比較することです。この実験的アプローチは、卵母細胞の生物学と単排卵種の生殖能力における重要な質問に答えるのに役立ちます。また、配偶子操作手順の安全性も向上させる可能性があります。
このアプローチは、特に単排卵種からの卵子のサンプル利用制限を克服するために開発されました。OPUの手順を実演するのは、リエージュ大学のステファン・ドゥルーズ教授、私の研究室の研究室マネージャーであるセシル・ドゥエ、そしてINRAセンター・ヴァル・ド・ロワールの馬ユニットのマネージャーであるファブリス・ライグナーです。日常的に、超音波を使用して成体の牝馬のコホートの卵巣卵胞の直径を評価します。
直径が 33 ミリメートルを超える大きな卵胞を探します。見つかったら、卵子の成熟を優勢な卵胞に誘導するために、1, 500単位のヒト絨毛性ゴナドトロピンを注入する準備をします。次に、頸静脈の溝を特定し、注射部位をアルコールで綿棒で拭きます。
次に、静脈を上昇させるために、注射部位の2〜3センチ下に力を加えます。針を首とほぼ平行に挿入し、針が静脈内にあることを確認するためにわずかに吸引し、ホルモンを注入します。膣アクセス用の超音波プローブを準備します。
次に、針を吸引システムに接続します。hCG注射の35時間後、OPU用の器具をセットアップし、牝馬を鎮静させます。良好な鎮痛剤は、動物とオペレーターの安全にとって非常に重要です。
痛みや不快感を感じない動物は、卵巣の操作を可能にし、穿刺やフラッシュを行いやすくなります。針プローブが挿入されると、一方のオペレーターが卵巣を操作してプローブに面し、もう一方のオペレーターが針を操作する必要があります。超音波画像で優勢な卵胞を見つけます。
次に、針を使用して膣壁と優勢な卵胞の壁を突き刺します。卵胞スペースにアクセスしたら、卵胞液を吸引します。針を回転させて卵胞壁をこすり落とし、卵丘-卵母細胞複合体を取り付けます。
次に、液体を大きなシャーレに注ぎます。そして、ステレオスコープの下で、COCを検索します。その間、ヘパリンを含む温かいダルベッコの修飾PBSで卵胞を洗い流します。
COCを収集するには、数回のフラッシュが必要になる場合があります。COCが見つかったら、針をダブルルーメン針に交換し、直径5〜25ミリメートルのすべての卵胞から未熟なCOCを収集します。これらはin vitro成熟に使用されます。
一方の卵巣からのすべての卵胞が吸引されたら、同じ手順を繰り返して、もう一方の卵巣から未熟なCOCを収集します。次に、COCから選択します。卵丘細胞のいくつかの完全層と茶色の細かく粒状にされた卵形質を持つCOCのみを保持します。
他のものは破棄します。手順の最後に、感染を防ぐために15, 000単位のベンジルペニシリンを牝馬に注射します。その後、牝馬が回復するまで少なくとも2時間、静かで清潔な厩舎に牝
馬を収容します。OPUが始まる前に、サプリメント入りのHEPES緩衝TCM-199のボトルを摂氏37度に温めます。次に、IVM培地を準備します。500マイクロリットルのサプリメントを重炭酸ナトリウム緩衝TCM-199を4ウェルディッシュのウェルに分注します。
次に、皿を摂氏38.5度で少なくとも2時間インキュベートします。回収した未熟COCを、温めたHEPES TCM-199の2ミリリットルで満たされた3.5センチメートルの皿に移します。COCを皿のさまざまな領域に通して、周囲の破片をやさしく洗い流します。
次に、COCをIVM培地に移し、摂氏38.5度で28時間インキュベートします。成熟COCの染色体カウントを行うには、成熟COCを100マイクロモルのモナストロールで摂氏38.5度で1時間インキュベートします。次に、HEPES緩衝TCM-199中の0.5%ヒアルロニダーゼでCOCを処理して、卵丘細胞を除去する。
この反応を摂氏38度に設定された加熱ステージで監視します。約5分以内に、すべてのセルを削除します。穏やかなピペッティングを使用して、最後のいくつかの頑固な細胞を取り除きます。
次に、HEPES緩衝TCM-199で0.2%プロナーゼを使用して透明帯を除去します。この反応を加熱されたステージでも監視します。完了するまでに約 5 分かかります。
次に、卵子をDPBSの4%パラホルムアルデヒドに38.5°Cで15分間固定し、続いてさらに4°Cで45分間固定します。固定後、卵子をDPBS中の0.1%ポリビニルアルコールの3つのウェル間で順次移して卵子を洗浄します。ウェルあたり約半ミリリットルの溶液を使用してください。
次に、卵子をPBS中の0.3%Triton X-100で満たされたウェルに移し、室温で10分間インキュベートします。非特異的なシグナルをブロックするには、細胞を1%BSAおよび10%正常ロバ血清を含むDPBSに浸します。細胞を室温で少なくとも30分間インキュベー
トします。30分後、一次抗体を塗布し、細胞を摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、卵子を洗浄し、二次抗体を室温で1時間、光にさらさないように塗布します。セカンダリーを塗布した後、再度卵子を洗浄します。
次に、取り付ける前に、両面テープストリップをスライドに取り付けて、カバースリップサポートとして機能します。次に、卵子をスライドごとに3〜4個、20マイクロモルのYO-PRO-1を添加した非硬化性の退色防止封入剤にドロップします。卵子が約10分間落ち着くのを待ってから、カバースリップを塗ります。
OPUが優勢な卵胞から回収した32のCOCのうち、28は中期IIにありました。in vitro成熟を使用して、非優勢な卵胞から収集された44のCOCのうち37が中期IIに成熟しました。次に、両群の染色体を比較しました。in vitroで成熟した卵子は、しばしば異数性、主に倍数性の影響を受けました。これは、in vivoで成熟した卵子では観察されませんでした。
次に、主軸の極間の長さと最大での主軸の直径の両方を測定しました。in vitroで成熟した卵子は、in vivoで成熟した卵子よりも有意に長く、幅が広くなりました。同じサンプルで、H4K16の全球アセチル化レベルを測定しました。
結果は予想通りでした。H4K16のアセチル化は、in vivoで成熟した卵子よりもin vitroで成熟した卵子で有意に低かった。よく訓練されたチームは、排卵前の卵子の80%の回収率と未熟な卵子の50〜60%の回収率で、OPUの朝に5頭の牝馬を処理できます。
OPU期間中は、常に動物の健康状態を監視し、必要に応じて適切な獣医ケアを提供する準備をしてください。この実験的アプローチは、他の種の卵子にも適用でき、特にヒトなど、サンプルの入手可能性が問題となる場合に適用できます。私たちの結果に基づいて、適切な染色体分配とエピジェネティックな変化に必要な培養条件をよりよく理解するための研究を行う必要があります。
包括的な目標は、獣医学とヒト不妊治療の両方において、in vitro成熟効率を向上させることです。
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本稿では、馬卵母細胞の形態学的および生化学的な特性を明らかにするための実験的アプローチを提示します。超音波ガイド下卵子採取(OPU)を用いた未成熟および成熟馬卵母細胞の回収について詳細に述べ、染色体分離、紡錘体形態、全般的なヒストンアセチル化、およびmRNA発現について検討します。
単排卵種の卵母細胞の生物学的特性を明らかにすることは、サンプルの可用性が限られているためにメカニズムの解明が困難であるという、生殖研究開発における重大なボトルネックを解消することにつながります。このアプローチにより、in vitroおよびin vivoでの成熟が染色体の完全性とエピジェネティック制御に及ぼす影響の比較分析が可能になり、培養条件の最適化に向けた予測的な知見が得られます。このようなデータは、臨床応用の前に、培養によって誘発される異数性や紡錘体欠損を特定することで、生殖補助医療のリスク軽減を後押しします。
この手法はディスカバリーバイオロジーのフェーズに該当し、配偶子の品質に関するメカニズム的な知見を得ることで、生殖治療に向けた上流のターゲットバリデーションおよび下流のアッセイ開発に役立てられます。