Name: 馬の卵母細胞における染色体分離、ヒストンアセチル化およびスピンドル形態の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: 学ぶ馬の卵母細胞の形態学的・生化学的解析法。超音波誘導下卵巣採卵（OPU）で未熟・成熟卵を採取し、染色体分離、スピンドル形態、ヒストンアセチル化、mRNA発現を評価する。単発情性動物の生殖能力研究に有用です。

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著者たちは、毎日超音波卵巣スキャンとhCG注射を行うために、レーザースキャニング共焦点顕微鏡（LSCM） 、フィリップ・バリエールとティエリー・ブラードのサポートについてFabrice Vincentに感謝したい。この作品は、「Regione Sardegna and Regione Lombardia」プロジェクト「Ex Ovo Omnia」（無償で26096200からAMLへ）によって部分的に支持されました。 「L&#39;Oreal Italia per le Donne e la Scienza 2012」フェローシップ（2012年からFFへの契約）、FP7-PEOPLE-2011- CIG、Research Executive Agency（REA）「Pro-Ovum」（付与番号303640からVL）欧州ソーシャルファンド、人的資源開発セクター別運営プログラム2007〜2013（契約番号POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371〜IM）と共同で資金を調達した農林水産省獣医学部によって実施された。 in vivoでの卵母細胞の回収は、Françaisdu Cheval et de l&#39;Equitation研究所によって資金提供された。

すべての手順は、動物保護および使用委員会CEEA Val de Loire Number 19によって承認され、実験動物のケアおよび使用のための基本原則に従って実施された。 1.卵母細胞の回収およびインビトロ成熟<ol><li> オーバムピックアップ <ol><li>大人の牝馬のコホートにおける卵胞卵胞の直径を超音波で毎日評価する。 33 mm以上の卵胞が出現したら、頸静脈上部に1,500 IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）を注射する（iv）。 <ol><li>注射を行う前に、アルコールで綿棒を拭き取り、頸静蓋を見つけ、注射部位の下に親指を2〜3cm置いて、静脈を上昇させる。針を首にほぼ平行に差し込み、針が静脈にあることを確認する（血液が注射器に入る）。この時点で、注入します。 hCGは、支配的な卵胞の卵母細胞の成熟。 </li></ol></li><li> hCG注射の35時間後、デトミジン（15μg/ kg、静脈注射）、ブトルファノール酒石酸塩（10μg/ kg、静脈注射）およびブチルスコポラミンブロムア（0.2-0.3mg / kg、15mL / mare、静脈注射）で牝馬を鎮静させる。 </li><li>針を超音波プローブに接続します。超音波プローブを膣内に挿入し、超音波プローブに直面するように卵巣を直腸的に保持する。あるオペレーターに針を操作させ、他のオペレーターに、卵胞を超音波プローブに向けて卵巣を所定の位置に保持させるように指示する。支配的な卵胞と卵巣から開始します。 </li><li>膣壁および支配的な卵胞の壁を針で穿刺する（OPU用の超音波プローブには、吸引システムに接続された針用のチャネルが装備されている）。エコーグラフ画像ではその瞬間が表示されます。 </li><li>吸入システムに接続された50mLコニカルチューブで濾胞液を吸引する。円錐の内容物を注ぐ大型ペトリ皿に入れ、実体顕微鏡を用いて卵丘 - 卵母細胞複合体（COC）を検索する。 </li><li> COCは常に卵胞液で回収されるわけではないので、5IU / mLのヘパリナットを含有するダルベッコ改変リン酸緩衝食塩水（DPBS）37℃で卵胞を洗い流す。ステップ1.1.5の卵胞液について先に記載したように、DPBSのCOC存在を調べる。 COCが回収されるまで数回洗い流します。 </li><li>優性濾胞からのCOCが回収されると、ステップ1.1.3-1.1.4の優性濾胞について記載したように、≧5mmおよび≦25mmの濾胞を穿刺して洗い流す。 5以上≧25の小胞は黄体形成ホルモン/絨毛性ゴナドトロピン受容体（LHCGR）を発現しないため、卵母細胞はhCGに応答して成熟せず、GV期（未成熟）で収集される。卵丘細胞のいくつかの完全な層と褐色の細かく顆粒化した卵質を有するCOCのみを保持する。他の人は捨てる。 </li><li> OPUの終わりに、感染を防ぐために、雌雄にベンジル - ペニシリン15,000IU /動物を投与する。 </li><li>少なくとも2時間静かできれいな安定した場所に馬を飼おう。他の動物の会社に牝馬を戻す前に、耳の位置、刺激に対する反応（ 例えば騒音）、歩き方などを意識して兆候を確認します。 </li></ol></li><li> インビトロ成熟 <ol><li>ヘパリン1,790IU / L、0.4％ウシ血清アルブミン（BSA）、ペニシリン、およびストレプトマイシンを37℃に添加した温かいHEPES緩衝TCM199（20mM Hepes）。この媒体を事前に準備する。フィルター滅菌し、4℃で6ヶ月間保管してください。 </li><li> 50ng / mL表皮成長因子（EGF）および20％子ウシ血清7を補充してIVM培地を調製する（NaHCO 3緩衝化TCM199（25mM NaHCO 3 ））。新しいボトルを開けてから3週間以内にNaHCO 3を補充したTCM199を使用してください。 EGFを予め100倍のストックとして調製し、-20℃で凍結させる。6ヶ月以内に使用してください。 4ウェルディッシュのウェルに500μLを分注し、5％CO 2を含む加湿空気中、38.5℃で少なくとも2時間インキュベートする。 </li><li> ≧5および≦25 mmの卵胞からCOCを回収した後、2 mLのHEPES-TCM199を充填したペトリ皿（直径3.5 cm）に入れます。細胞破片を洗い流すためにCOCをディッシュの異なる領域に移動します。 </li><li> COCをIVM培地に移し、38.5℃で5％CO 2を含む加湿空気中で28時間インキュベートする。 </li></ol></li></ol> 2.免疫蛍光法と画像解析<ol><li> 染色体数 <ol><li>優性卵胞またはIVMの終わりに収集した後、38.5℃で5％CO 2を含む加湿空気中で100μMモナステロールと1時間COCをインキュベートする。モナストロールを100倍のストックとして事前に調製し、-20℃で最大1年間保管してください。 </li><li>卵丘細胞を除去するそれらを0.5％ヒアルロニダーゼで処理することによって、または穏やかにピペッティングにより; 0.2％プロナーゼでそれを処理することにより透明帯を除去する。ヒアルロニダーゼとプロナーゼを予め10倍のストックとして調製し、-20℃で1年間保存してください。 </li><li> 38.5℃で15分間DPBS中の4％パラホルムアルデヒド中で卵母細胞を固定し、次いで4℃でさらに45分間固定する。 注意！パラホルムアルデヒドを取り扱うときは、個人用保護具を着用し、有害廃棄物のガイドラインに従って汚染された物質を廃棄してください。 </li><li> 0.1％ポリビニルアルコール（PVA）を補充した500μLのDPBSで満たした3つのウェルに順次移すことによって卵母細胞を洗浄する。 0.3％Triton X-100中で室温（RT）で10分間浸透させる。 </li><li> RTで少なくとも30分間、1％ウシ血清アルブミン（DPBS-1％BSA）および10％正常ロバ血清を添加したDPBS中での非特異的結合をブロックする。試料は、4℃で3〜4日間ブロッキング溶液中で保存することができます。 </li><li>一次染色のために、1％BSA（希釈1:50）を添加したDPBS中のウサギ抗Aurora B phospho-Thr232中の卵母細胞を4℃で一晩インキュベートする。 </li><li>ステップ2.1.4で説明したように卵母細胞を洗浄する。灰色のRTで1時間、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC） - 抱合ロバ抗ウサギIgG（DPBS-1％BSA中1：100）の溶液中で卵母細胞をインキュベートする。 </li><li>ステップ2.1.4に記載されているように卵母細胞を洗浄し、ガラススライド上に20μMのYOPRO1を補充した1滴の非硬化性の退色防止培地に3-4個の卵母細胞を置く。すべての卵母細胞がマウントされるまで手順を繰り返します（1スライドあたり3〜4個の卵母細胞）。 </li><li>卵母細胞をマウント培地中で約10分間沈降させ、次いでそれらをカバーグラスで覆う。卵母細胞を粉砕することを避けるために、ガラススライド上にカバーガラスを敷く前に、両面テープの2つのストリップを塗布する。 注記：この予防措置は、すべてのサンプルがガラススライドdeとカバースリップ。ガラススライドは-20℃で凍結され、2〜3日後に画像化される。 </li><li>赤色（セントロメア）および緑色（染色体）チャンネル7,13,14,20,21を使用して、60X対物レンズを備えた共焦点レーザー走査顕微鏡上のサンプルを画像化する。 z軸上の骨幹全体プレートにまたがるサンプルをスキャンし、0.35μmごとにステップを実行します。すべての単一計画のデジタル化されたイメージを保存します。 </li><li> NIH ImageJソフトウェアの細胞計数機能（https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.htmlから入手可能）を使用して、直列共焦点部分のセントロメアを計数する。 注：隣接するセクションに表示されるセントロメアの繰り返しカウントを避けるには、数値コードを使用して連続したセクションに表示、滞在、消滅するセントロメアを特定します。 </li><li>染色体を再現するステップ2.1.11で独立した演算子でuntingする。 注：卵母細胞を倍数体（32染色体）、倍数体（32倍体）、または低倍体（&lt;32）として分類する。 </li></ol></li><li> スピンドル形態およびヒストンアセチル化 <ol><li>優性卵胞またはIVMの終わりに集めた後、ステップ2.1.2に記載されているように、0.5％ヒアルロニダーゼでの処理または穏やかなピペットで卵丘細胞を除去する。 </li><li>ステップ2.1.4のようにDPBS-PVAで卵母細胞を洗浄し、38℃で20分間2.5％パラホルムアルデヒドで固定する。ステップ2.1.4に記載されているようにして広範に洗浄し、0.1％Triton X-100で5分間室温で透過処理する。 注意：パラホルムアルデヒドを取り扱うときは、個人用保護具を着用し、有害廃棄物のガイドラインに従って汚染物質を処分してください。 </li><li> 2％ウシ血清アルブミン（DPBS-2％BSA）、0.05％サポニン、および10％正常ロバ血清を添加したDPBS中での非特異的結合のブロックRTで2時間。 注：サンプルは、4℃で3〜4日間ブロッキング溶液に保存することができます。 </li><li>一次染色のために、0.05％サポニンを含むDPBS-2％BSA中、マウス抗アルファ - チューブリン（1：150）およびウサギ抗acH4K16（1：250）中の卵母細胞を4℃で一晩インキュベートする。 </li><li>ステップ2.1.4のように卵母細胞を洗浄する。 0.05％サポニンを含むDPBS-2％BSA中、緑色蛍光色素結合ロバ抗マウスIgG（1：500）およびTRITC結合ロバ抗ウサギIgG（1：100）の溶液中で卵母細胞を1時間インキュベートする。暗闇の中のRT。 </li><li>ステップ2.1.4のように卵母細胞を洗浄した後、1μg/ mLの4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を補充した非硬化性の抗フェードマウント培地の液滴に3-4個の卵母細胞を置き、スライドガラスに。 </li><li>ステップ2.1.8で説明したように、卵母細胞をガラススライド上にマウントする。 </li><li>赤色（acH4K16）、緑色（アルファ - チューブリン）、および青色（DNA）チャネルを使用して、60x対物レンズを備えた共焦点レーザー走査顕微鏡上のサンプルをイメージする。 注：赤と青チャンネルのレーザー設定は、すべてのサンプルの取得中一定に保ちます。 0.35μmごとにステップを使用して、減数分裂紡錘体および星状板全体に及ぶ試料をz軸上で走査する。デジタル化された画像（単一の計画と投影された3D画像）を保存します。 </li><li> NIH ImageJソフトウェア（https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30）の測定機能を使用して、投影画像上の最大幅での極 - 柱スピンドル長さおよびスピンドル直径を測定する。 .html）。それぞれ3回繰り返し、平均を計算する。 </li><li> NIH ImageJソフトウェアの統合密度関数（https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html）を使用して、acH4K16の相対蛍光を定量する。それをDAPI染色の統合密度について標準化する。 </li></ol></li></ol> mRNA発現の解析<ol><li> COCを5〜25mmの小胞から回収した後、顆粒膜細胞を収集するペトリ皿に残っている浮遊液を除去し、10,600×gで2分間遠心分離することにより冷たいDPBS中で2回洗浄する。液体窒素中で急速冷凍。サンプルを-80℃で6ヶ月間保存する。細胞は標準曲線のために働くであろう。 </li><li>未成熟（GV）、 インビトロで成熟した、およびインビボで成熟した卵母細胞から、ステップ2.1.2に記載されているように卵丘細胞を慎重にすべて除去する。 </li><li> 2.1.4に記載されているように、卵母細胞をDPBS-PVA中で洗浄し、1μLの体積でそれらを単独で収集し、2μLのRNALaterを上に置く。液体窒素中でスナップフリーズする。サンプルを-80℃で6ヶ月間保存する。 </li><li> 2μgのルシフェラーゼ RNAを各サンプルにスパイクインとして加える 。 2 x 2の卵母細胞をプールし、小さなサンプルからRNAを回収するのに適したシリカメンブレンフィルターベースのキットを使用して全RNAを抽出する。 </li><li> 0.25μgのランダムヘキサマーおよびマウスモロニー白血病ウイルス逆転写酵素で10μLのRNAを逆転写し、37＆<html> 176℃。サンプルを-20℃で6ヶ月間保存する。 </li><li> RNAseを含まない水中の顆粒膜細胞からcDNAを50ng /μLに希釈する。この溶液を1:10に希釈して5ng /μL、0.5ng /μL、0.05ng /μL、および0.005ng /μL溶液を得る。 </li><li>基質として0.05卵母細胞に相当するcDNA、または顆粒膜細胞cDNAの連続希釈物5μL、SYBRグリーンスーパーミックス10μLおよび各特異的プライマー0.3μMを用いて、反応あたり総量20μLで反応を3回組み立てる。 表1 ）。 </li><li> 95℃で30秒間、60℃で30秒間、および72℃で20秒間を40回反復する3ステッププロトコールを使用して、サーマルサイクラーで反応を実行する。最後に、60℃から開始する融解曲線を取得し、95℃まで20秒ごとに0.5℃ずつ温度を上昇させます。 </li><li>検量線を用いて、卵母細胞サンプル中の特定のmRNAの開始量（SQ）を評価する対象とする遺伝子のSQとハウスキーピング遺伝子のSQとの比としてデータを表現する。 </li></ol>

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<li>Yang, F., Baumann, C., Viveiros, M. M., De La Fuente, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+hyperacetylation+during+meiosis+interferes+with+large-scale+chromatin+remodeling%2C+axial+chromatid+condensation+and+sister+chromatid+separation+in+the+mammalian+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone hyperacetylation during meiosis interferes with large-scale chromatin remodeling, axial chromatid condensation and sister chromatid separation in the mammalian oocyte.</a> Int J Dev Biol. 56 (10-12), 889-899 (2012).</li>
<li>Luciano, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocytes+isolated+from+dairy+cows+with+reduced+ovarian+reserve+have+a+high+frequency+of+aneuploidy+and+alterations+in+the+localization+of+progesterone+receptor+membrane+component+1+and+aurora+kinase+B%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Oocytes isolated from dairy cows with reduced ovarian reserve have a high frequency of aneuploidy and alterations in the localization of progesterone receptor membrane component 1 and aurora kinase B.</a> Biol Reprod. 88 (3), 58(2013).</li>
<li>Luciano, A. M., Lodde, V., Franciosi, F., Ceciliani, F., Peluso, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+receptor+membrane+component+1+expression+and+putative+function+in+bovine+oocyte+maturation%2C+fertilization%2C+and+early+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Progesterone receptor membrane component 1 expression and putative function in bovine oocyte maturation, fertilization, and early embryonic development.</a> Reproduction. 140 (5), 663-672 (2010).</li>
<li>Terzaghi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGRMC1+participates+in+late+events+of+bovine+granulosa+cells+mitosis+and+oocyte+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">PGRMC1 participates in late events of bovine granulosa cells mitosis and oocyte meiosis.</a> Cell Cycle. , 1-14 (2016).</li>
<li>Susor, A., Jansova, D., Anger, M., Kubelka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+in+the+mammalian+oocyte+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Translation in the mammalian oocyte in space and time.</a> Cell Tissue Res. 363 (1), 69-84 (2016).</li>
<li>Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+%28Dazl%29+at+the+oocyte-to-zygote+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes Dev. 25 (7), 755-766 (2011).</li>
<li>Ma, J., Flemr, M., Strnad, H., Svoboda, P., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternally+recruited+DCP1A+and+DCP2+contribute+to+messenger+RNA+degradation+during+oocyte+maturation+and+genome+activation+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Maternally recruited DCP1A and DCP2 contribute to messenger RNA degradation during oocyte maturation and genome activation in mouse.</a> Biol Reprod. 88 (1), 11(2013).</li>
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著者は何も開示することはない。

IVMは20年以上にわたって馬で行われてきたが、我々は卵母細胞が胚性異数性の起源であるかどうかはまだ分かっていない17 。その理由は、おそらく、染色体計数のための卵母細胞増殖の準備が、かなりの試料損失をもたらすことであろう。このことを念頭に置いて、染色体分離の誤りを調べるために用いた方法の調査を行って、馬の卵母細胞に適用する最も適切な技術を探索した。 1）染色体スプレッド5,18,19,2）蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）4,6,17,20,3）モナトロール崩壊スピンドルのセントロメアカウント既に述べたように、ギムザ染色後の染色体スプレッドの調製は、サンプル損失の速度が速いために複雑である。この方法は、多くの場合、特定のプローブを用いて異なる染色体をマッピングするFISHに置き換えられました。 FISH技術の欠点は、少数のプローブが使用される場合、偽...

女性、コンパニオンアニマル、絶滅の危機に瀕している種の不妊症を治療するための支援された生殖技術の広範な配列が開発されています。臨床設定における最も一般的な手順の1つは、超音波誘導経膣吸引、卵巣ピックアップ（OPU） 1による卵胞からの中期II（MII）ステージ卵母細胞の回収である。次いで、これらの卵母細胞をin vitro （IVF）で受精させ、得られた胚をレシピエント子宮に移植する。 MII期（成熟）卵母細胞は、外因性ゴナドトロピンの投与後に回収される。しかしながら、この治療は、一部の患者において、卵巣過剰刺激症候群（OHSS） 2の発症と関連している。 いったん卵胞から単離された減数分裂を自発的に再開する完全に増殖した未成熟卵母細胞（GVステージ）の本質的能力を利用して、投与することなく成熟卵母細胞を得ることが可能である性腺刺激ホルモンを摂取する3 。この手順は、卵母細胞のインビトロ成熟（IVM）と呼ばれ、繁殖技術を補助するために薬物志向性が低く、費用が低く、患者にやさしいアプローチです。しかし、 インビトロ で成熟した卵母細胞を用いた胚発生の成功は、一般にインビボで成熟した卵母細胞よりも低い4,5 。可能性のある説明は、インビトロで成熟した卵母細胞が染色体分離の誤りによってより影響を受け、その結果生じる異数性が正常な胚発生を損なうということである6 。 IVM中の染色体の誤分離の分子的基礎を理解することは、最終的にこの技術の完全な可能性を明らかにするであろう。この静脈では、 インビボで成熟した卵母細胞の形態学的および生化学的特徴をin vivoでの成熟と比較して調べるために実験的アプローチが用いられたここに記載されている7,8 。具体的には、未成熟卵母細胞および成熟卵母細胞のOPUおよび未成熟卵母細胞のIVMの手順を、実験モデルとして成体および自然循環馬を用いて説明する。次いで、免疫蛍光および画像分析を用いて、染色体分離、紡錘体形態およびこれらの配偶子上のヒストンアセチル化の全体的パターンを調べる。最後に、mRNA発現の分析のための逆転写および定量的PCRのプロトコルが記載される。 げっ歯類の動物モデルと比較して、馬は遺伝子操作を許さず、操作が容易でなく、高価なメンテナンスを必要とする。しかしながら、このモデルは、ヒト卵巣生理学との類似性のために、卵母細胞の成熟9,10の研究にかなりの関心を集めている11,12。/ sup&gt;。さらに、馬におけるIVM-IVFの信頼できるプロトコールの開発は、高い遺伝的価値の牝馬からの仔馬の数の増加を可能にするので、実質的な経済的関心を有する。 卵母細胞、特に、単核種の実験を行うことの限界の1つは、制限されたサンプルの入手可能性である。この制限は、以前にマウスで開発された方法を、馬の卵母細胞13,14に調整して、サンプルの損失を最小限にする染色体計数を行うことによって克服されてきた（利用可能な他の技術との比較の説明を参照）。さらに、三重蛍光染色プロトコルを最適化して同じサンプルについて複数の分析を行い、q-PCR分析を2個の卵母細胞のプールのみで行った。 全体的に、本研究は、形態学的および生化学的なcha低いサンプルの入手可能性のために勉強することが非常に困難な細胞型であるウマ卵母細胞を狂わせる。しかし、それは生殖生物学および不稔性種の不妊症に関する知識を拡大することができる。

<table><tbody><tr><td>超音波プローブ</td><td>Aloka</td><td>UST-5820-7,5</td><td></td></tr><tr><td>ヒト絨毛性ゴナドトロピン</td><td>centravet</td><td>CHO004</td><td>1,500 ユニット/動物 IV</td></tr><tr><td>デトミジン</td><td>centravet</td><td>MED010</td><td>9 - 15 &micro;g / kg IV</td></tr><tr><td>ブチルスコポラミンブロムア</td><td>セントラベット</td><td>EST001</td><td>0.2 mg / kg IV</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>NIKON</td><td>SMZ-2B</td><td></td></tr><tr><td>ブトルファノール</td><td>セントラベット</td><td>DOL003</td><td>10&micro;g / kg</td></tr><tr><td>IVベンジル-ペニシリン</td><td>セントラベット</td><td>DEP203 IM</td><td>15,000 UI /動物</td></tr><tr><td>TCM199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3769 10X1L</td><td>粉末、HEPES緩衝TCM199</td></tr><tr><td>Hepesナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784-100G</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3バッファー TCM199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2154-500ML</td><td>IVM用液体 中</td></tr><tr><td>型上皮成長因子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4127</td><td></td></tr><tr><td>新生児仔牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4762-500ML</td><td></td></tr><tr><td>4ウェルディッシュ</td><td>NUNCLON</td><td>144444</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>ヘレウス</td><td>BB6060</td><td></td></tr><tr><td>モナストロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8515</td><td></td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>pronase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>ポリビニルアルコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341584</td><td></td></tr><tr><td>triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>正常ロバ血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗オーロラB phospho-Thr232</td><td>BioLegend</td><td>636102</td><td></td></tr><tr><td>TRITC標識ロバ抗ウサギ IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>711-025-152</td><td></td></tr><tr><td>Vecta-Shield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>YOPRO1</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>Y3603</td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査型顕微鏡</td><td>LSM 780</td><td>ツァイス</td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査型顕微鏡</td><td>LSM 700</td><td>ツァイス</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ ソフトウェア</td><td>rsb.info. nih.gov/ij/download.html</td><td>フリーリソース</td><td></td></tr><tr><td>マウス 抗アルファチューブリン</td><td>シグマ - アルドリッチ</td><td>T8203</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ 抗 acH4K16</td><td>アップステートバイオテクノロジー</td><td>07-329</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-mouse IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>RNALater</td><td>Invitrogen</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>ルシフェラーゼRNA</td><td>プロメガ</td><td>L4561</td><td></td></tr><tr><td>PicoPure RNA Isolation Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>12204-01</td><td></td></tr><tr><td>ランダムヘキサマー</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>N8080127</td><td></td></tr><tr><td>mouse Moloney leukaemia virus reverse transcriptase</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>28025013</td><td></td></tr><tr><td>SYBR green supermix</td><td>BioRad</td><td>1708880</td><td></td></tr><tr><td>specific primers</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>特定のプライマーは、Primer3Plusソフトウェア(無料リソース)サーマル</td></tr><tr><td>サイク</td><td>ラーBioRad</td><td>MyiQ</td><td></td></tr><tr><td>マウスモノクローナル抗CENPA</td><td></td><td>Abcam ab13939</td><td></td></tr><tr><td>マウスモノクローナル抗オーロラB</td><td>Abcam</td><td>ab3609</td><td></td></tr>を使用して設計されました</tbody></table>

馬の卵母細胞における染色体分離、ヒストンアセチル化およびスピンドル形態の解析

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

補助生殖の分野は、女性、コンパニオンアニマル、絶滅危惧種の不妊症を治療するために開発されました。馬では、補助生殖により、スポーツキャリアを中断することなく、高パフォーマーからの胚の生産が可能になり、高い遺伝子価値の牝馬からの仔馬の数の増加に寄与する。本稿は、卵巣ピックアップ（OPU）を用いて、馬の卵巣から未熟かつ成熟した卵母細胞を採取するために用いられる手順を記載している。次いで、これらの卵母細胞を使用して、以前にマウスで開発されたプロトコールを適合させることにより異数性の発生率を調べた。具体的には、共焦点レーザー顕微鏡走査後に、中期II（MII）卵母細胞の染色体およびセントロメアを蛍光標識し、逐次焦点計画でカウントした。この分析は、未成熟卵母細胞を卵胞から採取し、インビトロで成熟させた場合の異数性率が高いことを明らかにしたインビボで。特異的リジン残基でのチューブリンおよびアセチル化形態のヒストン4の免疫染色も、減数分裂紡錘体の形態およびヒストンアセチル化の全体的パターンにおける差異を明らかにした。最後に、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）およびアセチルトランスフェラーゼ（HAT）をコードするmRNAの発現を、逆転写および定量PCR（q-PCR）によって調べた。 インビトロおよびインビボで成熟した卵母細胞の間で転写物の相対的発現に差異は観察されなかった。卵母細胞成熟中の転写活性の一般的なサイレンシングと一致して、全転写量の分析は、mRNAの安定性または分解しか示さない。したがって、これらの知見は、他の翻訳および翻訳後の規制が影響を受ける可能性があることを示している。 全体として、本研究は、形態学的および生化学的に馬の卵母細胞サンプルの入手可能性が低いため、研究するのが非常に困難です。しかし、それは、生殖生物学および不妊症種についての私たちの知識を拡大することができます。

これらの実験の最初の知見は、以前に詳細に記載されており、記載されたプロトコルを使用して得ることができる結果の例としてここに報告されている。 成熟率優性濾胞からO​​PUによって回収された32個のCOCのうち、28個（88％）がMII段階にあった。 5〜25mmの大きさの小胞から集められた58個のCOCの14個は、mRNA発現研究のための未熟な卵母細胞として直ちにスナップ凍結された。残りの44例はin vitroで成熟し、37例はMII段階（85％）に達した。成熟の効率は2つの群で有意に異ならなかった（Fisher&#39;s exact test P&gt; 0.05）。 異数性率<p class=...

この原稿は、形態学的および生化学的に馬の卵母細胞を特徴付けるための実験的アプローチを記載している。具体的には、超音波誘導卵子ピックアップ（OPU）による未成熟および成熟ウマの卵母細胞の採取方法および染色体分離、紡錘体形態、全球ヒストンアセチル化およびmRNA発現を調べる方法を具体的に説明する。

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

本実験アプローチの全体的な目的は、第一に馬の卵母細胞を形態学的および生化学的に特性解析すること、第二に、同一個体から得られたin vitroまたはin vivoで処理した配偶子を比較することです。この実験アプローチは、単排卵動物における卵母細胞の生物学および生殖能に関する重要な疑問への回答に寄与します。また、配偶子操作手順の安全性向上にもつながる可能性があります。この手法は、特に単排卵種において卵細胞のサンプル入手量が限られているという課題を克服するために開発されました。OPUの手順の実演は、リエージュ大学のStefan Deleuze教授、私の研究室のラボマネージャーであるCecile Douet、およびINRA Centre Val de Loireの馬ユニットマネージャーであるFabrice Reignerが行います。成馬のコホートを対象に、超音波診断装置を用いて卵胞の直径を毎日測定します。直径が33ミリメートルを超える大きな卵胞を探します。見つかったら、卵母細胞を優位卵胞へと成熟させるために、ヒト絨毛性ゴナドトロピン1,500ユニットを注入する準備をします。次に、頸静脈溝を確認し、注入部位をアルコールで消毒します。次に、静脈を浮き上がらせるため、注入部位の2〜3 cm下に圧力をかけます。針を頸部とほぼ平行に刺入し、わずかに吸引して針が静脈内にあることを確認してから、ホルモンを注入します。その後、膣腔へのアクセスに備えて超音波プローブを準備します。次に、針を吸引システムに接続します。hCG投与から35時間後に、OPU用の器具を準備し、牝馬を鎮静させます。動物および操作者の安全のために、十分な鎮痛処置を行うことが極めて重要です。動物が痛みや不快感を感じていなければ、卵巣の操作が可能となり、穿刺やフラッシングをより容易に行うことができます。針プローブを挿入した後、一人の操作者が卵巣を操作してプローブに向かせ、もう一人の操作者が針を操作します。超音波画像で優位卵胞を確認してください。次に、針を用いて膣壁および優位卵胞の壁を穿刺します。卵胞腔に到達したら、卵胞液を吸引します。その後、針を回転させて卵胞壁を掻き出し、卵丘細胞-卵母細胞複合体を回収します。次に、液体を大きなペトリ皿に注ぎます。そして実体顕微鏡下でCOCを探索します。その間、ヘパリンを含む温めたDulbecco's modified PBSで卵胞内を洗浄します。COCを回収するまでに、数回のフラッシングが必要な場合があります。COCが確認されたら、針をダブルルーメン針に交換し、直径5mmから25mmのすべての卵胞から未成熟COCを回収します。これらは体外成熟に使用されます。片側の卵巣からすべての卵胞を吸引した後、同様の手順を繰り返し、もう一方の卵巣から未成熟COCを回収します。次に、COCの選別を行います。卵丘細胞が数層にわたって完全に揃っており、卵質が茶色で微細な顆粒状であるCOCのみを保持します。それ以外は廃棄します。処置の最後に、感染を予防するためにベンジルペニシリン15,000 unitsを雌馬に注射します。その後、雌馬が回復するまで、少なくとも2時間は静かで清潔な厩舎で管理してください。OPUを開始する前に、サプリメント添加済みのHEPES緩衝TCM-199の一瓶を37 °Cに温めておきます。次に、IVM培地を調製します。サプリメント添加済みの重炭酸ナトリウム緩衝TCM-199を500 µL、4ウェルプレートの各ウェルに分注します。その後、ディッシュを38.5 °Cで少なくとも2時間インキュベートします。回収した未成熟COCを、温めたHEPES TCM-199 2 mLが入った3.5 cmディッシュに移します。COCをディッシュ内の異なる領域へ移動させ、周囲のデブリを穏やかに洗浄します。次に、COCをIVM培地に移し、38.5 °Cで28時間培養します。成熟したCOCの染色体数を測定するには、100 µMのmonastrol中で38.5 °Cで1時間培養します。その後、HEPES緩衝TCM-199に含まれる0.5% hyaluronidaseでCOCを処理し、キュムルス細胞を除去します。38°Cに設定した加熱ステージ上で、この反応をモニターします。約5分以内に、すべての細胞を取り除いてください。最後に残っている取りにくい数個の細胞は、ピぺッティングを丁寧に行いながら取り除きます。次に、HEPES緩衝TCM-199中の0.2% pronaseを用いて透明帯を除去します。この反応についても、同様に加熱ステージ上でモニタリングしてください。完了まで約5分かかります。次に、卵母細胞をDPBS中の4%パラホルムアルデヒドで38.5 °Cで15分間固定し、続いて4 °Cでさらに45分間固定します。固定後、DPBS中の0.1%ポリビニルアルコールを満たした3つのウェルに順次移して、卵母細胞を洗浄します。溶液は1ウェルあたり約0.5 mL使用してください。次に、卵母細胞をPBS中0.3% Triton X-100を満たしたウェルに移し、室温で10分間インキュベートします。非特異的シグナルをブロックするため、1% BSAおよび10%通常ドナキー血清を含むDPBSで細胞を洗浄します。その後、室温で少なくとも30分間、細胞をインキュベートします。30分後、一次抗体を添加し、細胞を4°Cで一晩インキュベートします。翌日、卵母細胞を洗浄し、遮光条件下で室温にて二次抗体を1時間添加します。二次抗体添加後、再度卵母細胞を洗浄します。次に、封入する前に、カバーガラスの支持体としてスライドガラスに両面テープを貼り付けます。そして、20 µMのYO-PRO-1を添加した非硬化性の抗退色封入剤の滴の中に、1枚のスライドにつき3〜4個の卵母細胞を封入します。卵母細胞を約10分間静置させた後、カバーガラスを被せます。優位卵胞からOPUにより回収された32個のCOCのうち、28個が第二減数分裂中期（metaphase II）にありました。in vitro成熟（体外成熟）を用いた結果、非優位卵胞から回収された44個のCOCのうち37個が第二減数分裂中期まで成熟しました。その後、両群の染色体を比較しました。in vitroで成熟させた卵細胞では、異数性、主に高倍数性が認められることが多かったのに対し、in vivoで成熟させた卵細胞ではこれが認められませんでした。次に、紡錘体の極間長および最大径をそれぞれ測定した。in vitro成熟卵子は、in vivo成熟卵子よりも有意に長く、また幅も広かった。また、同一のサンプルを用いて、H4K16の全般的なアセチル化レベルを測定した。結果は予想通りであった。in vitroで成熟させた卵母細胞におけるH4K16のアセチル化は、in vivoで成熟させた卵母細胞よりも有意に低かった。熟練したチームであれば、1回のOPUの午前中に5頭の馬を処理でき、排卵前卵母細胞の回収率は80％、未熟卵母細胞の回収率は50～60％となる。OPUの間は、常に動物の状態と健康状態を監視し、必要に応じて適切な獣医学的ケアを提供できるよう準備しておいてください。この実験的アプローチは、他種の卵母細胞にも適用可能であり、特にヒトのようにサンプルの入手可能性が課題となる場合に有用です。我々の結果に基づき、適切な染色体分離とエピジェネティックな変化に必要な培養条件をより深く理解するための研究を行う必要があります。包括的な目標は、獣医学とヒトの不妊治療の両方において、体外成熟の効率を向上させることです。

analysis-chromosome-segregation-histone-acetylation-spindle

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

卵母細胞が減数分裂成熟中に染色体の分離の誤差による異数性になりやすいです。異数体卵は不妊、流産やダウン症などの発達障害を引き起こす可能性があります。ここでは、卵母細胞と減数分裂成熟を研究し、倍数性を評価する方法に選択の材料を導入する方法を説明します。...

マウス卵母細胞のマイクロインジェクション、成熟および倍数性評価

ここでは、マウス卵母細胞で減数分裂スピンドルアセンブリと組織を評価するために、免疫蛍光分析に続いて、特定のsiRNA媒介mRNAの枯渇のためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、転写物のin vitroでの枯渇と異なるスピンドルおよび/ ​​または卵母細胞におけるMTOC関連因子の機能評価に適しています。...

siRNA媒介サイレンシングによるマウス卵母細胞における減数分裂紡錘体の評価

ここでは、核小体の組織に基づいて、マウス胞状卵母細胞の特徴付けのためのプロトコルを提示します。...

核小体クロマチン組織に基づいてマウス洞卵母細胞の単離とキャラクタリゼーション

哺乳類の卵形成がエラーを起こしやすい、染色体の紡錘のために特に知られています。この原稿は、マウス前期, クロマチンを広める準備方法をについて説明します中期私と卵母細胞の II...

クロマチン広がるマウス卵母細胞の進行を前期から中期 II の分析のための準備

この原稿は、 Xを生成するための詳細な方法を提示-染色体腕プローブおよび実行する蛍光その場で交配 (魚) の妹の状態を調べるに染色分け体結束の prometaphase...

Prometaphase の腕凝集度と中期の状態を監視する蛍光In Situハイブリダイゼーション (魚) を使用して私はショウジョウバエの卵母細胞

人間の病気に関連する遺伝子の変異は明らかになるを開始するにつれて急速に識別された亜種の生物学的意義を評価するシステムの開発がますます重要になっております。このプロトコルでは、私はマウス卵母細胞を使用して女性の減数分裂の間人間遺伝子の働きを評価する方法について説明します。...

マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私

偏光顕微鏡を用いたヒト卵成熟度の非侵襲的評価のための臨床プロトコルの概要を提供する.

ヒト卵成熟度評価とその臨床応用

近赤外フェムト秒レーザーを用いた中期I期にマウス卵母細胞の細胞質微小管組織化中心の枯渇を可能にする最適化されたプロトコルを提示します。...

マウス卵母細胞における細胞質微小管組織化中心の多光子レーザーアブレーション

染色体分配の誤りは、卵母細胞に共通する特徴です。したがって、紡錘体アセンブリのチェックポイントを研究することは、健康な卵を生産するために必要なメカニズムについての重要な手がかりを与えます。本プロトコルは、マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性を評価するための3つの相補的アッセイを記載する。...

マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性の評価

シナプスと組換えの減数分裂エラーは、哺乳類の卵母細胞に共通しています。これらのプロセスに関与するタンパク質の厳密な分析は、卵子形成がどのように、そしてなぜしばしばうまくいかないのかを理解するために不可欠です。ここで紹介する技術により、組換えとシナプスを包括的にモニタリングし、マウスの卵子の質を評価することができます。...

シナプシスおよび組換えの評価のためのマウス卵母細胞からの減数分裂染色体スプレッドの調製

学ぶ馬の卵母細胞の形態学的・生化学的解析法。超音波誘導下卵巣採卵（OPU）で未熟・成熟卵を採取し、染色体分離、スピンドル形態、ヒストンアセチル化、mRNA発現を評価する。単発情性動物の生殖能力研究に有用です。

馬の卵母細胞における染色体分離、ヒストンアセチル化およびスピンドル形態の解析

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