評価するための総合的な手順

この手順の全体的な目的は、腫瘍を担持した免疫能を有するマウスを用いて、全身、組織、単一細胞、および細胞内レベルにおけるがんナノ医薬品のin vivoでの挙動を評価することです。この手法は、がんナノ医薬品分野における重要な問い、すなわち「ナノ医薬品は時間の経過とともに、生体動物の異なる組織に定量的にどのように蓄積するのか」という疑問に答えるのに役立ちます。

この手法の主な利点は、この二重標識アプローチにより、マクロレベルからミクロレベルまで、ナノ医薬品のin vivoにおける特性評価が可能になることです。本手順を実証するための例としてリポソームを選択しました。リポソームは現在臨床で使用されており、実験的なナノ医薬品の一般的なプラットフォームでもあるためです。手順を開始するには、親油性カチオン性蛍光色素を0.1% mol含有する脂質混合物 20 milligramsを、2 millilitersのクロロホルムに溶解させます。

次に、ロータリーエバポレーターで脂質を乾燥させます。乾燥させた脂質に、リン酸緩衝生理食塩水20 millilitersを添加します。3.8 millimeterプローブソニケーターを用い、30 wattsで30分間、氷上にて混合液をソニケーションします。その際、混合液の温度を4〜20 degrees Celsiusに維持してください。

得られたリポソームナノ粒子懸濁液を4,000 Gで10分間遠心分離します。ペレットを廃棄し、MWCO 100 kilodaltonの遠心フィルターユニットを用いて、4000 GでリポソームをPBSで洗浄します。濃縮されたリポソームを上部チャンバーから新しい遠心チューブに移します。リポソームはPBS中で冷蔵保存し、最大1週間まで保存可能です。

精製したリポソーム懸濁液 50 µL と PBS 950 µL の混合物を用いて、動的光散乱測定を行う。粒子径を測定し、粒度分布を決定する。放射標識の手順を開始するために、脂質量を 2 mg とした精製リポソームと PBS の必要量を 1.5 mL チューブに移す。

これに1 mCiのシュウ酸ジルコニウム-89を加え、最終容量を100 µL、pHを6.9から7.1に調整します。混合液を37 °Cで2時間撹拌します。その後、100 kDaのフィルターユニットを用い、4,000 ×gで遠心ろ過して未反応のジルコニウム-89を除去します。保持液を滅菌PBSで4,000 ×gにて3回洗浄します。最後に、保持液を注射用に約3 µCi/µLまで希釈します。

放射線検出器を備えたサイズ排除HPLCを用いて、放射性標識リポソームの放射化学的純度を決定します。放射化学的純度が95%未満である場合は、投与量を再調製してください。動的光散乱法を用いて、粒子径と分布値の両方が非標識リポソームのものと同様であることを確認します。

イメージング手順を開始するために、拘束したメラノーママウスの尾静脈に約300 microcurieの放射性標識リポソームを注入します。注入の2分後、28ゲージのインスリン用注射器を用いて、マウスの尾静脈から10〜20 microlitersの血液を採取します。採取した血液サンプルを、あらかじめ重量を量っておいた計数管に移します。

血液サンプルの重量を量り、ガンマカウンターで放射能強度を測定します。放射能濃度を、投与量あたりのグラム当たりパーセンテージ（%ID/g）として算出します。投与から15分後、同様の方法でもう一つの血液サンプルを採取し、測定します。

次に、ノーズコーンを介して2%isofluraneと酸素を投与し、マウスを麻酔します。注入の1時間後に3回目の血液サンプルを採取し、測定します。その後、マウスを回復ケージに入れ、通常の可動性が回復するまで安静にします。

注入後4時間、8時間、24時間、および48時間で追加サンプルを採取する。注入の間は、マウスを十分に回復させる。放射性物質を投与した動物専用の飼育室でマウスを飼育する。

リポソーム注入から24時間または48時間後に、2%isofluraneと酸素を用いてマウスを麻酔します。マウスを腹臥位にして小動物用microPET-CTスキャナーのベッドに配置します。ノーズコーンを介して2%isofluraneと酸素の供給を継続します。

マウスの眼が乾燥するのを防ぐため、眼に動物用軟膏を塗布する。次に、スキャナーベッドを装置内に移動させる。エネルギーウィンドウを250〜700 keV、同時計数時間窓を6 nsとし、同時計数イベント数が5,000万回以上に達するように、15分間の全身PET静止スキャンを行う。

次に、120回の回転ステップで220度を、1フレームあたり約145ミリ秒で5分間のCTスキャンを行います。スキャン完了後、直ちに二酸化炭素による窒息法でマウスを安楽死させます。動物の足先をつまんで死亡を確認した後、頚椎脱臼を行います。

PBSで組織を灌流して血液を除去し、目的の組織サンプルを採取します。採取した組織の重量を量り、放射活性を測定します。組織への放射性標識リポソームの蓄積量を、投与量あたりの重量百分率（% ID/g）として算出します。

腫瘍組織を冷たいPBS中で保存します。採取した腫瘍組織に対してex vivoフローサイトメトリーおよび免疫蛍光イメージングを行い、細胞集団ごとの集積量を測定します。ジルコニウム-89で標識したナノ粒子を注入した腫瘍担癌マウスのPET/CTイメージングでは、注入24時間後に腫瘍組織への有意なナノ粒子の集積が認められました。

ナノ粒子の血中半減期は約10時間であることが判明しました。投与24時間後のex vivoバイオディストリビューション測定結果は、in vivo PET/CT測定結果と一致していました。その後、免疫染色法を用いて、単一細胞レベルでのナノ粒子の集積を検討しました。

フローサイトメトリーにより、ナノ粒子が腫瘍関連マクロファージに優先的に蓄積することが示されました。また、腫瘍サンプルの免疫蛍光イメージングにより、ナノ粒子による血管内皮細胞への特異的なターゲティングも示されました。この手法は、臨床応用に有望なナノ医薬品を研究者が特定するのに役立ちます。

この手法に習熟すれば、適切に実施することで3日間で完了させることができます。ナノ医薬品の放射性標識を行う際は、厳格な品質管理基準を適用することが重要です。本手順に従い、ナノエマルション、高分子ナノ粒子、ミセル、抗体、抗体断片などの他のナノ医薬品を標識することで、腫瘍担持マウスにおけるin vivoでの性能を測定することが可能です。