細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム

このプロトコルの全体的な目的は、化合物がヒトマクロファージ内でのM.tuberculosisの生存にどのように影響するかを多次元的に評価することです。この手法は、ルシフェラーゼを用いた有効性試験を中心に構成されています。細胞毒性試験およびMIC試験と組み合わせることで、結核治療薬開発におけるヒット化合物の最適化に有用な情報を提供できます。

本手法の主な利点は、時間と労力を削減できることです。これは、CFU（コロニー形成単位）測定法をルシフェラーゼベースの測定法に置き換えるものです。一般的に、この手法に不慣れな人は、自動化ではなく手動でのピペッティングを行う際に、再現性の確保に苦労することがあります。

一貫したピペッティング技術が不可欠です。THP1細胞を完全培地を含むRPMIで培養します。継代の間、細胞密度を培地1 mLあたり0.2から100万個に維持してください。

分光光度計を用いて、活発に増殖している細菌懸濁液のOD600を測定します。次に、0.1 OD600を3×10⁷ bacteria/mLとする換算係数を用いて、細菌密度を算出します。MOIが10:1となる十分な量の細菌を、新しい遠心チューブにピペットで分注します。

次に、細菌を 3,000 ×g で 10 分間遠心分離してペレット化します。細菌をオプソニン化するために、450 µL の RPMI 1640 に 50 µL のヒト血清を加え、これを用いて細菌ペレットを培地 500 µL あたり 1 × 10⁸ 個の密度で再懸濁します。この混合物を 37 °C で 30 分間インキュベートします。

次に、血球計数器と倒立顕微鏡を用いて、THP1細胞の培養密度を決定します。その後、滅菌済み遠心チューブ内で、細胞を100 ×g、37 °Cで10分間遠心し、ペレット化します。上清を吸引し、細胞を完全培地を含むRPMIを用い、1 × 10⁶ cells/mLの密度で再懸濁します。

PMAを最終濃度40 nanograms per milliliterになるように添加します。これが分化誘導ミックスとなります。オプソニン化されたM.tuberculosisを、MOI 10:1でTHP1分化誘導ミックスと混合しました。

最終混合液を96ウェル白色平底プレートの1ウェルあたり100 µLずつ分注します。その後、5%二酸化炭素を含む37 °Cの加湿インキュベーター内で、分化および感染を一晩インキュベートします。翌日、100 µLのRPMIを用いてウェルを2回洗浄します。

次に、目的の濃度に希釈した化合物と、完全培地のRPMIを加えます。プレートを3日間インキュベートします。マルチチャンネルピペットを使用する際は、プランジャーをゆっくりと一定の速度で操作し、THP1細胞への影響を最小限に抑えるため、常に各ウェルの同じ位置にピペットチップを差し込むようにしてください。

インキュベーション後、ウェルから培地を吸引し、各ウェルに50 µLのルシフェラーゼアッセイ試薬を加えます。次に、透明な粘着プレートシールを用いてプレートを密封します。プレートを22 °Cで5分間インキュベートし、ルミノメーターを使用して、1ウェルあたり1秒で読み取り値を取得します。

THP1細胞を分化させるには、本ビデオの前の工程で示した分化誘導液を調製した後、細胞が入った透明な96ウェルプレートの各ウェルに分化誘導液を100 µLずつ分注します。細胞を5% CO2濃度の加湿インキュベーター内で37 °Cで一晩培養します。翌日、ウェルから培地を吸引除去し、RPMI 1640を用いて2回洗浄します。

RPMI不完全培地で希釈した化合物を100 µL、ウェルに添加します。その後、細胞を3日間培養します。0.5 gのMTTを100 mLのPBSに溶解し、5 mg/mLのストックソリューションを作成します。

その後、溶液をフィルター滅菌します。3日間のインキュベーション期間が終了する2時間30分前に、各ウェルの細胞に25 µLのMTT溶液を加え、インキュベーションを完了させます。250 mLのDMFと250 mLの脱イオン水を混合し、50%ジメチルホルムアミド（DMF）を調製します。

MTT抽出バッファーを次のように調製します。500 mLボトルに100 gのSDSを入れ、300 mLの50% DMFを加えます。弱熱を加えてSDSを溶解させます。

純酢酸10 millilitersと1 M塩酸12.5 millilitersを加えます。次に、50%DMFを用いてボトルを500 milliliterの標線まで満たします。処理期間の終了後、各ウェルに抽出バッファーを100 microlitersずつ加えます。

混合物を、5%二酸化炭素を含む加湿インキュベーター内で37°Cで一晩インキュベートします。翌日、570 nmで吸光度を測定します。レザズリンアッセイを行うには、M.tuberculosisを7H9 ADSTで対数増殖期中期まで培養します。

培養液を7H9 ADSTで希釈し、OD600を0.01にします。7H9 ADSTを用いて、化合物を試験濃度の2倍に希釈します。そして、希釈した各化合物を100 µLずつ、透明な96ウェルプレートの各ウェルに分注します。

希釈した細菌懸濁液を各ウェルに100 µLずつ分注します。プレートを加湿インキュベーター内で37 °Cで5日間培養します。10 mgのresazurinを100 mLの脱イオン水に溶解させます。

溶液をフィルター滅菌します。ウェルにレサズリン溶液を30 µL加えます。その後、細胞を48時間インキュベートします。

細菌の増殖は、青色から桃色への色変化によって示されます。テキストプロトコルに従って定量分析を行ってください。この散布図は、M.tuberculosisおよびTHP1細胞に対して様々な濃度のリファンピシンで処理した際に測定された、相対発光単位での未処理の発光データを表しています。

このプロットでは、未処理のウェルと比較した処理済みウェルの減少率および発光量を示しています。リファンピシンは、0.1 µg/mLの濃度で、細胞内 M.tuberculosis 由来の相対発光量（RLU）を99.9%減少させることが可能です。これは、CFUから算出された既報の結果と同様です。

この図では、MTTアッセイに使用したG1-1Hの濃度上昇に伴う細胞毒性が示されています。10 µMおよび3 µMの濃度は、明らかにIC 50のカットオフ値を下回っています。また、この図は、抗生物質アプラマイシンのさまざまな濃度がM.tuberculosisによるレサズリン変換に及ぼす影響を示しています。

液体培地でのMIC90は2.5～5 µg/mLの間でした。これは、以前に報告された値である1.5 µg/mLよりもわずかに高い値ですが、依然として許容範囲内に収まっています。

ここで示したように、インキュベーション時間が長くなるすべての実験において、蒸発が重要な問題となります。したがって、不整合を避けるために、インキュベーター内の湿度を十分に維持するよう注意が必要です。この手法を習得すれば、わずか4日間で信頼性の高い細胞内データを得ることができます。

この手順を行う際は、THP1細胞を慎重に扱うこと、また自動化機器を使用せずにピペッティングを行う場合は、その操作を一貫させることを忘れないでください。本手順の後、ハイコンテントスクリーニングなどの他の手法を用いて、ヒット化合物が静菌的であるか殺菌的であるかを判定できます。本プロトコルの開発により、結核薬探索分野の研究者が、ヒトマクロファージ内のMTBに対する化合物の有効性を迅速に評価することが可能となりました。

結核菌（microbacterium tuberculosis）の取り扱いは危険であることに留意してください。この微生物を扱う際は、予防措置を講じ、適切な設備を使用してください。