細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム結核菌

このプロトコルの全体的な目標は、化合物がヒトマクロファージ内の結核菌の生存にどのように影響するかを多次元的に評価することです。この方法は、ルシフェラーゼベースの有効性アッセイを中心としています。MICアッセイは、細胞毒性と組み合わせることで、結核薬開発におけるHIT化合物の修飾に有用な情報を提供することができます。

私たちの方法の主な利点は、時間と労力の節約です。これは、CFUコロニー形成ユニットアッセイをルシフェラーゼベースのアッセイに置き換えています。一般的に、この手法に不慣れな人は、自動化ではなく手動ピペッティングによる一貫性に苦労するでしょう。

一貫したピペッティング技術が重要です。RPMI中のTHP1細胞を完全培地で増殖させます。継代間で培地1ミリリットルあたり0.2〜100万個の細胞密度を維持しながら。

分光光度計を使用して、活発に増殖している細菌懸濁液のOD600を測定します。次に、0.1 OD600の変換係数を使用して細菌密度を計算し、10の3倍を1ミリリットルあたり7番目の細菌に等しくします。MOIが10対1の十分な細菌をピペットで取り出し、新しい遠心分離管に入れます。

次に、バクテリアを3, 000倍Gで10分間ペレット化します。細菌をオプソニン化するためには、RPMI 1640の450マイクロリットルにヒト血清の50マイクロリットルを追加し、それを使用して、培地500マイクロリットルあたり8番目の細菌の1×10の密度で細菌ペレットを再懸濁する。混合物を摂氏37度で30分間インキュベートします。

次に、血球計算盤と倒立顕微鏡を使用して、THP1細胞培養密度を決定します。次に、滅菌遠心チューブで、細胞をGの100倍、摂氏37度で10分間ペレット化します。上清を吸引し、細胞をRPMI中の完全培地に1ミリリットルあたり100万個の細胞密度で再懸濁します。

PMAを最終濃度40ナノグラム/ミリリットルまで添加します。これが差別化ミックスです。オプソニン化結核菌とTHP1分化ミックスをMOI10対1で組み合わせました。

そして、最終混合物をウェルあたり100マイクロリットルで96ウェルの白い平らな底板に分注します。次に、分化と感染を摂氏37度で、5%の二酸化炭素を含む加湿インキュベーターで一晩インキュベートします。翌日、100マイクロリットルのRPMIを使用してウェルを2回洗浄します。

次に、目的の濃度に希釈した化合物とRPMIを完全培地で加えます。プレートを3日間インキュベートします。マルチチャンネルピペットを使用するときは、ゆっくりと安定したプランジャー動作を練習し、常にピペットの先端を各ウェル内の同じ場所に着地させて、THP1細胞への干渉を最小限に抑えることを忘れないでください。

インキュベーション後、ウェルから培地を吸引し、各ウェルに50マイクロリットルのルシフェラーゼアッセイ試薬を加えます。次に、透明な粘着プレートシーラーを使用してプレートをシールします。プレートを摂氏22度で5分間インキュベートし、その後、ルミノメーターを使用してウェルあたり1秒で読み取り値を取得します。

THP1細胞を分化するには、このビデオで前述したように分化ミックスを調製した後、100マイクロリットルの分化ミックスを透明な96ウェルプレートの細胞の各ウェルに分注します。細胞を摂氏37度で加湿インキュベーターで5%二酸化炭素と一晩インキュベートします。翌日、井戸から培地を吸引し、RPMI 1640を使用して2回洗浄します。

RPMIで希釈した100マイクロリットルの化合物をウェルに加えます。その後、細胞を3日間インキュベートします。0.5グラムのMTTを100ミリリットルのPBSに溶解して、ミリリットルあたり5ミリグラムのストック溶液を作ります。

次に、溶液をろ過滅菌します。3日間のインキュベーション期間が終了する2時間半前に、各ウェルの細胞に25マイクロリットルのMTT溶液を加え、インキュベーション期間を完了します。250ミリリットルのDMFを250ミリリットルの脱イオン水と混合することにより、50%NNジメチルホルムアミドまたはDMFを調製します。

MTT抽出バッファーを次のように調製します。100ミリリットルのボトルに500グラムのSDSを置き、300ミリリットルの50%DMFを追加します。弱火を加えてSDSを溶解させます。

10ミリリットルの純粋な酢酸と1モルの塩酸12.5ミリリットルを追加します。次に、50%DMFを使用してボトルを500ミリリットルのマークまで満たします。処理期間の終了時に、各ウェルに100マイクロリットルの抽出バッファーを追加します。

混合物を摂氏37度で、5%の二酸化炭素を含む加湿インキュベーターで一晩インキュベートします。翌日、570ナノメートルで吸光度を読み取ります。レサズリンアッセイを実施するには、結核菌を7H9 ADSTでミッドロック期まで増殖させます。

培養物を7H9 ADSTで希釈し、OD600を0.01にします。7H9 ADSTを使用して、化合物を試験濃度の2倍に希釈します。そして、希釈した各化合物の100マイクロリットルを透明な96ウェルプレートの各ウェルに分注します。

希釈した細菌懸濁液100マイクロリットルを各ウェルに移します。プレートを摂氏37度で加湿インキュベーターで5日間インキュベートします。10ミリグラムのレサズリンを100ミリリットルの脱イオン水に溶解します。

そして、溶液をろ過滅菌します。ウェルに30マイクロリットルのレサズリン溶液を追加します。その後、細胞を48時間インキュベートします。

細菌の増殖は、青からピンクへの色変換によって示されます。テキストプロトコルに従って定量分析を実施します。この散布図は、結核菌およびTHP1細胞上のさまざまな濃度のリファンピシンの治療のために相対発光単位で測定された生の発光データを示しています。

このプロットでは、未処理のウェルと比較した処理済みウェルの減少率と発光率が示されています。リファンピシンは、0.1マイクログラム/ミリリットルの濃度で、細胞内結核菌の相対光単位またはRLUの99.9%を減らすことができます。以前に公開されたCFUから決定された結果と同様です。

この図では、MTTアッセイで使用されるG1-1Hの濃度の増加によって引き起こされる細胞毒性が示されています。10 マイクロモルと 3 マイクロモルの濃度は、IC 50 カットオフを明らかに下回っています。この図は、M.tuberculosisによるレサズリン変換に対するさまざまな濃度の抗生物質アプラマイシンの影響を示しています。

インブロスMIC90は、ミリリットルあたり2.5〜5マイクログラムでした。これは、以前に発表された1.5マイクログラム/ミリリットルの値よりわずかに高くなっています。しかし、それでも許容範囲内です。

ここで示したように、蒸発は、インキュベーション時間が長いすべての実験で重要になります。そのため、インキュベーターを十分に加湿して、不整合を避けるように注意する必要があります。この手法を習得すれば、わずか4日で信頼性の高い細胞内データを提供できます。

この手順を試みる際には、THP1細胞に優しく接すること、および自動化せずに行う場合はピペッティングに一貫性を持たせることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、ハイコンテントスクリーニングなどの他の方法を使用して、ヒット化合物が静菌性か殺菌性かを判断できます。その開発後、このプロトコルは、結核創薬の分野の研究者がヒトマクロファージ内のMTBに対する化合物の有効性を迅速に評価する道を開きました。

結核菌の手がかりは危険であることを忘れないでください。この微生物を取り扱うときは、予防措置と適切な機器を使用してください。