Name: 細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム結核菌 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学ぶルシフェラーゼベースのハイスループットスクリーニング法で、Mycobacterium tuberculosisに対する化合物の有効性と宿主細胞への細胞毒性を同時評価します。自動化により再現性が向上し、結核治療薬開発を加速します。

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この作業はBC肺協会とMitacsの支援を受けました。

1.菌株および増殖培地<ol><li>ウシ血清アルブミン、デキストロース10.0gを、脱イオン水の460 mLの塩化ナトリウムの4.05グラムの25グラムを溶解することによってアルブミンデキストロースおよび塩のストック溶液（ADS）を作ります。 4℃でのADS及びストアをフィルター滅菌します。 </li><li> 7H9粉末4.7gの精製水900 mLでのグリセロールの2ミリリットルを添加することにより、7H9ブロスを作ります。 10分間121℃で7H9ブロスをオートクレーブし、それが進行する前に、室温まで冷却することを可能にします。 ADS 100mLおよび7H9ブロス900mLのにTween80を0.5ミリリットルを添加することによって7H9ADSTを作ります。 4°Cで保存。 </li><li>硫酸カナマイシン50mgを秤量し、脱イオン水1mLに溶解します。最終濃度は50mg / mLです。フィルター滅菌し、-20℃で保存。 7H9ADSTの1リットル当たりのカナマイシンストック溶液0.5mlを加えます。 注：この培地はとてもボリュームを拡張適切培養サイズに応じて、新鮮されるべきです。 </li><li> 7Hに結核菌を育てます9ADSTは文化を立っ中でカナマイシンを補いました。毎日文化を振ると、OD600が凝集を避けるために、1.0に到達する前にそれを希釈します。 注：この方法の開発のために使用されるヒト結核菌株は、菌H37Rv pJAK2.Aプラスミド12で形質転換しました。 pJAK2.Aは、HSP60プロモーターからホタルルシフェラーゼ遺伝子の高レベル発現を可能にし、カナマイシンを使用して選択することができるpMV361ベクターに基づく組込みプラスミドです。 </li></ol> 2. THP-1培地とメンテナンス<ol><li> （FBSおよび2mMグルタミン約10％）RPMI不完全培地を作製するために、熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）の50 mLおよびRPMI 1640を500mLの200mMのL-グルタミンを5mLを加えます。 </li><li>標準的プロトコール13に従ってTHP-1細胞の培養を維持します。 PASの間に0.2培地1mL当たり100万の細胞密度を維持しながら簡単に説明すると、RPMI不完全培地中のTHP-1細胞を増殖させます賢人。 </li></ol>ルシフェラーゼ発現ヒト結核菌H37Rvを用い3.ハイスループット細胞内スクリーニング<ol><li>波長600nmで分光光度計で活発に増殖する細菌懸濁液の光学密度を測定します。ミリリットル当たり0.1 OD 600 = 3×10 7細菌の換算係数を使用して、細菌密度を計算します。 </li><li>新しい遠心管に10：1の感染の多重度のために十分な細菌（MOI）を行うピペット。 10分間3,000×gでペレット化し、液体を吸引。 RPMI1640の450μLにヒト血清の50μLを追加します。実験の値を適切にするボリュームをスケール。 </li><li>細菌をオプソニン化するために、10％ヒト血清を含有するRPMI1640 500μLあたり1×10 8の細菌の密度でペレットを再懸濁します。混合物を30分間37℃でインキュベートすることを可能にします。血球計および反転microscoで計数することによりTHP-1細胞の培養密度を決定PE。 </li><li> 100×gでの滅菌遠心管中の細胞をペレット化し、10分間37°C。上清を吸引し、ミリリットル当たり100万個の細胞の密度で、不完全RPMI中に細胞を再懸濁。 40 / mlの最終濃度までホルボール-12-ミリステート-13-アセテート（PMA）を加えます。 注：これは分化ミックスと呼ぶことにします。 </li><li>オプソニン化結核菌は、10のMOIでのTHP-1分化混合物と結合：1、96ウェル平底白色プレートにウェル当たり100μLの最終ミックスのアリコート。定期的に均一性を確保するために、混合物を攪拌。分化および感染は5％CO 2を含む加湿インキュベーター中で37℃で一晩進行させます。 </li><li> RPMI各100μLでウェルを2回洗浄します。不完全RPMI中で所望の濃度に希釈した化合物を添加し、3日間インキュベートします。 </li><li>ウェルから培地を吸引除去します。各ウェルにルシフェラーゼアッセイ試薬の50μLを追加します。 Tでプレートをシールransparent接着プレートシーラー。 22℃でのインキュベーションの5分を許可した後、ウェルあたり1秒でルミノメーターで読み出しを得ます。 </li></ol> 3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイ14を使用4.細胞毒性分析<ol><li>不完全な透明な96ウェルプレートにPMAの40 / mlのを補充したRPMI中でTHP-1細胞に分化します。ウェル当たりミリリットル当たり100万、アリコート100μLの細胞密度を維持します。分化は、5％のCO 2を含む加湿インキュベーター中で37℃で一晩進行させます。 </li><li>ウェルに不完全なRPMIで希釈した化合物を加えるウェルから培地を吸引除去し、RPMI 1640で二回洗って。 3日間インキュベートします。 </li><li> 5mg / mlのストック溶液を作製するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）100mLにMTT 0.5gを溶かします。離れた光から-20℃で滅菌フィルターとストア、。それは、このソリューションは、新鮮な作るのがベストです。 </li><li> 2.5時間beforE 3日間の潜伏期間の終わりには、各ウェルにMTT溶液25μLを追加し、潜伏期間を完了します。 </li><li> 50％のNを準備し、N個のジメチルホルムアミド（DMF）250mLの脱イオン水とDMFの250ミリリットルを混合することによって。 </li><li>次のようにMTT抽出緩衝液を調製：500mLの瓶にSDSを100gを秤量し、50％のDMF 300 mLを加え。 SDSを溶解させるために、低熱を適用します。純粋な酢酸10mlおよび1MのHCl 12.5 mLを加え。 50％のDMFと500mLのマークに埋めます。抽出緩衝液の最終組成は、50％DMF、20％SDS、2.5％酢酸、2.5％1 M塩酸です。 </li><li>処置期間の終わりに、各ウェルに（任意の結晶を溶解するために45℃に加温し）抽出緩衝液100μLを加えます。混合物を37で一晩インキュベートすることを許可します 5％CO 2を含む加湿インキュベーター内℃です。 570 nmの吸光度を読みます。 注：細胞毒性アッセイは、最良のセル内と並行して行われますウラル画面THP-1細胞の同じバッチと年齢を使用しました。 </li></ol>レサズリンアッセイ3を使用して、ブロス活性分析5. <ol><li> （ - 0.8 OD 600〜0.5）対数中期に7H9ADSTに結核菌を成長させます。 0.01 OD 600に7H9ADSTと文化を希釈します。各ウェルに各希釈した化合物の試験濃度及びアリコート100μLを2倍する7H9ADSTで化合物を希釈します。 </li><li>各ウェルに希釈した細菌懸濁液100μLを移します。プレートを5日間、加湿インキュベーター中、37℃でインキュベートすることを可能にします。脱イオン水および滅菌フィルタ100mLにレサズリン10mgを溶解します。 </li><li>レサズリン溶液を30μLを加え、48時間後に色の変化を監視します。細菌増殖はピンクに青から色変換によって示されます。 注：定量分析もまた530での励起と共に、590nmでの蛍光のいずれかを測定することによって行うことができる - 560nMもしくは570 nmの吸光度と600nmで15。 </li></ol>

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著者らは、この研究に対して競合する金銭的利益がないことを宣言しています。

本研究の目標は、 結核菌のための人間の細胞内感染モデルを使用して、シンプルでコスト効率のHTS方法を作成することでした。結核は、 結核菌によって肺胞マクロファージの感染によって特徴付けられるヒト疾患です。バイオセーフティ問題に、細菌と宿主細胞の両方の生物学的モデルを含む研究は過去に使用されてきました。しかし、サロゲート細菌および非ヒトモデルの使用は、薬物スクリーニングは、最高の結核菌 19、20に感染したヒト細胞を用いて行われていることを示す、医薬品開発におけるヒット・ツー・リード、成功の貧しい予測因子であることが示されています21、22。 この方法では、我々は前進し、ヒトマクロファージ様THP-1細胞株のための現在の最先端のスクリーニングプロトコルを適応しています。高達成するためにスループット、...

結核菌 、結核（TB）の原因物質は、世界中の罹患率と死亡率の主要な原因です。薬物感受性TBは、6ヶ月の期間にわたって複数の抗生物質を必要とする治療可能な疾患です。治療可能な疾患であるにもかかわらず、結核死亡率は、2015年1における150万と推定されました。過去10年間で、薬剤耐性結核の有病率に対する懸念が高まっています。多剤耐性結核（MDR-TB）は、少なくともイソニアジド（INH）、及びリファンピシン（RMP）、最もMDR-TB株は、このように治療の選択肢を制限する、第二のラインTB薬を選択することも耐性があるに耐性のあるTBのように定義されます。薬剤耐性の効果は、患者のヒト免疫不全ウイルス（HIV）で同時感染を治療するために大きな課題を作成します。 40万患者は世界中で2015 1でHIV関連結核で死亡しました。残念なことに、米国食品医薬品Administ配給は、過去40年間2に、MDR-TB、bedaquilineに対する唯一の新しい結核治療薬を承認しました。より良いと短いTBの治療法を見つけるの進歩が緊急TBとMDR-TBとの戦いに先に滞在するために必要とされています。 伝統的に、TB薬物スクリーニングは、化合物が成長している培養物に添加し、微生物を根絶におけるそれらの有効性は、固体培地上のコロニー形成単位（CFU）をカウントすることによって決定されることにより、増殖培地中でインビトロ増殖条件下で行われます。 CFU数は労働集約的、時間がかかり、かつ高価であるように、様々な間接的な方法は、この問題を軽減するために開発されています。そのような方法は、アラマーブルー生存率アッセイ3、緑色蛍光タンパク質（GFP）またはルシフェラーゼを発現する細菌からの発光5からの蛍光4の決意、および全アデノシン三リン酸の推定（Aを含みますTP）6、7。 典型的なTBは、細菌は肺胞マクロファージ8のファゴソーム内部に存在し、複製肺の結核菌の感染によって特徴付けられます。シンプルな中ブロス表現型の画面は、細胞外病原体に合うこと。しかし、歴史的な観点では、この方法を用いて同定された結核菌に対する化合物は、多くの場合、感染モデルにおける下流の検証ステップの間、期待に応えるに失敗ヒット。私たちは、結核治療薬は、最高の細胞内宿主細胞の感染モデルで実行されていることを提案します。それにも関わらず、細胞内のモデルは、ハイスループットスクリーニング（HTS）の開発に多くの技術および生物学的障壁を保有します。大きなハードルは多くの工程と洗浄の間で-による細胞外細菌の精巧な除去によって例示される、感染プロセスの複雑さです。第二の主要なハードルは、長い時間の再ですquirementsは、通常CFU培養プレート上でカウントすることによって行わ増殖検出として、完了するまでに3週間以上を要するプロセスです。 CFUカウントを交換する1つの解決策は、蛍光細菌との組み合わせで自動化された蛍光顕微鏡によって提供されています。しかし、この解決策は、多くの研究室のための手の届かないところにある初期の設備投資が必要となります。シンプル、低コスト、および疾患関連HTS方法を大幅に創薬プロセスを高めるであろう。 本研究では、細胞内の結核菌に対する化合物の活性を決定するのに適した、迅速、かつ拡張性の高い、まだ経済的、アッセイを提供することを目的とする新しい、モジュラーHTSシステムを報告しています。 （I）細胞内、（ii）の細胞毒性、および（iii）中のブロスアッセイ：このシステムは、三つのモジュールから構成されています。合わせた最終的な結果は、作用の潜在的なモードなどの追加情報と、化合物の特性の包括的な説明を提供します。このSCreeningシステムは、薬物相乗作用9の分析、オートファジー10の刺激、および結核菌 -secreted毒性因子（未発表）の阻害を含む作用機序を標的とする様々な化合物ライブラリー、といくつかのプロジェクトで使用されてきました。アクションの未知のモードの化合物はまた、11を研究されています。この方法の修正版は、細胞内結核菌 11に対して新規な化合物を同定するための一次スクリーニング法としての産業パートナーによって採択されました。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5886</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>ミドルブルック 7H9</td><td>ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー</td><td>271210</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>T164</td><td></td></tr><tr><td>アルブミン、ウシ pH7</td><td>Affymetrix</td><td>10857</td><td></td></tr><tr><td>デキストロース</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>BP350</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン 硫酸</td> フィ<td>ッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>N,N-ジメチルホルムアミド (DMF)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D131</td><td></td></tr><tr><td>1 M ヒドロコロリン酸 (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>351279212</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>351269</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21187</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>THP-1</td><td>アメリカンタイプ カルチャー コレクション</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>M. tuberculosis H37Rv</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル平底ホワイトプレート</td><td>コーニング</td><td>3917</td><td></td></tr><tr><td>95 ウェル平底クリアプレート</td><td>コーニング</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>透明プレートシーラー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AB-0580</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>バイオメイト3</td><td></td></tr>マイクロ<tr><td>プレート分光光度計</td><td>バイオテック</td><td>エポック</td><td></td></tr><tr><td>ルミノメーター</td><td>アプライドバイオシステム</td><td>ズトロピックスTR717</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム<em&gt;結核菌</em

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

結核菌は、結核(TB)の原因物質であり、世界中の罹患率と死亡率の主要な原因です。多剤耐性結核(MDR-TB)の蔓延が進む中、結核菌感染症に対する新たな治療戦略の開発が急務となっています。従来、化合物は、ブロス中のin vitro成長条件下での抗菌活性に基づいて評価されます。しかし、結核菌のような細胞内病原体については、ブロス内の表現型のスクリーニング条件が人体内の実際の疾患状態とは大きく異なるため、結果は誤解を招くことがよくあります。マクロファージ内部で作用する阻害剤のスクリーニングは、結核菌の複雑さ、感染のばらつき、および複製速度の遅さのために、伝統的に困難でした。 本研究では、マクロファージ感染モデルにおいて、結核菌の生存率に対する化合物の有効性を迅速に評価するための新しいアプローチを報告します。 細胞毒性アッセイとブロス内生存率アッセイの組み合わせにより、目的化合物の包括的な分析を行うスクリーニングシステムを構築することができました。このシステムは、ほとんどのラボの手の届くところにある低コストで定量的データを生成することができ、しかも大規模な産業環境に適合するように高度にスケーラブルです。

ルシフェラーゼ遺伝子を発現結核菌を用いた高スループットの細胞内スクリーニング 図2Aと表1はルミノメーターによって収集された生データを含む、THP-1細胞内の結核菌に対するTB薬物リファンピシンの濃度の増加の効果を示し、相対発光単位（RLU）で表しました。 図2Aは、リファンピシンの様々な濃度のためRLUで測定された生の発光の散布図です。エラーバーは平均の標準誤差（SEM）を示します。 図2Bは 、未処理ウェルと比較して、処理したウェルにおける蛍光のパーセント減少を示します。データは、リファンピシンは0.1μgの/ mLの濃度で細胞内結核菌からのRLUの&gt; 99.9％を低減することが可能であることを示しています。これはpreviouslに従ったものですyは0.1と0...

我々は、細胞内および細胞内のブロス増殖する細菌、ならびに哺乳動物宿主細胞に対する細胞毒性を標的、 結核菌に対する新規化合物を発見するためのモジュラーハイスループットスクリーニングシステムを開発しました。

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

このプロトコルの全体的な目的は、化合物がヒトマクロファージ内でのM.tuberculosisの生存にどのように影響するかを多次元的に評価することです。この手法は、ルシフェラーゼを用いた有効性試験を中心に構成されています。細胞毒性試験およびMIC試験と組み合わせることで、結核治療薬開発におけるヒット化合物の最適化に有用な情報を提供できます。本手法の主な利点は、時間と労力を削減できることです。これは、CFU（コロニー形成単位）測定法をルシフェラーゼベースの測定法に置き換えるものです。一般的に、この手法に不慣れな人は、自動化ではなく手動でのピペッティングを行う際に、再現性の確保に苦労することがあります。一貫したピペッティング技術が不可欠です。THP1細胞を完全培地を含むRPMIで培養します。継代の間、細胞密度を培地1 mLあたり0.2から100万個に維持してください。分光光度計を用いて、活発に増殖している細菌懸濁液のOD600を測定します。次に、0.1 OD600を3×10⁷ bacteria/mLとする換算係数を用いて、細菌密度を算出します。MOIが10:1となる十分な量の細菌を、新しい遠心チューブにピペットで分注します。次に、細菌を 3,000 ×g で 10 分間遠心分離してペレット化します。細菌をオプソニン化するために、450 µL の RPMI 1640 に 50 µL のヒト血清を加え、これを用いて細菌ペレットを培地 500 µL あたり 1 × 10⁸ 個の密度で再懸濁します。この混合物を 37 °C で 30 分間インキュベートします。次に、血球計数器と倒立顕微鏡を用いて、THP1細胞の培養密度を決定します。その後、滅菌済み遠心チューブ内で、細胞を100 ×g、37 °Cで10分間遠心し、ペレット化します。上清を吸引し、細胞を完全培地を含むRPMIを用い、1 × 10⁶ cells/mLの密度で再懸濁します。PMAを最終濃度40 nanograms per milliliterになるように添加します。これが分化誘導ミックスとなります。オプソニン化されたM.tuberculosisを、MOI 10:1でTHP1分化誘導ミックスと混合しました。最終混合液を96ウェル白色平底プレートの1ウェルあたり100 µLずつ分注します。その後、5%二酸化炭素を含む37 °Cの加湿インキュベーター内で、分化および感染を一晩インキュベートします。翌日、100 µLのRPMIを用いてウェルを2回洗浄します。次に、目的の濃度に希釈した化合物と、完全培地のRPMIを加えます。プレートを3日間インキュベートします。マルチチャンネルピペットを使用する際は、プランジャーをゆっくりと一定の速度で操作し、THP1細胞への影響を最小限に抑えるため、常に各ウェルの同じ位置にピペットチップ

system-for-efficacy-cytotoxicity-screening-inhibitors-targeting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオは、結核菌(Mtb)感染に対する薬の有効性を評価するためのアッセイを示しています。Mtb/マクロファージ凝集体を含むin vitro感染モデルは、in...

結核菌感染モデルに対する薬剤効果評価法

このビデオは、結核菌に対する抗生物質の有効性を決定するためのブロス内アッセイを示しています。細菌培養物は、異なる濃度の殺菌性抗生物質とインキュベートされます。殺菌効果は、レサズリンアッセイを使用して生存細菌の存在を評価することによって測定されます。...

ブロス中のマイコバクテリアに対する試験化合物の有効性の評価

ここでは、小干渉合成RNA(siRNA)、化学化合物、および 結核 菌変異体ライブラリーのハイスループット/高含有スクリーンに適用可能な表現型アッセイについて述べている。この方法は、自動共焦点顕微鏡を用いた蛍光標識された宿主細胞内の蛍光標識型 結核...

高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ

charcoal agar resazurin assay (CARA) は、複製する、複製しない、またはその両方であるマイコバクテリアに対する試験剤の活性を評価するための、半定量的で中程度のスループットの方法です。 CARAは、時間および濃度に依存する活性の迅速な評価を可能にし、コロニー形成単位(CFU)アッセイによって追求するパラメータを特定します。...

マイコバクテリアの半定量的、ミディアムスループット列挙のためのチャコール寒天レサズリンアッセイの可視化

(1)細胞内細菌性病原体を標的とする真核生物の細胞浸透性抗菌薬を同時に同定し、(2)真核生物の細胞毒性を評価するために、ハイスループットのリアルタイムアッセイが開発されました。その後、同じ技術のバリエーションをデジタル分注技術と組み合わせて、簡便で高解像度の用量反応、および 2 次元および 3...

高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性

次世代の抗結核薬の初期の医薬品開発プロセスを改善する新しいモデルとアッセイが非常に望ましいです。ここでは、結核菌に対する薬効を評価するための迅速で安価なBSL-2適合アッセイについてご説明します。このアッセイは、ハイスループットスクリーニングに容易に適応できます。...

マクロファージ継代に対する薬効を評価するために、ハイスループットアッセイの互換性<em&gt;結核菌</em

結核菌の細胞内増殖を迅速かつ効率的に定量することは 、結核(...

結核の宿主向け治療の前臨床試験に使用する自動培養システム

コロニー形成単位(CFU)の測定は、目に見えるコロニーを形成するのに数週間かかる結 核菌...

結核ワクチンの有効性評価のためのマイクロコロニー形成ユニットアッセイ

この研究では、最近作成されたダブルレポーター株を用いた マイコバクテリウム・アブセッサス...

マイコバクテリアに対するハイスループット薬物スクリーニングのためのアッセイ開発

ここでは、4-アミノキノリン化合物の化学合成、結核菌に対する最小阻害濃度の決定、哺乳類細胞株における細胞毒性の評価を含む表現型スクリーニングを通じて潜在的な抗結核薬候補を特定するプロトコルを提示します。...

潜在的な抗結核候補の同定:哺乳類細胞における合成、MIC決定、細胞傷害評価のステップバイステップガイド

学ぶルシフェラーゼベースのハイスループットスクリーニング法で、Mycobacterium tuberculosisに対する化合物の有効性と宿主細胞への細胞毒性を同時評価します。自動化により再現性が向上し、結核治療薬開発を加速します。

細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム

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