マウスからの初代肝細胞培養における炎症反応の誘導

本手順の全体的な目的は、肝急性期反応のメディエーターに対するCRPやIL6などの炎症性サイトカインの発現および分泌を研究するために、機能的なマウス肝細胞を正常に単離することです。この手法は、肝細胞機能に関する重要な疑問や、慢性腎臓病で見られるような持続的な炎症環境に対する肝サイトカインの寄与を解明するのに役立ちます。本手法の主な利点は、肝代謝物解析や炎症、および薬剤応答について、簡便かつ迅速で再現性のある分析を行うための強力なツールを提供できることです。

まず、肝灌流液と肝消化液を37°Cの水槽で予熱します。ここに示すように灌流ポンプをセットアップします。次に、肝灌流液を用いてポンプのチューブシステムを慎重に充填します。

システム内に気泡が入らないように注意してください。灌流処置に向けて定位顕微鏡を準備します。次に、テキストのプロトコルに従ってドナーマウスを麻酔し、麻酔した動物を吸収パッドの上に置きます。

粘着テープを使用してマウスの四肢を固定します。次に、マウスの腹部を剃毛し、消毒します。その後、先端が鋭い鈍的な外科用鋏を用いて、恥骨から肝臓の頭側縁まで腹側正中切開を行います。

横隔膜より尾側の位置で、腹壁の両側を切開します。滅菌綿棒を用いて腸管を慎重に右側に寄せ、下大静脈（IVC）を露出させます。先端の鋭い微細外科用剪刀を用い、肝上横隔膜を横方向に切開して胸腔を開きます。

次に、5-0のサージカルシルクを用いて胸部下大静脈（IVC）を結紮します。遮蔽付きIVカテーテルを用いて、腎下静脈（IVC）にカニュレーションを行います。灌流ポンプを接続し、肝臓の灌流を開始します。

正しく行われれば、肝臓はすぐに白濁し、腫脹し始めます。次に、精細な手術用ハサミを用いて門脈を切断し、血液と灌流液を適切に排出させます。約30 mLの肝灌流液で肝臓を灌流した後、灌流ポンプを停止させます。

培地を肝臓消化用培地に切り替え、ポンプを再稼働させます。灌流が完了したら、カニューレを取り除きます。肝臓の中央領域を慎重に露出し、肝葉を連結している結合組織を確認します。

中央の結合繊維をつかみ、肝臓を固定しているすべての組織を慎重に剥離します。その後、肝臓をゆっくりと取り出します。直ちに、15 mLの肝臓消化培地を含む50 mLポリプロピレン製コニカルチューブに臓器を移します。

細胞培養用クリーンベンチ内で、50 mLポリプロピレン製コニカルチューブから肝臓を滅菌済みの組織培養皿に移します。滅菌済みピンセットを用いて、肝臓の4つの葉を丁寧に切り裂きます。正しく行われれば、肝臓から肝細胞が遊離することにより、消化液が濁ります。

25 mLの滅菌ピペットチップを用いて、濁った消化培地を70 µmのナイロン製セルストレーナーでろ過し、新しい50 mLポリプロピレン製コニカルチューブに回収して、未消化の組織粒子と細胞残渣を除去します。回収したろ液を4°C、50 ×gで2分間遠心分離し、過剰な細胞残渣を含む上清を吸引除去した後、25 mLの冷えた1X William's Medium Eを用いて細胞を緩やかに再懸濁します。肝細胞のろ過と洗浄を3回繰り返した後、上清を吸引して過剰な細胞残渣を除去します。

一次肝細胞の解凍・播種用サプリメントを含む25 millilitersの温めた1X William's Medium Eに細胞を再懸濁し、新しい70 micrometerナイロンセルストレーナーを用いて50 milliliterコニカルチューブにろ過します。細胞数を算出した後、一次肝細胞の解凍・播種用サプリメントを含む2 millilitersのWilliam's Medium Eを用いて、コラーゲンコートした6ウェル細胞培養クラスターに播種します。細胞を飢餓状態にするために2回培地交換を行った後、無血清培地を用いて、ビークルとしてのPBS、25 nanograms per milliliterのFGF23、100 micrograms per milliliterのLPS、または50 nanograms per milliliterのIL6で細胞を処理します。

培養物を24時間インキュベートします。製造元の指示に従ってスピンカラムキットを用いてRNAを調製した後、単離したRNA 200 nanogramsをPCRチューブに加えます。次に、エンドヌクレアーゼフリーウォーター14 microlitersと逆転写酵素4 microlitersをチューブに加えます。

PCRチューブをサーモサイクラーに入れ、以下の逆転写プログラムを実行してcDNAを合成します。定量PCRを行うには、以下のQPCRマスターミックス成分を氷上のチューブに合わせます。マスターミックスをボルテックスで撹拌してください。

次に、溶液 9 µL ずつを 96 ウェルプレートの各ウェルに分注します。各ウェルに 1 µL の cDNA を慎重に添加し、1 サンプルにつき 3 ウェルを用意します。最後に、リアルタイム PCR 装置でサンプルを解析し、テキストプロトコルに従ってデータを分析します。

一次分離・培養細胞の代表的な光学顕微鏡像をここに示します。免疫細胞化学的解析により、分離された肝細胞が高レベルのアルブミンおよび線維芽細胞増殖因子受容体4を発現していることが示されています。本実験では、一次分離肝細胞をFGF23、LPS、またはIL6で24時間処理し、CRPおよびIL6のmRNAレベルを定量リアルタイムPCRによって解析しました。

LPS、IL6、およびFGF23は、CRPとIL6の発現を有意に増加させました。ここで示すように、単離した初代肝細胞の細胞培養上清を用いて、ELISAによりCRPレベルを分析しました。QPCR分析で実証されたように、PBS処理した細胞と比較して、LPS、IL6、およびFGF23処理により、細胞上清中のCRPレベルが有意に増加しました。

この手法を習得し、適切に実施できれば、わずか数時間で完了させることができます。本手順を行う際は、無菌環境を維持することが重要です。初代培養を扱うため、最適な結果を得るには、汚染の可能性を最小限に抑えることが最も重要となります。

このビデオを視聴することで、肝細胞サイトカインの発現や分泌などの様々な肝細胞機能を研究するために、マウス肝細胞を正常に単離する方法について十分に理解することができます。