Name: マウスからの初代肝細胞培養における炎症反応の誘導 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 学ぶマウス初代肝細胞の酵素分離法とELISA・リアルタイムPCRを用いた炎症性サイトカインの定量法。この手法は肝臓疾患や慢性炎症の研究に有用です。

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この作品は、NIH（R01HL128714 CF）と（KSへF31DK10236101）とアメリカ心臓協会（CFとAG）によってサポートされていました。

全ての動物プロトコルおよび実験手順は、医学のマイアミミラー科大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。 1.準備<ol><li>予熱肝臓灌流媒体および肝臓を37℃の水浴中で媒体を消化します。 </li><li>灌流ポンプ（30ミリリットル/分）を設定します。慎重に肝灌流メディアとポンプの配管システムを事前入力。システム内の任意の気泡を避け、定位顕微鏡を準備します。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って、コラーゲンタイプIを使用してコート細胞培養皿。 </li></ol> 2.肝回復<ol><li> 酸素/イソフルラン吸入（イソフルラン4％/ 2 L /分の酸素）を使用して、ドナーマウスを麻酔。 <ol><li> 2-2.5％のイソフルランを下げることによって、またはケタミンを注射することによって麻酔を維持した（100mg / kg体重の腹腔内量）およびキシラジン（体重の10mg / kgのintraperitoneally）。ケタミンは、血圧を低下させ、肝毒性を引き起こす可能性があるため、連続的なイソフルラン麻酔が好ましいです。 </li></ol></li><li>吸収パッドに麻酔マウスを置きます。粘着テープでマウスの四肢を修正しました。 </li><li>剃るとマウスの腹部を消毒し、シャープ/鈍ヒントを手術用ハサミを使用して、肝臓の頭蓋国境に恥骨から腹開腹術を行います。 、両面に振動板の尾を腹壁を切開。 </li><li>慎重に右側に腸を動かすことによって、下大静脈（IVC）を公開します。慎重に滅菌綿棒綿棒や角度のついた先端鉗子を使用して、IVCの周りの脂肪組織を解剖。 </li><li>肝上横隔膜を切開し、シャープ/鋭い先端の微細手術用ハサミを使用して、2つの横方向の切開によって胸腔を開きます。外科的な絹（5/0）を使用して胸部IVCを連結。 </li><li> 、慎重に針を取り外し、シールド静脈カテーテルを使用して、腎臓下のIVCにカニューレを挿入灌流ポンプを接続し、肝臓を灌流開始。適切に実行した場合、肝臓はすぐに白くやうねりに開始する必要があります。 </li><li>微細手術用はさみを用いて血液と灌流メディアの適切な排水を可能にする静脈ポータルを横断。 </li><li>肝灌流メディアの約30mLで肝臓を灌流し、その後メディア（30ミリリットル）をダイジェスト肝臓に切り替えます。灌流ポンプの電源をオフにして、潅流が完了したら、カニューレを削除します。 </li><li>静かに肝臓の中央領域を露出させ、肝葉を結ぶ接続する組織を検索します。中央の連結糸をつかみ、慎重に所定の位置に肝臓を保持している全ての組織を解剖し、静かに肝臓を削除します。 </li><li>直ちにメディアダイジェスト肝臓の15 mLを含む50 mLのポリプロピレン製コニカルチューブに肝臓を移します。 注：このステップの具体的なタイムラインがありません。灌流後、肝臓は、滅菌細胞培養フードへの輸送のためのダイジェスト培地に残っています。すべてですubsequent手順は無菌環境で行うべきです。 </li></ol>細胞の3単離と治療<ol><li>細胞培養フード内で無菌の組織培養皿に消化培地を含む50mLのポリプロピレン製円錐管から肝臓を移します。 </li><li>滅菌ピンセットを使用して、静かに肝臓の4ローブを引き裂きます。適切に実行した場合、消化培地が原因で肝臓から肝細胞を単離することに濁っておく必要があります。 </li><li> 25mLの滅菌ピペットチップを用いて、未消化組織粒子及び細胞破片を除去し、新しい50mLのポリプロピレン製コニカルチューブに70μmのナイロン細胞ストレーナーを介して混濁消化培地をフィルタ。 </li><li>繰り返しは、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3.2と3.3を繰り返します。これは、肝臓から残留肝細胞を除去することを支援します。 </li><li> 4°Cで2分間50×gで遠心分離します。 25 mLの冷たい1×で細胞を再懸濁静かに過剰細胞破片を含む上清を吸引し、ウィリアムズの中E. </li><li> 25mLの滅菌ピペットチップを使用して、クリーンな懸濁液を達成するために、50mLのポリプロピレン製コニカルチューブに新しい70μmのナイロン細胞ストレーナーを通して再懸濁をフィルタリングします。 </li><li>繰り返しは、より明確な細胞懸濁液を得るために、冷たいウィリアムズE培地1Xを使用して、3つの追加の洗浄のための3.5と3.6を繰り返します。 </li><li>最後の洗浄工程の後、吸引上清を過剰細胞残屑を除去しました。再懸濁し、50mLポリプロピレン製コニカルチューブに新しい70μmのナイロン細胞ストレーナーを通して初代肝細胞融解やメッキサプリメントが含まれている25 mLの暖かいウィリアムズ「メディアE 1倍でフィルタセル。 </li><li>血球計を用いて25 mLの細胞懸濁液内の細胞を数えます。成人肝あたり20万個の細胞 - 平均して15を期待しています。トリパンブルー染色を用いて細胞生存率を決定します。 </li><li>プレート初代肝細胞の融解が含まれているウィリアムズのメディアE 1×2mL中の細胞やコラーゲンコートした6ウェルCE上のサプリメントをメッキLL培養クラスター（ウェル当たり9×10 5個の細胞）。 </li><li> 4時間後、初代肝細胞の維持サプリメントが含まれているウィリアムズのメディアE 1Xにメディアを変更します。 </li><li> 24時間後、血清ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）培地で1×6時間、細胞を飢えさせます。 </li><li>ビヒクル、FGF23（25ngの/ mL）を、LPSのようにPBSで細胞を処理（100μg/ mLの）または無血清培地中のIL-6（50ng / ml）及び24時間インキュベートします。 </li></ol> RNAの4.絶縁<ol><li>製造業者の指示に従って商用スピンカラムキットを用いてRNAを調製します。 </li></ol>逆転写により単離されたRNAから5.生成するcDNA <ol><li> PCRチューブに単離されたRNAサンプルの200 ngのを追加します。 </li><li>ステップ5.1からPCRチューブにヌクレアーゼフリーH 2 Oの14μLを追加します。 </li><li>ステップ5.1からPCRチューブに逆転写酵素の4μLを追加します。 </li><li>混合物が均質にするために静かに内容を再サスペンド。遠心優しく。 </李&gt; <li>サーモサイクラーに混合物を含むPCRチューブを置きます。実行逆転写のためのサーモサイクラー：次に、25℃（5分）、42℃（30分）を1サイクル、85℃（5分）、4℃で保持します。最終生成物は、所望のcDNAになります。 </li></ol>前記定量的リアルタイムPCRによる細胞の分析（定量PCR） <ol><li> 96ウェルプレートを準備します。 <ol><li> 1μLのcDNA、0.25μMフォワードプライマー、0.25μMリバースプライマー、5μLSYBRグリーン、10μLの総容量に3.5μLのPCRグレードの水：氷の上で定量PCR反応のすべてのコンポーネントを配置します。 SYBRグリーンを使用して、三連ですべてのサンプルを実行するには、マスターミックスを準備します。 </li><li>マスターミックスが完了すると、渦は、均質作ります。 96-WLLプレートの各ウェルにアリコート9μL定量PCRのマスターミックス。後、慎重に各ウェルにcDNAの1μLを追加します。総反応容量10μLになるであろう。 </li><li>ローディングが完了した後、光を用いて、96ウェルプレートをシール接着フィルム、短時間遠心分離、96ウェルプレート（1分間50×gで）。 </li></ol></li><li> リアルタイム-PCR機器で実行したサンプル。リアルタイム-PCR機器に封入し、96ウェルプレートを置き、機器ごとにメーカーの推奨事項として、サンプルを実行します。標準および高速サイクルの例は、以下に含まれています。 <ol><li> 60秒間、15秒間、その後、120秒間94℃、60℃を94℃の40サイクルを最初の変性、その後、必要に応じて、4℃で保持する：標準的なサイクリングパラメータは、以下を使用します。 </li><li>高速サイクリングパラメータの場合：5秒、15秒58℃、10秒間、その後72℃、その後、30秒、95℃の40サイクルを94℃での初期変性：以下を使用します。 </li></ol></li><li>データを分析する方法に関するガイダンスについては、機器のマニュアルを参照してください。 </li></ol> ELISAによる細胞上清の7.分析注：すべての手順は、メーカーのプロトコルに従って行われます。 </P&gt; <ol><li> 試料調製 <ol><li>別々のチューブに希釈剤の398μLを分注します。 398μLの希釈剤チューブに細胞上清サンプルのピペット2μL。これは、200の希釈倍数を提供します。 </li><li>テストされる各サンプルの手順を繰り返し7.1.1。 </li></ol></li><li> 手順 <ol><li> 200倍希釈したサンプルと、96ウェルプレートのウェルに標準100μLを加えます。 </li><li> 150rpmでマイクロプレートシェーカー上で45分間、25℃で96ウェルプレートをインキュベートします。 </li><li>ウェルを1×洗浄緩衝液で5回洗浄します。最後の洗浄が完了すると、吸収紙を持つすべての残留洗浄液を除去します。 </li><li>各ウェルにHRPコンジュゲート試薬500μLを追加します。 </li><li> 7.2.3 - を繰り返して、7.2.2を繰り返します。 </li><li>テトラメチル100μLを加える（TMB）を、96ウェルプレートの各ウェルに試薬。 </li><li>穏やかにマイクロプレート上に20分間、25℃で96ウェルプレートを混ぜます150rpmでシェーカー。直接各ウェルに停止液100μLを加えて反応を停止し、穏やかに混合します。停止液が追加されると色が黄色に変わります。これは、停止液を正しく混合されたことを通知します。 </li><li>マイクロタイタープレートリーダーを用いて、最初の5分以内に450 nmでの光学密度を決定します。 </li></ol></li><li> 結果の計算 <ol><li>各サンプルおよび各標準の平均吸光度値（450）の表を計算します。 </li><li>線形グラフにNG / mLの中でその標準濃度に対する各標準のA 450平均値をプロットすることにより標準曲線を組み立てます。 450の値を表すために濃度、y軸を表すx軸を許可します。 </li><li>各希釈サンプルから450の平均利用して、標準曲線からNG / mLの所望のタンパク質の濃度を決定します。 </li><li>事実上の希釈によって試料濃度を掛けrを。これは、細胞上清試料中の所望のタンパク質の実際の濃度を決定することを可能にします。 </li><li>折れ線グラフにサンプルから構成されたテーブルをプロットします。 OD 450の値は、標準曲線の外になった場合、サンプルが適切に希釈されるべきであり、再試験しました。 </li><li> 500,000個の細胞に結果を正規化します。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Silverstein, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+chronic+kidney+disease%3A+role+in+the+progression+of+renal+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Nephro%22%5BJournal%5D)">Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease.</a> Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).</li>
<li>Isakova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+23+is+elevated+before+parathyroid+hormone+and+phosphate+in+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 23 is elevated before parathyroid hormone and phosphate in chronic kidney disease.</a> Kidney Int. 79 (12), 1370-1378 (2011).</li>
<li>Faul, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF23+induces+left+ventricular+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">FGF23 induces left ventricular hypertrophy.</a> J Clin Invest. 121 (11), 4393-4408 (2011).</li>
<li>Gutiérrez, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+23+and+mortality+among+patients+undergoing+hemodialysis%5BTitle%5D)+AND+%22N+England+J+Med%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 23 and mortality among patients undergoing hemodialysis.</a> N England J Med. 359 (6), 584-592 (2008).</li>
<li>Munoz Mendoza, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+23+and+Inflammation+in+CKD%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 23 and Inflammation in CKD.</a> Clin J Am Soc Nephrol. 7 (7), 1155-1162 (2012).</li>
<li>Hanks, L. J., Casazza, K., Judd, S. E., Jenny, N. S., Gutiérrez, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+Fibroblast+Growth+Factor-23+with+Markers+of+Inflammation%2C+Insulin+Resistance+and+Obesity+in+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Associations of Fibroblast Growth Factor-23 with Markers of Inflammation, Insulin Resistance and Obesity in Adults.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0122885(2015).</li>
<li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+23+directly+targets+hepatocytes+to+promote+inflammation+in+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 23 directly targets hepatocytes to promote inflammation in chronic kidney disease.</a> Kidney Int. , 1-12 (2016).</li>
<li>Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enzymatic+preparation+of+isolated+intact+parenchymal+cells+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver.</a> J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).</li>
<li>Moshage, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+interleukin-1%2C+interleukin-6+and+its+interrelationship+on+the+synthesis+of+serum+amyloid+A+and+C-reactive+protein+in+primary+cultures+of+adult+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioch+Biophysi+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The effect of interleukin-1, interleukin-6 and its interrelationship on the synthesis of serum amyloid A and C-reactive protein in primary cultures of adult human hepatocytes.</a> Bioch Biophysi Res Commun. 155 (1), 112-117 (1988).</li>
<li>Soldatow, V. Y., LeCluyse, E. L., Griffith, L. G., Rusyn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+for+liver+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro models for liver toxicity testing.</a> Toxicol. Res. 2 (1), 23-39 (2013).</li>
<li>Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Human+Hepatocytes+by+a+Two-step+Collagenase+Perfusion+Procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li>
<li>Kegel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+Isolation+of+Primary+Human+Hepatocytes+and+Corresponding+Major+Populations+of+Non-parenchymal+Liver+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>Moshage, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+and+the+hepatic+acute+phase+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cytokines and the hepatic acute phase response.</a> J Pathol. 181 (3), 257-266 (1997).</li>
<li>Klaunig, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+liver+cell+culture.+I.+Hepatocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro%22%5BJournal%5D)">Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation.</a> In vitro. 17 (10), 913-925 (1981).</li>
<li>Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1782563/">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).</li>
<li>Schmidt-Arras, D., Rose-John, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-6+pathway+in+the+liver%3A+From+physiopathology+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">IL-6 pathway in the liver: From physiopathology to therapy.</a> J Hepatol. 64 (6), 1403-1415 (2016).</li>
<li>Grabner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Cardiac+Fibroblast+Growth+Factor+Receptor+4+Causes+Left+Ventricular+Hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Activation of Cardiac Fibroblast Growth Factor Receptor 4 Causes Left Ventricular Hypertrophy.</a> Cell Metab. 22 (6), 1020-1032 (2015).</li>
<li>Shulman, M., Nahmias, Y. Chapter 17, Long-Term Culture and Coculture of Primary Rat and Human Hepatocytes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShulman%2C+M+%22Methods+Mol+Biol%22">Methods Mol Biol</a>. 945, 287-302 (2012).</li>
</ol>

著者は宣言するために利害の競合を持っていません。

マウスからの初代肝細胞を分離することにより、ex vivoでの炎症反応を研究するために、高速、安価で信頼性の高いツールです。正しく実行した場合、結果は容易に生成され、タイムリーかつ費用効率的な方法で再生することができます。以下の点を慎重に成功した絶縁を確保するために評価されるべきです。 外科的切開とIVCのカニュレーションは、全身麻酔下ではなく、安楽死の後に行われるべきです。若い、経験の浅い研究者はマウスの腹部の解剖学的特徴に慣れるため、正しいカニュレーションを実行するために初めに多くの時間が必要になります。灌流開始するまで生きてドナー動物を維持、大幅に単離された細胞の生存率を増加します。それが大幅に単離された肝細胞の収量を増加させるため、超肝IVCのライゲーションを行うべきです。代替的に、マイクロ手術用クランプは、IVC上に配置することができます。しかし、開胸以下、動物には数分以内に故人となります。したがって、後続のすべてのステップは、肝臓は灌流の開始までに十分な血流を維持することを確実にするために速やかに実施すべきです。カニュレーションについ...

慢性腎臓病（CKD）は、急性および慢性炎症1の状態として定義することができます。 CKDを有する患者において、phosphaturicホルモン線維芽細胞増殖因子23（FGF23）の血清レベルは、徐々に、血清リン酸塩のホメオスタシス2を維持するために上昇します。増加した血清FGF23レベルは独立して、血液透析治療3、4を始めている患者の間で心血管疾患の罹患率と死亡率に関連付けられています。さらに、いくつかの臨床研究が上昇FGF23レベルおよびC反応性タンパク質（CRP）、インターロイキン6（IL-6）および腫瘍壊死因子α（TNFα）5、6の血清レベルの間に強い相関関係を示しています。また、実験的研究では、我々は、FGF23直接肝細胞を標的とし、CRPおよびIL-6 Pを増加させることにより炎症反応を引き起こすことができることが最近実証されています肝臓7でroduction。したがって、FGF23は、CKDにおける全身性炎症に貢献する循環因子として作用することがあります。 70年代初めには、初代肝細胞を単離し、初めて8のために勉強しました。それ以来、初代培養肝細胞が広範囲に代謝処理、ホルモン機能、薬物代謝および毒性を調べるだけでなく、免疫および炎症反応9、10に使用されてきました。以前のプロトコルは、主に、ヒト肝組織11、12からの一次肝細胞の酵素の単離を記載しています。優れたモデルが、これは複雑な肝臓のシグナル伝達機構と同様に刺激の異なる種類に応じて機能的結果にどのように影響するかを遺伝子操作研究する能力を残します。以下では、我々は、マウス初代肝細胞の単離を記載しています。注目すべきことに、このようなリポ多糖（LPS）、IL-6及びFGF23などの肝臓の急性期反応のいくつかのメディエーターの効果は、簡単、迅速かつ再現可能な方法13で解析することができます。 ここで、我々は、成体マウスからの肝細胞の酵素を単離するためのプロトコルを提示し、我々はそのようなLPSおよびIL-6などの炎症の確立された誘導物質、ならびにFGF23としての新規炎症性メディエーターは、直接の発現および分泌を刺激することができることを実証していますこのような培養肝細胞におけるCRPおよびIL-6などの炎症性サイトカイン、。

<table><tbody><tr><td><ストロング>消耗品</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー70 &mu;m ナイロンセルストレーナー</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard</td><td>BD</td><td>381412</td><td></td></tr><tr><td>50 mL ポリプロピレン コニカルチューブ</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>100 6インチ コットンチップ アプリケーター&nbsp;</td><td>ピューリタン</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>1cc U-100インスリン注射器28 G 1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329420</td><td></td></tr><tr><td>組織培養皿100 x 20 mmスタイル</td><td>コーニング</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル細胞培養</td><td>クラスターCostar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>5/0ブラック編組外科用シルク(100ヤード)</td><td>LOOK</td><td>SP115</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minipuls 3灌流ポンプ</td><td>ギルソン</td><td>F155007</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤キット、Propper</td><td>VWR</td><td>48300-474</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤カバーグラス、Propper</td><td>VWR</td><td>48300-470</td><td></td></tr><tr><td>外科用ハサミ - シャープ/ブラント</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>アイリスハサミ-タフカットストレート</td><td>F.S.T.</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>デュモン SS-45 フォーセプス</td><td>F.S.T.</td><td>11203-25</td><td></td></tr><tr><td>学生組織鉗子</td><td>FST</td><td>991121-12</td><td></td></tr><tr><td>名前<</td><td>strong>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酢酸溶液、2.0N</td><td>シグマ</td><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;A8976-100ML</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン、USP 250mL</td><td>ピラマルヘルスケア</td><td>&nbsp;&nbsp;66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL)</td><td>VEDCO</td> <td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;50989-161-06</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン 100 mg/mL</td><td>AnaSed 注射剤</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>Willams' Medium E (1x)</td><td>gibco</td><td>12551-032</td><td></td></tr><tr><td>肝臓灌流培地 (1x)</td><td>gibco</td><td>17701-038</td><td></td></tr><tr><td>Liver Digest Medium (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>17703034</td><td></td></tr><tr><td>一次肝細胞の解凍とめっきサプリメント</td><td>Life Technologies</td><td>CM3000</td><td></td></tr><tr><td>一次肝細胞維持サプリメント</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>CM4000</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) pH 7.4</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン 1型</td><td>コーニング</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルーソリューション</td><td>VWR</td><td>45000-717</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスからの初代肝細胞培養における炎症反応の誘導

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

肝臓は、全身性炎症の調節において決定的な役割を果たしています。特に慢性腎臓病では、肝臓は尿毒症環境、酸化ストレス、内毒素血症および急性期反応物質を大量に製造することにより炎症性サイトカインを循環させる減少クリアランスに応じて反応します。炎症や肝細胞の根本的な役割を研究するための実験的なツールは、特に、慢性腎臓病などの複雑な設定で、全身の急性期応答および長期の炎症誘発性シナリオに肝臓のサイトカインの調節および貢献を理解することが重要です。 生体内で炎症の複雑なメカニズムを研究することは困難なままであるため、通常はリソースを大量に消費するとは、トランスジェニック動物の使用を必要とし、第一の単離肝細胞は、肝臓の急性期反応に機構的洞察を得るための強力なツールを提供しています。このインビトロ技術は、中程度のコストを提供していますので、高い再生産性および技術常識には、一次単離された肝細胞はまた、容易にスクリーニング手法として使用することができます。ここでは、初代マウス肝細胞を単離するために、酵素ベースの方法を記載し、そして我々は、ELISAおよび定量的リアルタイムPCRを用いて、これらの細胞における炎症反応の評価を記述する。

組織学一次単離および培養された細胞の代表的な光学顕微鏡像を、 図1Aに示されています。免疫細胞化学分析は、単離された肝細胞は非常アルブミン（赤）、ならびに線維芽細胞増殖因子受容体4（FGFR4）（緑色）を発現することを示しています。核は4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）（青）で染色します。 （ 図1B）。 定量的リアルタイムPCR 主要な単離された肝細胞を、定量的リアルタイムPCRによって分析したCRPおよびIL-6の24時間およびmRNAレベルのFGF23（25 ngの/ ml）のLPS（100μg/ mLの）またはIL-6...

ここでは、成体マウスからの初代肝細胞を単離するための酵素的アプローチを示し、我々は、ELISAおよびリアルタイムPCRを使用して炎症反応の定量化を記載します。

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

本手順の全体的な目的は、肝急性期反応のメディエーターに対するCRPやIL6などの炎症性サイトカインの発現および分泌を研究するために、機能的なマウス肝細胞を正常に単離することです。この手法は、肝細胞機能に関する重要な疑問や、慢性腎臓病で見られるような持続的な炎症環境に対する肝サイトカインの寄与を解明するのに役立ちます。本手法の主な利点は、肝代謝物解析や炎症、および薬剤応答について、簡便かつ迅速で再現性のある分析を行うための強力なツールを提供できることです。まず、肝灌流液と肝消化液を37°Cの水槽で予熱します。ここに示すように灌流ポンプをセットアップします。次に、肝灌流液を用いてポンプのチューブシステムを慎重に充填します。システム内に気泡が入らないように注意してください。灌流処置に向けて定位顕微鏡を準備します。次に、テキストのプロトコルに従ってドナーマウスを麻酔し、麻酔した動物を吸収パッドの上に置きます。粘着テープを使用してマウスの四肢を固定します。次に、マウスの腹部を剃毛し、消毒します。その後、先端が鋭い鈍的な外科用鋏を用いて、恥骨から肝臓の頭側縁まで腹側正中切開を行います。横隔膜より尾側の位置で、腹壁の両側を切開します。滅菌綿棒を用いて腸管を慎重に右側に寄せ、下大静脈（IVC）を露出させます。先端の鋭い微細外科用剪刀を用い、肝上横隔膜を横方向に切開して胸腔を開きます。次に、5-0のサージカルシルクを用いて胸部下大静脈（IVC）を結紮します。遮蔽付きIVカテーテルを用いて、腎下静脈（IVC）にカニュレーションを行います。灌流ポンプを接続し、肝臓の灌流を開始します。正しく行われれば、肝臓はすぐに白濁し、腫脹し始めます。次に、精細な手術用ハサミを用いて門脈を切断し、血液と灌流液を適切に排出させます。約30 mLの肝灌流液で肝臓を灌流した後、灌流ポンプを停止させます。培地を肝臓消化用培地に切り替え、ポンプを再稼働させます。灌流が完了したら、カニューレを取り除きます。肝臓の中央領域を慎重に露出し、肝葉を連結している結合組織を確認します。中央の結合繊維をつかみ、肝臓を固定しているすべての組織を慎重に剥離します。その後、肝臓をゆっくりと取り出します。直ちに、15 mLの肝臓消化培地を含む50 mLポリプロピレン製コニカルチューブに臓器を移します。細胞培養用クリーンベンチ内で、50 mLポリプロピレン製コニカルチューブから肝臓を滅菌済みの組織培養皿に移します。滅菌済みピンセットを用いて、肝臓の4つの葉を丁寧に切り裂きます。正しく行われれば、肝臓から肝細胞が遊離することにより、消化液が濁ります。25 mLの滅菌ピペットチップを用いて、濁った消化培地を70 µmのナイロン製セルストレーナーでろ過し、新しい50 mLポリプロピレン製コニカルチューブに回収して、未消化の組織粒子と細胞残渣を除去します。回収したろ液を4°C、50 ×gで2分間遠心分離し、過剰な細胞残渣を含む上清を吸引除去した後、25 mLの冷えた1X William's Medium Eを用いて細胞を緩やかに再懸濁します。肝細胞のろ過と洗浄を3回繰り返した後、上清を吸引して過剰な細胞残渣を除去します。一次肝細胞の解凍・播種用サプリメントを含む25 millilitersの温めた1X William's Medium Eに細胞を再懸濁し、新しい70 micrometerナイロンセルストレーナーを用いて50 milliliterコニカルチューブにろ過します。細胞数を算出した後、一次肝細胞の解凍・播種用サプリメントを含む2 millilitersのWilliam's Medium Eを用いて、コラーゲンコートした6ウェル細胞培養クラスターに播種します。細胞を飢餓状態にするために2回培地交換を行った後、無血清培地を用いて、ビークルとしてのPBS、25 nanograms per milliliterのFGF23、100 micrograms per milliliterのLPS、または50 nanograms per milliliterのIL6で細胞を処理します。培養物を24時間インキュベートします。製造元の指示に従ってスピンカラムキットを用いてRNAを調製した後、単離したRNA 200 nanogramsをPCRチューブに加えます。次に、エンドヌクレアーゼフリーウォーター14 microlitersと逆転写酵素4 microlitersをチューブに加えます。PCRチューブをサーモサイクラーに入れ、以下の逆転写プログラムを実行してcDNAを合成します。定量PCRを行うには、以下のQPCRマスターミックス成分を氷上のチューブに合わせます。マスターミックスをボルテックスで撹拌してください。次に、溶液 9 µL ずつを 96 ウェルプレートの各ウェルに分注します。各ウェルに 1 µL の cDNA を慎重に添加し、1 サンプルにつき 3 ウェルを用意します。最後に、リアルタイム PCR 装置でサンプルを解析し、テキストプロトコルに従ってデータを分析します。一次分離・培養細胞の代表的な光学顕微鏡像をここに示します。免疫細胞化学的解析により、分離された肝細胞が高レベルのアルブミンおよび線維芽細胞増殖因子受容体4を発現していることが示されています。本実験では、一次分離肝細胞をFGF23、LPS、またはIL6で24時間処理し、CRPおよびIL6のmRNAレベルを定量リアルタイムPCRによって解析しました。LPS、IL6、およびFGF23は、CRPとIL6の発現を有意に増加させました。ここで示すように、単離した初代肝細胞の細胞培養上清を用いて、ELISAによりCRPレベルを分析しました。QPCR分析で実証されたように、PBS処理した細胞と比較して、LPS、IL6、およびFGF23処理により、細胞上清中のCRPレベルが有意に増加しました。この手法を習得し、適切に実施できれば、わずか数時間で完了させることができます。本手順を行う際は、無菌環境を維持することが重要です。初代培養を扱うため、最適な結果を得るには、汚染の可能性を最小限に抑えることが最も重要となります。このビデオを視聴することで、肝細胞サイトカインの発現や分泌などの様々な肝細胞機能を研究するために、マウス肝細胞を正常に単離する方法について十分に理解することができます。

induction-an-inflammatory-response-primary-hepatocyte-cultures-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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マウスからの初代肝細胞培養における炎症反応の誘導

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