March 1st, 2017
我々は、in vivoでのライブ生物発光およびSJL / Jマウスにおける多発性硬化症の実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルにおける視神経炎や脳炎の近赤外イメージングのための技術を示します。
このイメージング技術の全体的な目標は、生きているマウスの多発性硬化症のEAEモデルで視神経炎と脳の炎症を視覚化し、定量化することです。この方法は、EAEや多発性硬化症の経過に影響を与える新しいメカニズムなど、神経免疫学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、EAE誘発視神経炎と脳の炎症を、疾患の経過を通じて生きたマウスで観察および定量化できることです。
この手法の意味は、EAEスコアからは明らかにならない薬物の影響を観察できるため、治療にまで及びます。この手順では、PTXを1x PBSに1ミリリットルあたり2マイクログラムで溶解し、よく混合します。次に、マウスに 100 マイクロリットルの PLP/CFA を、短いイソフルラン麻酔中に尾の付け根に 2 回皮下注射します。
背中の上部や首の皮膚の免疫反応が頭や脊髄のイメージングを妨げるため、首の後ろに注射しないでください。免疫化後1〜2時間後、マウスに100マイクロリットルのPTXを腹腔内に注入します。次に、免疫化の24時間後に、マウスに100マイクロリットルのPTXを再度注入します。
対照マウスの場合、尾の付け根にPLPなしのCFA100マイクロリットルを2回注入します。予防接種後7日目から、標準的なスコアリングシステムに従って毎日臨床症状を評価します。マウスが1より大きいスコアに達した場合(これは免疫後10日目から12日目頃に発生します)、疾患の発症時に最初のイメージングを実行します。
次に、初期症状が現れてから約1〜2日後の病気のピーク時に2回目の画像検査を行い、1〜3日間続きます。その後、マウスは7〜10日以内に完全に回復します。インターバル中の画像検査では、まだ血管の漏出が見られることがありますが、炎症の指標は陰性であるべきです。
in vivoイメージングを行うには、すべてのイメージング手順でマウスを2%〜2.5%イソフルラン麻酔下に保ちます。装置内で2匹のマウスを互いに隣り合わせに配置し、マウスの上部の背骨を中央に配置します。次に、免疫部位を黒い布でシールドします。
画像キャプチャ用のソフトウェアを開き、カメラを初期化します。次に、ベースライン画像を撮影して、マウスの正しい位置を評価します。次に、カメラまでの距離が6.5センチメートルのBフォーカスを使用して、すべての画像をキャプチャします。
その後、すぐに使用できる化学発光試薬を40ミリグラム/ミリリットルで混合してから、シリンジを充填します。次に、100マイクロリットルをマウスに腹腔内に注入し、注入の5分後、10分後、および15分後に生物発光画像を撮影します。この手順では、生物発光解析ソフトウェアを開きます。
上部のメニューバーで、[ファイルブラウザ]アイコンをクリックします。実験フォルダーのディレクトリに移動してファイルを開き、実験に関連する説明を表示する列を構成します。品質管理のためには、EAEの症状がないノンレスポンダーマウスのファイルをクリックするか、ナイーブマウスをクリックしてEAE信号の特異性を確認してください。
シグナルの特異性をさらに制御するために、各マウスのプローブ注入前のベースライン画像を確認します(これは陰性である必要があります)。画像を選択するには、最初のEAEマウスの最初のファイルをクリックし、生物発光強度と局在を確認します。すべての画像を1つずつ確認します。
定量化には、各マウスのシグナルが最も強い画像を使用します。画像を調整してエクスポートするには、定量化する最初のファイルをダブルクリックします。[オプション]ボタンの下に新しくポップアップ表示されたウィンドウで、各画面に表示するラベルをカスタマイズします。
右側のツールパレットで、[画像調整]に移動します。デフォルトでは、最小強度と最大強度は auto に設定され、虹色の擬似色で表示されます。必要に応じて、[手動] を選択して設定を変更します。
次に、[画像のエクスポート]をクリックし、PNG、ディレクトリ、および画像名を選択します。関心領域の定量化については、ツールパレットのROIツールにアクセスしてください。ROIの方法とROIの数を選択します。
画像ウィンドウ内の ROI ウィンドウで、ROI のサイズと位置を調整します。自動ROIツールを使用する場合は、すべての画像に同じROIしきい値を使用します。ROIのサイズと位置が手動で定義されている場合は、すべての画像に同じ領域を使用します。
その後、[Measure ROI] をクリックします。新しいポップアップウィンドウで実験の詳細の列をカスタマイズし、保存します。準備ができたら、すべてを選択し、表をコピーしてスプレッドシートに貼り付けます。
その後、ROIを配置したPNGとして画像をエクスポートします。次に、画像ファイルを保存して閉じます。以下は、EAE導入後10日目と14日目に画像化された2匹のSJL/Jマウスの例です。
眼の周りの生物発光シグナルは10日目に最も高く、マウスが回復し始めると消失しました。この棒グラフは、10日目と14日目の生物発光シグナルの定量化を示していますが、臨床EAEスコアはここに示されている。この図では、各群の5匹のマウスの生物発光画像は、R-フルルビプロフェンで治療されたマウスで視神経炎を減少させた投薬の効果を示しています。
ROIにおける総生物発光カウントの定量化により、有意な治療効果が確認されました。この手法を習得すると、画像化するマウスの数にもよりますが、2〜3時間で完了します。この手順を試みた際には、白いマウスを使用し、臨床EAEコースを注意深く観察することを忘れないでください。
この手順に続いて、FACS分析や免疫組織化学などの他の方法を実行して、脊髄の免疫細胞浸潤などの追加の質問に答えることができます。ビデオを見た後、生物発光イメージングを使用して多発性硬化症のEAEモデルで視神経炎と脳の炎症を評価する方法について十分に理解しているはずです。
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この研究は、生きているSJL/Jマウスにおいて、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルの多発性硬化症における視神経炎と脳炎症を可視化し定量化する、生体内ライブ生物発光と近赤外線イメージングの技術を提示します。
Non-invasive bioluminescence and near-infrared imaging in the EAE mouse model enables real-time quantification of optic neuritis and brain inflammation, surpassing traditional clinical scoring. This approach provides actionable insights into disease progression and therapeutic efficacy, supporting predictive confidence at key discovery and preclinical inflection points. The method enhances translational continuity for neuroinflammatory disease portfolios by enabling robust, quantitative, and longitudinal assessment of CNS pathology in vivo.
This imaging platform integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation in neuroinflammatory disease pipelines.