磁気ビーズを使用した機械的張力に応答して細胞表面接着リフォームの分析

この実験の全体的な目標は、リガンド被覆磁気マイクロビーズを使用して張力に応答して活性化される生化学的経路を探索し、接着受容体に強制的に適用することです。この方法は、エクスプレスヘロメトリクスによる機械的張力がどのように分化から彼らを導くか、または組織のコンプライアンスがどのようにそれらの変換を促進するかなど、メカニックトランザクション分野の質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ビーズを使用して接着受容体の特定のサブセットに張力を加えることにより、多くの細胞を化学分析のために刺激できることです。

まず、超常磁性トシル活性化ビーズを元のバイアルに少なくとも30秒間ボルテックスして完全に再懸濁します。再懸濁した超常磁性ビーズの40マイクロリットルを、1ミリリットルの0.1モルリン酸ナトリウムpH pH 7.4を含む1.5ミリリットルの微量遠心チューブに分注します。次に、チューブを磁気分離スタンドに置き、磁気ビーズを溶液から分離します。

上清を捨て、チューブを磁気分離スタンドから取り出します。ビーズを1ミリリットルの0.1モルリン酸ナトリウムpH 7.4に再懸濁します。ビーズを2回洗浄した後、ビーズを同じバッファーの1ミリリットルに再懸濁します。

次に、100 μgのウシフィブロネクチンまたはその他の細胞接着受容体リガンドをビーズとボルテックスに組み合わせます。ネガティブコントロールのために、リガンドをBSA、ポリ-D-リジン、またはアポトランスフェリンに置き換えて、この手順を繰り返します。ビーズをリガンド含有溶液とローター上で摂氏37度で12〜24時間インキュベートします。

反応が起こった後にビーズ凝集体が現れた場合は、10〜20秒以内で超音波処理してください。次に、磁気分離スタンドを使用してビーズを分離し、残りの溶液を吸引します。次に、0.2%ウシ血清卵白を添加したPBS溶液1ミリリットルを加えます。

ローターで37°Cで1時間インキュベートします。磁石を使用して、0.2%ウシ血清卵白を添加した1ミリリットルのPBS溶液でビーズを2回洗浄します。それらを同じバッファーの1ミリリットルに再懸濁する前に。

凝集体が20〜30秒以内に現れる場合は、ビーズを超音波処理します。細胞アッセイに進むか、ビーズを摂氏4度で最大1ヶ月間保存してください。60 mmLの組織培養皿で接着細胞を適切な増殖培地で80%の密度に達するまで培養します。

配位子被覆ビーズをペレット化した後、0.2%ウシ血清卵白を添加したPBS溶液1ミリリットルにペレットを再懸濁します。100マイクロリットルの配位子被覆ビーズ溶液を5ミリリットルの温かい培地とボルテックスに加えます。次に、60ミリリットルの培養皿で培地を吸引し、ビーズを添加した5ミリリットルの温かい成長培地を追加します。

懸濁液を細胞培養条件下で20分間インキュベートし、ビーズが沈殿して細胞に付着するのを待ちます。ビーズは食作用によって内在化される可能性があるため、20分を超えないことが重要です。次に、10Xまたは20X対物レンズを使用して、光学顕微鏡でビーズを観察します。

皿を少し振ってビーズの付着を確認し、付着したビーズと浮いているビーズを区別します。通常の60mm培養皿の蓋の上面に丸い38mmネオジム磁石を置き、蓋の下面に配置された2つの小さな13mmネオジム磁石を使用して所定の位置に保持します。張力をかけた細胞を、所望の時点および細胞培養条件でインキュベートします。

通常の皿の蓋をマグネット付きの蓋に交換します。磁石は非常に強力なので、慎重に操作してください。処理後、皿を氷の上に置き、皿から培地全体を慎重に吸引します。

300マイクロリットルの細胞溶解バッファーを加え、氷上で10分間インキュベートします。次に、セルスクレーパーを使用してライセートを回収し、事前に冷却した1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。磁気分離スタンドを使用して磁気ビーズをペレット化し、全細胞ライセートを新しい予冷済みの1.5ミリリットル微量遠心チューブに移します。

ビーズ分離後に得られた全細胞ライセートから15 μリットルのアリコートをウェスタンブロット分析のために取り出します。ビーズを1ミリリットルの氷冷溶解バッファーで3回洗浄します。次に、50マイクロリットルのサンプルバッファーをビーズペレットに加えます。

懸濁液をボルテックスで混合した後、ドライブロックヒーターを使用して摂氏95度で5分間煮沸します。この画分には、単離された接着錯体が含まれています。生化学分析に進むか、画分を摂氏マイナス20度で保存します。

この図は、接着複合体の精製を示すために示されています。GAPDHイムノブロッティングは、全細胞ライセートのローディングコントロールとして、また接着複合体の純度を確認するために使用されます。精製された接着複合体画分に細胞質シグナルが存在しないことを確認するために、長時間のばく露を使用しました。

フィブロネクチン被覆ビーズを使用して、張力に応答して接着複合体で経時的に発生するメカノトランスダクションプロセスを調査しました。接着錯体画分の磁気分離後、ライセートと接着錯体画分をウェスタンブロットで分析しました。ローディングコントロールと、機械的張力に応答して接着複合体で動員またはリン酸化されることが知られている候補を免疫ブロットしました。

張力は接着複合体へのパキシリン動員に影響を及ぼさなかったが、チロシン31に対するそのリン酸化は、全細胞溶解物および接着複合体画分の両方における機械的張力に応答して増強された。このビデオを見れば、磁気ビーズを使用して接着表面タンパク質に張力を加える方法について十分に理解できるはずです。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2時間で完了できます。

この手順を試みるときは、強力な磁石に注意することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、ウェスタンブロット、アクチン重合アッセイ、酵素アッセイなどの生化学的研究を実施して、キナーゼ活性が張力によって制御されているかどうかなどの追加の質問に答えることができます。この技術は、細胞生物学の分野の研究者が細胞内の磁気感受性シグナル伝達経路を探索するのに役立つ可能性があります。