Name: 膵管注入:薬物およびウイルス送達の有効かつ選択的な方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: 学ぶ膵管注入法によるマウスを用いた系譜追跡と遺伝子導入技術。慢性膵炎、糖尿病、膵がんなどの膵臓疾患研究における標的治療開発への応用可能性を探る。

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著者は謝辞を持っていません。浙江省保健家族計画財団(グラント20146242)と温州科学技術局(Grant Y20140248)から資金が寄せられた。

すべての動物実験は、ピッツバーグ小児病院の動物研究・ケア委員会とピッツバーグ大学の施設動物ケアと使用委員会によって承認されました。
1. 術前準備
<ol><li>吸入イオブルラン(1 - メンテナンス時は3%、誘導では最大5%)を鼻コーンを介して適切な麻酔レベルに投与する。鉗子とつまみつまみによって麻酔の妥当性を監視する。応答の欠如は十分であると考えられ、呼吸抑制が起こる可能性があるため、過剰に投薬しないようにしてください。</li>
	<li>動物を背中に置いて、顕微鏡の解剖ステージに置き、腹部を目的の観点から中心にします。手術用テープで動物を固定化します。麻酔下で乾燥を防ぐために、動物の目に眼科軟膏を適用します。</li>
	<li>脱毛クリームの滑らかで厚い層を適用し、3分間所定の位置に残します。小さな部分で脱毛を確認してください。クリームと髪を70%エタノール浸しガーゼでそっと拭き取ります。</li>
	<li>70%エタノール浸しガーゼ、続いてベタジン浸しガーゼで拭いて動物の腹部を浄化し、消毒します。外科的処置を通して生殖不能状態を維持する。</li>
</ol>2. 適切な露出
<ol><li>皮膚に中線切開を行い、皮膚の中傷をメスを用いて、キシフォイドプロセスから臍に切開します。Adson鉗子で腹を持ち上げ、はさみを使って中線に小さな穴を開けます。</li>
	<li>腹膜切開を皮膚切開の長さに伸ばし、中線(リネアアルバ)に残るように注意する。 注:これは上の中腹腹腔内手術を生成します。</li>
	<li>一般的な胆管を露出する鈍いレトラクターで肝臓を高めます。湾曲したブルドッグの血管クランプで共通の胆管をクランプします。 注:この操縦は、肝臓への望ましくない注入を防ぎます。</li>
</ol>3. 膵乳頭・十二指腸切毛術の同定
<ol><li>十二指腸を識別し、アルガ鉗子で、乳頭を表示するためにそれを大きく引き込みます。 注:乳頭は十二指腸の第2の部分の前表面の白い斑点です。</li>
	<li>十二指腸を大きく引き込み、膵管の経過を同定することを可能にする。301/2ゲージ針で、乳頭の真向かいにある十二指腸の壁を正接的に穿刺する。 注: 針は十二指腸に入るダクトと同じ角度に従う必要があります。</li>
</ol>4. 輸液。
<ol><li>カテーテルがダクト内に見えるまで、ステップ3.2で作成した十二指腸切欠切を通してカテーテルを通過させます。カテーテルをダクトに1cm以下に進め、副管支流のバイパスを防ぎます。</li>
	<li>2番目の湾曲したブルドッグの血管クランプでカテーテルを所定の位置にクランプします。ポンプの電源を入れ、選択したボリュームを注入します。注入される容積は25~250μLの範囲で、理想的な体積は約150μLです。</li>
	<li>約1.5mLの腹腔内注射を行い、損失を相殺します。乾燥を防ぐために湿ったガーゼで露出した腸を覆います。</li>
	<li>注入の終わりに、カテーテルを所定の位置に保持していたブルドッグクランプを取り外す。ブルドッグクランプを使用して、膵管からカテーテルを静かに取り外します。共通の胆管からクランプを解放します。</li>
	<li>実行中の縫合糸を使用して、腹と皮膚を1つまたは2つの層で閉じます。 注:十二指腸切剖学は、単独で封印するので、閉じる必要はありません。</li>
	<li>術後鎮痛として、処置中に5mg/kgでケトフェンの用量を投与し、翌日に1回投与する。</li>
	<li>マウスが回復するまで、ヒートランプの下のケージにマウスを戻します。マウスに食べ物と水のアドリビタムを提供します。</li>
	<li>胸骨の不参せを維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。完全に回復するまで、手術を受けた動物を他の動物の会社に返却しないでください。</li>
</ol>5. サンプルの準備
<ol><li>動物を二酸化炭素室に入れるか、子宮頸部脱臼を行う。</li>
	<li>膵臓を収穫します, コントロールとして脾臓, 肝臓, 十二指腸.4°Cで一晩パラホルムアルデヒドで組織を固定します。 前に説明した30%のショ糖でサンプルを一晩で凍結保護する、6.</li>
	<li>サンプルをスナップフリーズします。ミクロトームを使用して、6 μmの厚さの組織を切り離します。前述の7のように、蛍光イメージングを用いて顕微鏡でイメージングを行う。</li>
</ol>

<ol><li>Gittes, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+biology+of+the+pancreas%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review.</a> Dev Biol. 326 (1), 4-35 (2009).</li>
<li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage%3A+NGN3%2B+cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).</li>
<li>Weinberg, N., Ouziel-Yahalom, L., Knoller, S., Efrat, S., Dor, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+evidence+for+in+vitro+dedifferentiation+but+rare+proliferation+of+mouse+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing evidence for in vitro dedifferentiation but rare proliferation of mouse pancreatic beta-cells.</a> Diabetes. 56 (5), 1299-1304 (2007).</li>
<li>Raper, S. E., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+in+vivo+gene+transfer+and+expression+in+normal+rat+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated in vivo gene transfer and expression in normal rat pancreas.</a> Pancreas. 12 (4), 401-410 (1996).</li>
<li>Xiao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cell+tracing%2C+lineage+tagging+and+targeted+genetic+manipulations+in+multiple+cell+types+using+pancreatic+ductal+infusion+of+adeno-associated+viral+vectors+and%2For+cell-tagging+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cell tracing, lineage tagging and targeted genetic manipulations in multiple cell types using pancreatic ductal infusion of adeno-associated viral vectors and/or cell-tagging dyes.</a> Nat Protoc. 9 (12), 2719-2724 (2014).</li>
<li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27587395">EGFR signaling regulates beta cell proliferation in adult mice.</a> J Biol Chem. 291 (43), (2016).</li>
<li>Xiao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M2+macrophages+promote+beta-cell+proliferation+by+up-regulation+of+SMAD7%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">M2 macrophages promote beta-cell proliferation by up-regulation of SMAD7.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1211-E1220 (2014).</li>
<li>Laukkarinen, J. M., Van Acker, G. J., Weiss, E. R., Steer, M. L., Perides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+acute+biliary+pancreatitis+induced+by+retrograde+pancreatic+duct+infusion+of+Na-taurocholate%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">A mouse model of acute biliary pancreatitis induced by retrograde pancreatic duct infusion of Na-taurocholate.</a> Gut. 56 (11), 1590-1598 (2007).</li>
<li>Lichtenstein, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10834702">Acute lung injury in two experimental models of acute pancreatitis: infusion of saline or sodium taurocholate into the pancreatic duct.</a> Crit Care Med. 28 (5), 1497-1502 (2000).</li>
<li>Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+acute+biliary+pancreatitis+induced+by+retrograde+infusion+of+bile+acids+into+the+mouse+pancreatic+duct%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct.</a> Nat Protoc. 5 (2), 335-341 (2010).</li>
<li>Guo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+transduction+and+labeling+of+pancreatic+ducts+by+targeted+recombinant+viral+infusion+into+mouse+pancreatic+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Specific transduction and labeling of pancreatic ducts by targeted recombinant viral infusion into mouse pancreatic ducts.</a> Lab Invest. 93 (11), 1241-1253 (2013).</li>
<li>Xiao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin3+activation+is+not+sufficient+to+direct+duct-to-beta+cell+transdifferentiation+in+the+adult+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Neurogenin3 activation is not sufficient to direct duct-to-beta cell transdifferentiation in the adult pancreas.</a> J Biol Chem. 288 (35), 25297-25308 (2013).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

この研究は、膵臓に遺伝子やその他の分子を特異的かつ効果的に送達するための効果的なマウスモデルである膵管注入の背後にある方法論を詳細に説明する。さまざまなグループ間の手順の詳細におけるあいまいさは、標準化されたプロトコル8、9、10の必要性を強調した。
処置のいくつかの重要なステップがあります, 若いから始まる, 健康なマウスの選択.十二指腸の穿フォーマは、どんなに小さく、制御されたが、間違いなく炎症性サイトカインおよび完全に特徴付けられていない他の要因の募集につながるマウスの外傷性事象である。したがって、カテーテルの導入のために可能な最小の十二指腸切除術を作成しているように、繊細な解剖が重要である。全体のプロシージャの最も重要なステップは、送達システムと膵管の缶取です。
膵乳頭の過度の破壊によって困難が生じ、圧倒的な全身炎症反応を引き起こす。...

膵臓は、内分泌および外分泌成分の両方を有する二機能器官である。多くの病理は、糖尿病、膵炎、および膵臓癌1を含む膵臓を苦しめる可能性がある。これら3つの疾患はすべて、即時治療を開発するだけでなく、病態生理をよりよく理解するために、研究の活発な分野をマークします。
標的治療的送達方法は有益であろう。我々は、膵臓細胞への薬物およびウイルス送達に有効かつ選択的な方法である膵管注入技術を開発した。このモデルでは、膵管は選択的にカニューレ化され、共通の胆管は閉塞され、膵臓への送達のみを可能にする。
この技術は、膵臓の発達および病理2、3に重要な発達経路をさらに解明するために、特定の細胞型の系統トレースを可能にする。ウイルスベクターにおける異なるプロモーターは、細胞株の特異的標的化を可能にし、これらの細胞株4、5に遺伝子を導入することを可能にする。この研究は、GFPを発現するウイルスベクターと偽手術を発現するウイルスベクターの膵管注入後の膵臓内の緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現を実証する。

<table><tbody><tr><td>マウス (25-30g, 8-12週齢)</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketofen</td><td>Henry Schein Inc.</td><td>5487</td><td></td></tr><tr><td>エタノール(70%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34923</td><td></td></tr><tr><td>滅菌生理食塩水</td><td>バクスターヘルスケア株式会社</td><td>2B-13-00</td><td></td></tr><tr><td>保護具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>の毛の取り外しプロダクト</td><td></td><td></td><td>Nairまたはトリマー</td></tr><tr><td>ガーゼパッド2inx 2in</td><td>フィッシャーヘルスケア</td><td>22-362-178</td><td></td></tr><tr><td>針(30.5Gおよび25G)</td><td>Becton Dicksinson and Co.</td>ケトフェンと生理食塩水ベクトンディクシンソンアンドカンパニーのための<td>305106と305122</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポンプ用309657シリンジ</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010.200V0</td><td></td></tr>輸<tr><td>液ポンプ</td><td>ポンプシステム株式会社</td><td>NE-1000</td><td></td></tr>輸<tr><td>液カテーテル</td><td>ワールド精密機器</td><td>CMF31G</td><td></td></tr><tr><td>湾曲ブルドッグクランプ (2)</td><td>Roboz</td><td>RS-7439</td><td></td></tr><tr><td>アルガ鉗子</td><td>Roboz</td><td>RS-5163</td><td></td></tr><tr><td>Adson 鉗子</td><td>Roboz</td><td>RS-5234</td><td></td></tr><tr><td>ニードルホルダー</td><td>Roboz</td><td>RS-7882</td><td></td></tr><tr><td>シザー</td><td>ロボズ</td><td>RS-5982</td><td></td></tr><tr><td>綿の先端のアプリケーター</td><td>の医者の販売およびサービス</td><td>22-9988</td><td></td></tr>の<tr><td>解剖顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>の縫合</td><td>糸Owensおよびマイナー</td><td>SXMD1B402</td><td></td></tr></tbody></table>

膵管注入:薬物およびウイルス送達の有効かつ選択的な方法

Pancreatic Duct Infusion: An Effective and Selective Method of Drug and Viral Delivery

膵臓は、内分泌成分と外分泌成分の両方を有する二官能器官である。多くの病理は、糖尿病、膵炎、膵臓癌を含む膵臓を苦しめることができます。これら3つの疾患はすべて、即時治療を開発するだけでなく、病態生理をよりよく理解するために、研究の活発な分野をマークします。これらの研究分野をさらに進めるツールはほとんどありません。膵管注入は、系統トレース、遺伝子導入、および細胞ライン特異的ターゲティングを可能にする重要な技術です。この技術は、十二指腸とアンペアの第2部分の複雑な解剖を必要とし、続いて胆管の閉塞と膵管のカヌル化を伴う。このテクニックは最初は技術的に難しいですが、アプリケーションは無数です。グループ間の手順の詳細におけるあいまいさは、標準プロトコルの必要性を強調した。本研究は、GFPを発現するウイルスベクターの膵管注入後の膵臓内の緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現と偽の手術を説明する。注入は、それゆえに発現は膵臓に特異的であり、他のどの組織タイプにも発現が存在しない。

練習と慎重な外科技術では、これらのマウスの生存率は95%を超える必要があります。注入の1週間後、所望の効果は膵臓で明らかであるべきです。10~12週齢のマウスを膵管注入に利用した。ここでは、偽の手術と比較して、CMVプロモーターを有するアデノ関連ウイルス血清型8(AAV8)を用いて緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現させる。マウス膵臓は、注入の7日後に収穫した。膵臓、脾臓、十二指腸の切片をインスリン抗体とHoeschtで染色した。 図1 は、AAV8で膵管注入を受けたマウスの膵臓全体に、偽の手術を受けたマウスとは対照的に広範囲に及ぶGFPの発現があることを示している。これらのマウスには肝臓、脾臓、十二指腸に発現がなく、したがって注入の選択的性質を文書化する。これらのデータは、DNAおよびRNA発現プロファイルを含む他のいくつかの方法で確認することができる。
<img alt="Figure 1"...

膵管注入は、系統トレース、遺伝子導入、および細胞ライン特異的ターゲティングを可能にする重要な技術です。ここでは、膵臓細胞への薬物およびウイルス送達のための膵管注入技術を紹介する。

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, ...

この膵管注入手順の全体的な目標は、膵臓における系統トレース、遺伝子導入、および細胞株特異的ターゲティングを可能にすることです。この方法は、慢性膵炎、糖尿病、膵臓癌を含む膵臓に影響を与える疾患に関する重要な質問に答えるのに役立つ可能性があります。まず、麻酔をしたマウスを解剖顕微鏡の下に置き、腹部が視野の中心に配置されるようにします。動物を手術用テープで固定化し、眼科軟膏を目に塗布して乾燥を防ぎます。次に、マウスの腹部を抜毛クリームの厚い層で覆います。約3分後、70%エタノールに浸したガーゼでクリームを軽く拭き取り、すべての髪を取り除きます。最後に、70%エタノールで皮膚を拭き、続いて10%ポビドネヨウ化溶液を取り除き、皮膚を消毒します。手術を開始するには、シフォイドプロセスから臍に及ぶ正中線皮膚切開をメスで作成します。その後、Adson鉗子を使用して、腹骨を持ち上げ、はさみで小さな正中の穴を作ります。腹骨の正中線に沿ってカットを展開し、その長さが皮膚切開の長さに等しくなるようにします。次に、鈍いレトラクタを使用して肝臓を引き上げ、一般的な胆管を露出させた後、湾曲したブルドッグの血管クランプでクランプします。十二指腸を識別し、アルガ鉗子で、十二指腸の第2部分の前表面に白い斑点として見える乳頭を表示するために、それを大胆に引き出します。膵管を識別するには、十二指腸を尾指尾から引き出し、30-1/5ゲージの針を十二指腸に正接的に配置し、乳頭の真向かいにある壁に穿刺を行います。溶液を注入するには、作成された十二指腸切除術を通して注入ポンプに接続されたカテーテルを導入し、それが容器内に見えるまでダクトに沿ってそれをスライドさせるが、マイナーな管支線をバイパスしないように1センチメートル以上に達しない。2つ目の湾曲したブルドッグの血管クランプでカテーテルを固定します。次にポンプをオンにして、150マイクロリットルの溶液をダクトに注入します。次に、注入された体積の損失を避けるために生理食塩水の約1.5ミリリットルのマウスの腹膜に注入し、乾燥を防ぐために湿らせたガーゼで露出した腸を覆う。注入が完了したら、固定化されたカテーテルを解放し、ブルドッグクランプを使用して、膵管からそっと取り出します。次に、共通の胆管からクランプを解放します。腹膜と皮膚を単層で連続的に縫合して閉じ、2回の鎮痛剤のうちの最初の用量を投与し、そのうちの2回目は翌日に与えられる。その後、ヒートランプの下に置いたケージにマウスを戻し、食べ物と水のアドリビタムを動物に提供します。胸骨の不通に現れる十分な意識を取り戻すまで、マウスを観察する。手術の7日後、安楽死させた動物膵臓からの切除、脾臓、肝臓、十二指腸がコントロールとして機能する。4%パラホルムアルデヒド溶液に全ての分離組織を浸し、一晩摂氏4度で固定します。組織が固定されたら、クライオは一晩摂氏4度で30%スクロース溶液に浸してサンプルを保護します。一晩のクライオ保護の後、液体窒素でサンプルを凍結し、ミクロトームを使用して、6マイクロメートルで組織切片を切断します。最後に、蛍光顕微鏡下で切片を画像化します。ここでは、GFP遺伝子を運ぶAAV8の恥手術と膵管注入の7日後にマウスから切除された膵臓切片の顕微鏡画像です。AAV8を注入したマウスから分離した肝臓、脾臓、十二指腸はGFPシグナルを示さなかったが、膵臓は顕著なGFP発現を明らかにし、膵管注入後のウイルスの膵臓特異的送達を確認した。一度習得すると、この技術は、適切に実行すると10分で行うことができます。この手順を実行している間、慎重に解剖を行い、カテーテルの導入のために可能な限り小さな十二指腸切除術を行うことが非常に重要です。その開発後、この技術は、膵臓を研究している研究者が、げっ歯類とより大きな動物モデルの両方で慢性膵炎、糖尿病、膵臓癌を含む臓器を苦しめる多くの病理を調査する道を開いた。このビデオを見た後、あなたは効果的かつ選択的に膵管を注入する方法の非常に良い理解を持っている必要があります。

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低アタッチメントプレートで調製されたヒト擬似スイスレットにおけるレンチウイルス媒介遺伝子サイレンシング

膵臓内イメージングウィンドウを用いたマウスモデルにおける膵臓の細胞レベル可視化におけるビ ボ における縦方向の安定化

本研究は、マウス膵臓から機能的な一次膵島および腺皮細胞を効率的に抽出する簡略化された方法を開発し、急性膵炎誘発性糖尿病の病因における細胞間コミュニケーションの研究に貴重なツールを提供しました。...

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