示差同位体で標識された姉妹ヒストンとヌクレオソームの再構成

この生化学的プロトコルの全体的な目的は、姉妹ヒストンをそれぞれ異なる同位体で標識したヌクレオソームを生成することです。これにより、両方の姉妹ヒストンにおける翻訳後修飾反応を同時にマッピングすることが可能になります。本プロトコルの目的は、姉妹ヒストンを個別に同位体標識したヌクレオソームを作製し、両姉妹ヒストンの翻訳後修飾を同時にマッピングすることです。

本手法を、質量分析などの翻訳後修飾をマッピングする高解像度技術と組み合わせることで、対称的に修飾されたヌクレオソームの形成にどのようなメカニズムが寄与しているかという、クロマチン生物学における重要な問いに対処することができます。本手法の主な利点は、標準的なヌクレオソーム再構成プロトコルと一般的なタンパク質精製法を組み合わせているため、生化学研究室で容易に確立できることです。オクタマーの再構成には、2つのヒストンH3プールを使用します。

アミノ末端にポリヒスチジンタグを持つ15N標識H3、およびアミノ末端にストレプトアビジン親和性タグを持つ13C標識H3を用意します。この手順は、2種類のヒストンH3を含む凍結乾燥したヒストンの分注試料を、変性バッファーで溶解することから始めます。約5 mgのヒストンを含む各チューブに1 mLの変性バッファーを加え、ピペッティングで混合します。ただし、ボルテックスミキサーは使用しないでください。

チューブを氷上に30分間置き、完全にアンフォールディングさせます。次に、280ナノメートルにおける吸光度を測定し、各ヒストンの正確な濃度を決定します。2つのヒストンH3プールをそれぞれ50%ずつ含めることに留意して、コアヒストンを等モル比で混合します。

アンフォールディングバッファーを用いて、最終タンパク質濃度が約1 mg/mLになるように調整します。混合物を6 kDaカットオフの透析膜に移し、4 °Cで冷却した1〜2 Lのリフォールディングバッファーに対して透析を行います。

翌日、透析した試料を回収し、マイクロ遠心機を用いて4°C、最大回転数で5分間遠心分離し、沈殿物を除去します。オクタマー濃度を測定後、分画分子量10 kDaの遠心ろ過ユニットを用いて、オクタマーを最終容量約2 mLまで濃縮します。これにより、50〜100 µMのオクタマー濃度が得られるはずです。

ゲルろ過カラムをFPLCシステムに接続し、ゲルろ過の準備を行います。0.22 µmフィルターでろ過し脱気したリフォールディングバッファーを用いて、2カラムボリューム（CV）分で平衡化します。濃縮した試料を1 mL/minの流速で注入し、1〜1.5 mLずつ分画して回収します。

本手順を開始するために、純粋なオクタマーを含む ilgili 分画をまとめ、前述の方法で濃度を決定します。1 mLのニッケルニトリロ三酢酸（またはニッケルNTA）カラムをFPLCシステムに接続します。そして、0.22 µmでろ過し脱気したリフォールディングバッファーを、流速1 mL/minで10 CV分流して平衡化させます。

精製したオクタマーを、流速 1 mL/min でニッケルNTAに通します。フロースルーを回収してください。250 mM イミダゾールを含むリフォールディングバッファー 10 CV を用い、流速 1 mL/min で溶出させます。

ニッケルNTA溶出液を回収します。ストレプトアビジンを用いた精製は、理想的にはコールドルームで行ってください。バッチ式重力フロー法を用いて、250 millimolar イミダゾールを含むリフォールディングバッファー10 CVで、市販のストレプトアビジン1 milliliterアフィニティーカラムを平衡化します。

ニッケルNTA溶出液をストレプトアビジンアフィニティーカラムに通します。フロスルー（通り抜け画分）を回収してください。2.5 millimolarのdesthiobiotinを含むリフォールディングバッファー10 CVで溶出します。

溶出液を回収します。溶出液中のoctamer濃度を測定した後、TEV proteaseを10倍希釈量で添加し、4°Cで一晩反応させます。翌日、混合液を50 kDaカットオフの透析膜に移し、リフォールディングバッファーに対して4°Cで一晩透析します。

精製した非対称オクタマーを、分画分子量 10 kilodalton の遠心フィルターユニットを用いて、1〜2 mL の容量まで濃縮します。期待されるオクタマー濃度は 20〜50 micromolar です。ヌクレオソームの再構成には、ヌクレオソームポジショニング配列を含む DNA が必要です。

5 M 塩化ナトリウムストック溶液を用いて、DNAの塩濃度を2 M 塩化ナトリウムに調整します。小規模テストで決定した最適なオクタマー対DNA比に従って、DNAをオクタマーおよびリフォールディングバッファーと混合します。塩濃度が2 Mより低い状態でオクタマーとDNAが混合する可能性を防ぐため、最後にオクタマーを添加してください。

混合物を分画分子量 6 kDa の透析膜に移し、1 L のリフォールディングバッファーを用いて 4 °C で一晩透析します。翌日、透析バッファーの塩濃度を段階的に下げます。各塩化ナトリウムバッファーにサンプルを少なくとも 3 時間保持してください。

次に、透析膜を1 Lのアッセイバッファーが入ったビーカーに移し、4 °Cで一晩透析を継続します。翌日、透析後のサンプルを回収します。マイクロ遠心分離機を用い、4 °C、最大回転数で5分間遠心分離し、形成された沈殿物を除去します。

30 kilodalton分画分子量限りの遠心ろ過ユニットを用いて、サンプルを最終的に約300 microlitersに濃縮する。260 nanometersでDNA濃度を測定する。最終濃度は10から20 micromolarの範囲である必要がある。

サンプルを4°Cで最大数週間保存します。リフォールディングしたヒストン混合物のゲルろ過溶出プロファイルでは、ヒストン八量体が約70 mLで溶出することが示されています。SDS-PAGEゲルにより、正しいヒストンの化学量論比が確認されます。

3種類のオクタマーを含む再構成オクタマープールを、タンデムアフィニティー精製スキームに供します。非対称種の単離は、アフィニティータグの存在によって確認されます。その後、TEVプロテアーゼを用いてアフィニティータグを除去します。

DNAとオクタマーのモル比を変化させて小スケールのヌクレオソーム再構成を行ったところ、1:1の比率が最適であることが示された。最適化したDNAとオクタマーのモル比を用いて大スケールのヌクレオソーム再構成を行い、4つのコアヒストンの正しい化学量論が確認された。異なる同位体で標識したヌクレオソームのNMR分光法により、窒素15標識および炭素13標識されたシスターH3ヒストンの存在が確認された。

このアプリケーション例では、同位体で差別的に標識され、ヒストンH3のC ring 10が非対称にリン酸化されたヌクレオソームを、GCN5アセチル転移酵素と反応させました。そして、両方のH3コピーにおけるヒストンH3リシン14のアセチル化を、NMR分光法を用いてリアルタイムで追跡しました。解析の結果、ヒストンH3のC ring 10のリン酸化は、transよりもcisにおいて、GCN5によるヒストンH3リシン14のアセチル化を促進することが明らかになりました。

この手法を習得すれば、適切に実施することで5日間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、異なる特徴を持つ姉妹ヒストンを含むヌクレオソームを再構成する方法について、十分に理解できるはずです。