誘導性一過性トランスフェクションを介して制御可能なイオンチャネルの発現

この手順の全体的な目標は、細胞培養の長時間の合併症を回避しながら、異種系でのイオンチャネル発現を制御する便利な方法を提供することです。これにより、実験間の条件を制御し、より再現性の高い結果を生成する方法が提供されます。この方法は、イオンチャネル分野の研究を促進するのに役立ちます。

薬理学におけるチャネル特性の特性評価など。現在の方法は複雑であるか、一貫性のないタンパク質発現を示しているためです。この技術の主な利点は、個々の実験に合わせた多種多様なタンパク質の発現レベルを比較的短時間で制御できることです。

この手順を開始するには、TREX 293細胞をウェルあたり0.9ミリリットルのフルDMEMで調製した12ウェルプレートに移し、50%のコンフルエンシーを生成します。そして、CO2インキュベーターで細胞を摂氏37度で一晩インキュベートします。次に、ここに示す目的遺伝子であるDMEM、不活性プラスミドであるTRPV1、および脂質トランスフェクション試薬からなるトランスフェクション混合物を調製する。

電気生理学的実験では、トランスフェクションカクテルに哺乳類発現プラスミド中のEGFPを含めて、トランスフェクションが成功した細胞を可視化します。トランスフェクション混合物を室温で30分間インキュベートします。次に、トランスフェクション混合物を12ウェルプレートの播種細胞に滴下して細胞をトランスフェクションします。

プレートを激しく揺さぶって、DNAとトランスフェクション試薬が均一に分散するようにします。その後、トランスフェクションした細胞を摂氏27度で一晩インキュベートします。翌朝、電気生理学を行う場合は、UVランプの下でEGFPの蛍光シグナルを観察して、細胞がうまくトランスフェクションされたことを確認します。

電気生理学を行う場合は、12ウェルプレートからPDLコーティングされたカバースリップに細胞を移し、500マイクロリットルのフルDMEMに入れます。カルシウムイメージングを行う場合は、PDLコーティングされたカルシウムイメージングチャンバーに約20, 000個の細胞をスポットします。この手順では、二重蒸留水で1ミリグラム/ミリグラムのドキシサイクリンストック溶液を調製します。

ストック溶液を摂氏4度の光から最大3週間保護します。長期保存の場合は、ドキシサイクリンストック溶液を摂氏マイナス20度に保ちます。.次に、完全なDMEMで新鮮なドキシサイクリン溶液を調製します。

そして、摂氏37度まで温めます。電気生理学的記録のために、500マイクロリットルのドキシサイクリン溶液を1ミリリットルあたり2マイクログラムで各ウェルにピペットで移し、1ミリリットルあたり1マイクログラムのドキシサイクリンの最終濃度を作ります。カルシウムイメージングでは、各ウェルに100マイクロリットルのドキシサイクリン溶液を1ミリリットルあたり3マイクログラムで追加して、1ミリリットルあたり1マイクログラムのドキシサイクリンの最終濃度にします。.

サンプルを所望の時間インキュベートし、摂氏37度、CO2を5%で誘導します。カルシウムイメージングでタンパク質発現をキャリブレーションするには、リンゲル溶液を調製し、摂氏37度に温めます。AMエステルを分散させるために、水性溶液中のFura-2などのフルーセントイオンインジケーターは、DMSO中の非イオン性F-127の溶液を調製します。

非イオン性のF-127が溶解するまで、溶液を摂氏27度に加熱します。その後、非イオン性のF-127溶液を室温で保存し、再度摂氏37度に温めてから使用してください。その後、リンゲル溶液からFura-2 AMローディング溶液を調製し、2〜3マイクロモルのFura-2 AM、02ミリグラム/ミリリットルの非イオン性F-127、および10ミリモルのD-グルコースを添加します。

次に、チャンバー内の細胞から培地を吸引し、Fura-2 AMローディング溶液と交換します。暗所で室温で60分間細胞をインキュベートします。その後、Fura-2 AM溶液を吸引します。

そして、Ringer'sと10ミリモルダーD-グルコース溶液で細胞を洗浄し、余分な細胞色素を除去します。それぞれに200マイクロリットルのリンゲルと10ミリモルのD-グルコース溶液を残します。.そして、それを暗所で室温で30分間インキュベートします。

30分後、チャンバーを顕微鏡のノーズピースの上のステージに置き、ホルダーで固定します。次に、TRPV1特異的アゴニストカプサイシンの使用濃度を計算し、最終的な所望濃度に従って調製します。次に、ランプ、カメラ、顕微鏡の電源を入れ、Fura-2フィルターを選択して510ナノメートルの波長での発光を検出します。

希望の倍率に調整し、顕微鏡のノブを使用してこれらのパラメータを操作して、選択したフィールドに細胞を集中させます。暗闇では、背景光を差し引き、露光時間を設定します。画像サンプリングを希望のレートに設定します。

次に、Fura-2をロードした細胞を340ナノメートルと380ナノメートルの波長で励起することにより、Fura-2をロードした細胞の蛍光応答を記録することから始めます。340対380のシグナルの比率は、細胞内カルシウム濃度の指標であり、したがってTRPV1活性の指標でもあります。続いて、200マイクロリットルのリンガー溶液に2マイクロモルカプサイシンを添加して、TRPV1の発現レベルを評価し、TRPV1応答を分析するために、1マイクロモルカプサイシンの最終飽和濃度を作成します。

シングルチャンネル録音の理想的な誘導時間を決定するには、まずバスとピペット溶液を準備します。次に、10〜12メガオームの抵抗に火で磨かれたガラスピペットを準備します。対象細胞の膜にシールを作成することにより、全細胞パッチクランプを行います。

その後、保持電位を負の40ミリボルトに設定します。そして、負圧を加えて膜を破裂させます。その後、マイクロマニピュレーターを使用して、メブレーンパッチの入ったピペットを細胞から持ち上げます。

次に、メンブレンパッチを含むピペットのすぐ隣にプロフュージョンシステムを配置します。ベッセルフィルターと出力ゲインをそれぞれ2〜5キラハルツと10アンペアに下げます。その後、アゴニストの飽和濃度をメンブレンパッチに大量に塗ります。

次に、細胞に適用された誘導時間に対して正常に記録されたシングルチャネルパッチの数を分析し、目的の結果に従って誘導時間を調整します。ここに示されているのは、カプサイシン適用前と適用後、RTRPV1を一過性に発現するTREX 293細胞の疑似カラー画像です。また、トランスフェクションしたTREX 293細胞の細胞内カルシウム濃度の経時変化を示します。

各グラフは平均 50 個のセルを表します。TRPV1録音におけるシングルチャンネルパッチの成功率は、誘導時間に依存します。これは、誘導の2時間後と4時間後にRTRPV1を一過性に発現するTREX 293細胞からのパッチの現在のトレースです。

また、このプロットは、指定された誘導時間後のパッチ内のチャネル数を示しています。この技術により、トランスフェクションが適切に行われれば、トランスフェクション後12時間以内に発現が制御されたタンパク質を分析できます。この手順を試みる際には、さまざまなタンパク質のトランスフェクション濃度と誘導時間を標準化することを覚えておくことが重要です。

このビデオを見れば、選択したイオンに対して時間効率の良い方法で制御可能な発現系を作製する方法を十分に理解できるはずです。