Name: 誘導性一過性トランスフェクションを介して制御可能なイオンチャネルの発現 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学ぶ誘導性一過性トランスフェクションによるイオンチャネル発現制御法。TREX293細胞を用いて、ドキシサイクリン誘導でタンパク質発現レベルを精密に調節し、電気生理学実験の再現性を向上させる手法です。

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この作品は、イスラエル科学財団[助成1721年から1712年、1368年から1312年、および1444年から1416年]（APへの）によってサポートされていました。 APはBrettlerセンターとDavid R.ブルームセンター、薬局の学校、エルサレムのヘブライ大学と提携しています。

1.ベクターの抑制性サイトに目的の遺伝子を連結<ol><li>このようなpcDNA5 / FRT / TOまたはのpcDNA4 / TOなどの誘導性ベクターを取得します。 </li><li>また、 インシリコ DNA解析ソフト4によって選択されたベクターのマルチクローニングサイトで紹介されている遺伝子の途中で任意の潜在的影響を受けやすいの制限部位のために目的の遺伝子を分析します。 </li><li>標準的なオーバーラップPCR法を用いて、4（目的の遺伝子に見出されていない）は、2つの選択された制限酵素認識部位を用いて目的の遺伝子に隣接する、開始コドンの前に挿入された第一、及び停止コドンの後に第二。 </li><li>ベクターの両方を消化し、自己を回避するためにわずか30分ベクトル反応に一単位ウシ腸ホスファターゼ（CIP）を加え、続いて1時間酵素」作業温度で（ステップ1.2で選択した）制限酵素でインサートライゲーション。 </li><li>1％アガロースゲル上に消化されたDNAをロードし、電気泳動9によって切断されたセグメントを分離します。 </li><li> UV光を使用して、ブレードとベクトルの所望のセグメントを含むゲルの部分をカットし、ライゲートさせるべき挿入します。 </li><li> （市販のDNA抽出キットを用いて）アガロースゲル片からDNA断片を抽出し、260nmで分光光度計により、その最終濃度を測定します。 </li><li> 20分間室温でT4リガーゼ酵素を使用して、誘導性選択されたベクターに目的の遺伝子を連結。インサートのモル比1：ベクターの挿入は、ベクターと連結する確率を高めるために、3を使用します。制御のために、ベクターのみを含んでライゲーション反応を準備します。 </li><li>細菌の形質転換のために、50μLのコンピテント大腸菌にベクター単独とベクトル+遺伝子の10 ngのを追加します。 42℃で45秒間インキュベートし、氷上で30分間チューブをインキュベートします。すぐに戻って置きます2分間氷上で500μLのLB培地に形質転換された細菌を移します。 220rpmで攪拌しながら37℃で1時間インキュベートします。 </li><li>首尾よく形質転換された細菌の選択のために、適切な抗生物質を含む準備されたLB寒天プレート上に（1.9で説明したように）各反応のプレート100μL（ 例えば 、100μg/ mLのアンピシリンのpcDNA4 / TRを使用した場合）。 </li><li> 37℃で一晩成長させます。プレートをしっかりプラスチックパラフィンフィルムでそれらを包むことにより、最大2週間4℃で保存することができます。 </li><li> 10μLチップを用いて個々のコロニーを持ち上げ、そして220rpmで撹拌下、37℃で+抗生物質培地3mLのLB中で一晩成長させます。目的のDNAを持つ細菌は、11,000×gでLBや細菌を遠心分離し、上清を吸引することにより、短期記憶のために（-20℃）で凍結することができます。長期保存は-80℃でグリセロールストックとして細菌を凍結する必要があります。 </li><li> throu DNAを抽出GHミニプレップおよび260nmの5で分光光度計による最終濃度を測定。 </li><li>精製された構造物4を配列決定することにより、目的の遺伝子の挿入が成功を確認してください。あるいは、カットセグメントを分離し、その存在と長さを評価するために電気泳動を使用して、制限酵素によって構築物の診断的消化は、この端部4に利用することができます。 </li></ol> TetRを表現2.培養細胞株<ol><li>彼らのゲノムDNAに組み込まれたTetリプレッサープラスミドを細胞培養株を得ます。ここでプロトコルを例としてpcDNA6 / TRプラスミドをヒト胚性腎臓293T細胞（HEK-293T）を使用して書き込まれます。 </li><li>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で100mmの組織培養プレート中の種子細胞を、10％FBS、1％ペニシリン - ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、および25mM HEPES、pHが7.3を補充した（本明細書中で完全DMEM）およびOをインキュベート37時/ N＃176; C、5％CO 2。細胞を用いたすべての作業は、滅菌条件下で、生物学的フード内で行われるべきです。 </li><li> 、Tetリプレッサー遺伝子の発現を維持培地を吸引お​​よび5μg/ mLのブラストサイジンを補充した完全DMEMでそれを置き換えるために。 37℃で、5％CO 2で細胞をインキュベートします。 </li><li>細胞は80達すると - 90％のコンフルエンシーに、培地を吸引し、穏やかに（カルシウムおよびマグネシウムを含まない）DPBSで細胞を2回洗い、37℃に加温しました。 </li><li>穏やかに機械的損傷を引き起こすことなく細胞を持ち上げるために、0.05％トリプシンを含有するDMEM中で培養物をインキュベート1.5分間、37℃に加温しました。 </li><li>完全DMEMの等量トリプシン作用を遮断します。細胞を穏やかに持ち上げ、滅菌チューブにそれらを転送するために、上下にピペットと。 </li><li> 5分間、200×gで細胞を遠心。 </li><li>上清を吸引し、1mLの完全DMEMと交換してください。ノーまで上下細胞で溶液をピペット細胞塊を見ることができます。カウントおよび血球計を用いて細胞数を算出します。 </li><li>種子1 - 2×10 5 / mlのブラストサイジンを用いて12mLの完全DMEMを含む100mm組織培養皿で6細胞。彼らは90％の密集度に達するとして、週に2回、細胞を分割します。 </li></ol> 3.の細胞に、目的のプラスミドをトランスフェクション<ol><li> 50％コンフルエント（〜200,000細胞）を作成し、CO 2で37℃で一晩インキュベートするために十分な、0.9 mLの完全DMEMで調製し、12ウェルプレート中のウェルに上記のように細胞を分割するのと同じ方法で、転送細胞を用いインキュベータ。 </li><li> pcDNA4でトランスフェクション混合物を準備/目的の遺伝子を含むことに、不活性プラスミドは最終容量100μLにする（必要な場合）を1μg、3μL脂質トランスフェクション試薬およびDMEMに全DNA量をもたらすために。異なるタンパク質は、異なる効率で発現させるように使用されるプラスミドDNAの最適量は、広く変化します。当選者のためのrophysiological実験は、成功したトランスフェクション4を受ける細胞を可視化するために、トランスフェクションカクテルで哺乳動物発現プラスミド中のEGFPが含まれます。 </li><li>室温で30分間トランスフェクション混合物をインキュベートします。 </li><li> 12ウェルプレートに播種した細胞上に滴下し、トランスフェクション混合物をピペッティングすることにより細胞をトランスフェクトし、DNAとトランスフェクション試薬の均一な分散を確実にするために激しく板岩。細胞は、トランスフェクション時〜80％コンフルエントであるべきです。 </li><li> 37℃でトランスフェクトした細胞O / Nをインキュベートし、5％のCO 2。 </li><li>細胞が正常に電気を行う場合は、次の朝、UVランプの下でEGFPの蛍光シグナルを観察することによってトランスフェクションしたことを確認します。 </li></ol>ポリ-D-リジン（PDL）4.めっき細胞カバースリップ/ウェルズ<ol><li> 70％イソプロピルエタノール溶液でdousingによって12ミリメートルカバースリップを滅菌します。ドライと単一coverslを配置電気生理学的記録のための24ウェルプレートの各ウェルでip。 </li><li>カルシウムイメージング室の各カバースリップまたはウェルの上に0.2mg / mLのPDLソリューション - 0.1の溶液をピペットで。 </li><li> 5％CO 2インキュベーター内で37℃で30分間静置します。 </li><li>各洗浄の間に吸引し、細胞培養グレードの二重蒸留水（DDW）で3回洗浄します。最後の洗浄の後、完全に乾燥し、室温で静置します。 </li><li>電気生理学のために、37℃に加温し500μL完全DMEMとを含む各ウェルPDLコーティングしたカバーガラスを埋めます。 </li><li>上記のようにトランスフェクトされた細胞を分割するのと同じ方法を実行します。トリプシン処理およびブロッキング後の細胞を再懸濁した後、電気生理学的記録のために各PDLコーティングしたカバースリップの中心部への転送細胞（または約30,000細胞）の80μL。細胞は、少なくとも1.5時間沈降または5％CO 2インキュベーター内で37℃で一晩インキュベートすることを可能にします。 </li><li>各ウェルPDLコーティングされたカルシウムイメージングの中心部への細胞のカルシウムイメージング転送とスポット20μL（約20,000細胞）のため。細胞は、少なくとも30分間沈降し、各ウェルに180μLのフルDMEMを追加することができます。 </li></ol> 5.遺伝子発現を誘導します<ol><li>製造者の指示に従ってDDW中1mg / mLのドキシサイクリンのストック溶液を調製します。 3週間まで4℃で光から保護原液を保管してください。長期保存のために-20℃でドキシサイクリン原液を保ちます。 </li><li>完全DMEMで新鮮に2μg/ mLの（電気生理学）または3μgの/ mLの（カルシウムイメージング）ドキシサイクリン液を調製し、37℃に温めます。 </li><li>電気生理学的記録、各ウェルへ/ mLのドキシサイクリン液を2μgのピペット500μL/ mlのドキシサイクリン最終濃度1μgをするの。カルシウムイメージングのために、最終的なconcentraを作るために各ウェルに3μgの/ mLのドキシサイクリン溶液100μLを追加1μg/ mLのドキシサイクリン化。誘導の時間を書き留めます。 </li><li> 37℃での誘導のための所望の時間インキュベートし、5％CO 2。 </li></ol>タンパク質発現の6キャリブレーションタイムライン<ol><li>カルシウムイメージング5、10を介してタンパク質発現のキャリブレーション<ol><li>リンゲル液（140mMの塩化ナトリウム、2.5のKCl、1.8mMのCaCl 2を、NaOHで7.4に調整した2mMの硫酸マグネシウム、20mMのHEPES、pH値）を準備し、37℃に温めます。 </li><li>リンゲル液中にチャネルアゴニストの飽和濃度を準備します。細胞と細胞外液を含有するカルシウムイメージングチャンバーに添加したときにアゴニストの量が希釈されるので、アゴニストの所望の最終濃度の量を倍増。これはまた、コントロールに各ウェル重要で浴溶液の量になります。 </li><li> D中の非イオン性F-127 20％W / Vの溶液を調製しますMSO。非イオン性F-127が溶解するまで40℃に溶液を加熱します。 RTで非イオン性F-127ソリューションを保存し、使用前に40℃に温めます。非イオン性F-127は、水溶液中で、このようなのFura-2のような蛍光イオン指示薬のアセトキシメチル（AM）エステルの分散を助けるために使用されます。 </li><li>培地を吸引とのFura-2AMのローディング溶液（2を補充したリンゲル液 - 3μMのFura-2AM、0.02 mg / mlで非イオン性F-127及び10mM D-グルコース）と交換してください。 </li><li>暗所で室温で60分間インキュベートします。 </li><li>吸引除去のFura-2AM液および細胞外色素を除去するためにリンゲル+ 10mMのD-グルコース溶液で細胞を洗浄します。二回、この手順を繰り返します。 </li><li>各ウェルに200μLのリンゲル+ 10mMのD-グルコース溶液を残し、暗所で室温で30分間インキュベートします。 </li><li>顕微鏡のノーズピースの上にステージ上室を置き、ホルダーで固定します。 </li><li>ランプ、カメラや顕微鏡の電源をオンにし、510 nmのwavファイルでの発光を検出するためのFura-2フィルタを選択elength。 </li><li>所望の倍率を調節し、選択したフィールド内のセルを集中。 </li><li>闇の中で、背景光を減算し、露光時間を設定します。 </li><li>所望の速度と340と380 nmの波長で励起し、それらによってフラ-2負荷細胞のレコード蛍光応答で画像のサンプリングを設定します。 340/380信号の比は、TRPV1活性のためにも、このように細胞内Ca 2+濃度とするための指標です。 </li><li> TRPV1の発現レベルを評価するために、1μMカプサイシンの最終飽和濃度を作成するために、ピペットで200μLのリンゲル液中に2μMカプサイシンを追加します。 </li><li>誘導時間に応じTRPV1応答を分析し、目的のタンパク質のためのプロトコルを決定します。 </li></ol></li><li>パッチクランプ法4、11の全細胞構成を使用して、異種系でタンパク質の発現を調節します。 <ol><li>トンを準備彼は、NaOHでpH7.4に調整さ（mm）140のNaCl、2.3のKCl、2のMgSO 4、5 HEPES、5 2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）の溶液を、風呂。 </li><li>細胞外液中のチャネルアゴニストの飽和濃度の準備をします。 </li><li> 4MΩ - 2の抵抗に1.10ミリメートルと火ポリッシュの内径（ID）でガラス電極を引き出します。 </li><li> （MM）130のKCl、4のNaClのピペット溶液を調製し 、MgSO 4 2は、0.5のCaCl 2は 、1 EGTA、10 HEPESをKOHでpH 7.2に調整しました。使用前にピペット溶液をフィルタリングします。各実験の前に、単一、ファイアーポリッシュガラスピペットは戻って、少なくとも分間ピペット溶液にチップを浸漬することによって満たされ、その後、同じピペット溶液で満たされた注射器を用いて溶融延伸チップを用いて充填されています。 </li><li>ゆっくり室温で約2 mLの浴溶液で満たされた35ミリメートルのプラスチックシャーレによくから播種した細胞を持つ単一のPDLコートしたカバースリップを持ち上げます。 EPの下で観察しますI-蛍光顕微鏡。 </li><li>落射蛍光顕微鏡で可視化されるように調製カバーガラス上で、EGFP陽性細胞を見つけて、可視化フィールドの中央に移動します。 </li><li>マイクロマニピュレータのピペットホルダーに充填されたピペットを取り付け、細胞内ピペット溶液の汚染を避けるために、システムに正圧の少量を注入します。ちょうどGFP上記にそれを下げる - 陽性細胞を、適切な抵抗値をチェックします。 </li><li>ピペットは、細胞に接触するように、ガラスピペットと細胞膜の間GΩシールを作成するために、負圧の少量を適用します。 </li><li>吸引の短い、鋭いパルスで、ピペットは、細胞の細胞内内容物と接触することができ、細胞膜を破ります。 </li><li>それぞれ、5 kHzから0.5α - 全細胞にアンプモードを切り替えて、1にベッセルフィルタと出力ゲインを下げます。 </li><li>飽和に対する電流応答を記録電圧ランプまたはギャップフリープロトコルを使用してチャネルアゴニストの濃度。 </li><li>発現効率が異なるタンパク質の間で変化するため、異なる誘導の長さの時間を使って録音を繰り返します。 </li></ol></li><li>単一チャネル記録4のための理想的な誘導時間を決定します。 <ol><li>ピペット溶液として、NaOHでpH7.4に調整し、（mM）の溶液を調製150のNa-グルコン酸、15のNaCl、5 EGTA、10 HEPES。浴溶液の場合は、ステップ6.2.1からの溶液を使用しています。 </li><li> ID 0.86ミリメートルのガラスピペットのファイアーポリッシュ10の抵抗に使用して繰り返して細胞全体の手順 - 12MΩを、-40 mVの電位を保持している設定。 </li><li>前述したように、膜上にシールを作成し、膜を破裂。 </li><li>マイクロマニピュレーターを使用して、離れた細胞由来の膜パッチでピペットを持ち上げます。 </li><li>膜パッチを含むピペットに直接次の灌流システムを配置します。 </li><li>より低いTそれぞれ、5 kHzから10α - 彼は2にフィルタと出力ゲインをベッセル。 </li><li>パッチが応答に応じて1つまたは複数のチャネルを含んでいる場合、評価、膜パッチ上にアゴニストの飽和濃度を灌流。 </li><li>成功した細胞に適用される誘導時間に対して記録シングルチャネルパッチの数を分析します。所望の結果に応じた誘導時間を調整します。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

トランスフェクションは、発現の一貫性および安定性を改善するために多くの異なるバリエーションを有するタンパク質の発現研究のために広く使用されるプロトコルです。一過性トランスフェクション試薬が容易、簡単に目的の細胞およびタンパク質は、トランスフェクションの時点で一晩時間以内に分析することができるプロトコルを使用するように提供しています。分析のモードは、このような電気生理学2の単一チャネル記録として、タンパク質発現の一貫したレベルを必要とする場合残念ながら、このアプローチは、予測不可能なことができます。あるいは、テトラサイクリン抑制性発現系で安定細胞株は、対象12のタンパク質の発現レベルを制御する方法を提供するために開発されています。このアプローチは、ドキシサイクリンなどのテトラサイクリン由来のサプリメント、の導入により培養液中の全ての細胞の一貫性のある表現を提供します。これはタンパク質レベルの一貫性と正確な制御を可能にするが、トンタンパク質8の多種多様を研究する安定な細胞株を確立するに行く彼の時間と...

異種システムを発現する細胞機能1の多数を研究するために最も広く使用されている技術の一つです。それらの低い内因性のタンパク質プロフィール、最小限のメンテナンス要件、信頼性の高い成長、および外来DNAを取り込み、表現する能力は、ヒト胚性腎臓（HEK293）および生物学的研究2、3にほぼ不可欠なチャイニーズハムスター卵巣（CHO）などの細胞株を作りました。異種のシステムを用いた研究の分野は、膜タンパク質、細胞内シグナル伝達、酵素活性を含みます。細胞への外来DNAのトランスフェクションに続いて、分析の多くの異なる形態は、電気生理学、レシオメトリックカルシウムイメージング、ウェスタンブロット、 等 4、5を含む、実施することができます。 異種発現系のための潜在的なアプリケーションの広い配列に、多くのdiffereによる塩基試薬および生成物は、これらの細胞及びそれらの品質6を利用するために開発されています。一過性または恒久的に外因性タンパク質を研究するために、細胞に外来DNAを組み込み、DNAの送達システムは、生物学的研究のための最も人気のあると便利なツールの一つとなっています。具体的には、細胞内に一過性にトランスフェクトするDNAが広く、比較的少しの時間と材料を必要とする単純な、まっすぐ進むプロセスとして使用されています。さらに、トランスフェクションを受けた細胞の成功率は、7高いです。この技術は、緑色蛍光タンパク質（GFP）などのマーカー遺伝子と組み合わせたときに非常に信頼性があり、このようなカルシウムイメージングおよび電気生理学5のような多くの異なる技術のために使用することができます。しかし、残念ながら、一過性DNAを宿主細胞に発現していない細胞あたりの発現レベルの信頼性が低いこと以上に、いくつかの主要な落とし穴が付属しています。プラスミドDNAのコピー数は、Uをとっセル当たりのpは、このように個々の実験間での発現が大幅に2を変えることができ、制御不能です。いずれかの生理学的条件を再現しようとしている、または正確なデータ収集技術を実行すると、この問題が顕著になります。 上記の合併症を解決するように、安定なトランスフェクションプロトコルは、単一のを確実に、テトラサイクリンリプレッサーの発現系として、目的の遺伝子が誘導性プロモーターの厳格なコントロール下で細胞のゲノムに挿入することができるように設計されていますプラスミドのコピーは各細胞のゲノムに組み込まれ、ドキシサイクリンの存在下で、例えば、転写機構の誘導後にのみ発現されます。これは、一貫性のないタンパク質の発現レベルの障害を解決するが、この方法は、一過性トランスフェクションの迅速かつ比較的単純なプロトコルの利便性を失います。安定な細胞株を確立することはwhicで少なくとも数週間かかります時間1は、タンパク質の発現を維持し、ベクターの組み込みを確保し、巧みに選択して、細胞コロニーを成長させるために、特定の抗生物質によって設定された殺害曲線を校正しなければなりません。全体的にこれは、より低い成功率8と有意に多くの時間と労力を要します。 ここでは、任意の誘導性細胞株における発現レベルを制御するためのシンプルで効果的な方法を提供する人気のトランスフェクションのオプションの両方の強みを生かし、中間プロトコルを紹介します。誘導性のtetシステムで細胞を維持しながら、我々は、一過性相同リプレッサーシステムと組み合わせることができるベクターに連結関心の私達の遺伝子、一過性受容体電位陽イオンチャネルサブファミリーVメンバー1（TRPV1）を、トランスフェクション。この方法では、遺伝子が発現し始めずに細胞に導入することができます。唯一のドキシサイクリンを添加した遺伝子は、タンパク質exprのレベルを校正するために私たちにできるように、発現し始めるん生理学的条件下で観察された技術やレベルに応じてession。我々のプロトコルは、安定発現細胞株を生成するに関連付けられている長い合併症を回避することができます。私たちは、誘導および方法細胞内カルシウムレベルの上昇が相関の4時間を通じて非誘導からのカルシウムイメージングにおけるTRPV1の活性化の変化レベルを示すことから始めます。我々は次に、誘導時間の増加に伴って増加する電流を示し、パッチクランプ技術の全細胞構成でプロトコルを複製します。最後に、我々は、単一チャネルの電気生理学的記録の例を提示し、タンパク質の個々の単位に基づいて正確なデータ収集を探しているときに、この技術は、制御された発現のために特に有用であることを示しています。我々のプロトコルを介して、我々は、このように、実験の間に条件を制御し、MOを提供するための方法を提供し、長い細胞培養合併症を回避しながら、異種系におけるタンパク質の発現を制御するための便利な方法を提供します複製可能な結果を​​再度。

<table><tbody><tr><td>pcDNA&trade;4/TO 哺乳類発現ベクター</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>V102020</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA&trade;5/TO 哺乳類発現ベクター</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>V103320</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick PCR Purification Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K310001</td><td></td></tr><tr><td>Swift&trade;&nbsp;MaxProサーマルサイクラー</td><td>エスコ&nbsp;</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>制限酵素</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>ER0501</td><td></td></tr><tr><td>アガロース&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick Gel Extraction Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>One Shot&reg;TOP10 ケミカルコンピテント E. coli</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>C404006&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン(ナトリウム)、微生物学のためのUSPグレードの</td><td>金バイオ</td><td>A-301-5</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td>メル<td>ク</td><td>6.19305E + 13</td><td></td></tr>酵母<tr><td>抽出</td><td>物BDワールドワイド</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>SIF6000Rインキュベートシェーカー</td><td>ラボコンパニオン</td><td>45H118</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin&reg;プラスミド</td><td>Macherey Nagel</td><td>740588.25</td><td></td></tr><tr><td>MS 300V電源</td><td>主要な科学</td><td>MP-300V</td><td></td></tr><tr><td>フクロウ&貿易;イージーキャスト&トレード;B1A Mini Gel Electrophoresis System</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>B1A</td><td></td></tr><tr><td>T-REx&trade;-293 cell line</td><td>Invitrogen</td><td>R710-07</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x), liquid (high glucose)</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF&reg;</td><td>NEB</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>ApaI</td><td>NEB</td><td>R0114S</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart&reg;バッファNEB</td><td></td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA&trade;6月3日&nbsp;哺乳類発現ベクター</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>V102520</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, E.U.-approved, South America origin</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td><td>Biological Industries</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanyl-L-Glutamine (Stableグルタミン) (200 mM)</td><td>Biological Industries</td><td>03-022-1B</td><td></td></tr><tr><td>Heracell&trade; 150i CO2</td><td>Incubator ThermoScientific Fisher</td><td>51026406</td><td></td></tr><tr><td>MSC-Advantage&trade;クラスII生物学的安全キャビネット</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>51025411</td><td></td></tr><tr><td>ブラストシジウムS塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15205-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムなしで修飾されたリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>トリプシンEDTA(0.05%)、フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Double Neubauerはメタライズド血球計算盤を支配しました</td><td>Hausser Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TransIT&reg;-LT1トランスフェクション試薬</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ、#1厚さ、直径12 mm丸型</td><td>ニットガラス</td><td>GG-12</td><td></td></tr><tr><td>BioCoat&trade;ポリ-D-リジン(PDL)</td><td>コーニング</td><td>354210</td><td></td></tr><tr><td>水、細胞培養グレード</td><td>生物産業</td><td>03-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>ドキシサイクリンヒクレート</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>フラ-2、AMエステル</td><td>ビオチウム</td><td>BTM-50034</td><td></td></tr><tr><td>多元的&reg;F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-スライド 8 ウェル</td><td>同上</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>(E)-カプサイシン</td><td>Tocris</td><td>462</td><td></td></tr><tr><td>オリンパス IX70 蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>ラムダ DG-4 波長スイッチャー</td><td>サッター機器</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>EXi 青色蛍光顕微鏡カメラ</td><td>QImaging</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>MetaFluor 蛍光比イメージングソフトウェア</td><td>分子デバイス</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>薄肉ホウケイ酸チューブ</td><td>サッター機器</td><td>B150-110-7.5HP</td><td></td></tr><tr><td>標準壁ホウケイ酸チューブ</td><td>サッター機器</td><td>B150-86-7.5HP</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td>ド無水 <td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>P1000マイクロピペットプーラー</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>MF-900 Microforge</td><td>NARISHIGE</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>ValveBank perfusion systemtem</td><td>AutoMate Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata&reg; 1440A 低ノイズデータ収集システム</td><td>Molecular Devices</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10.6 ソフトウェア</td><td>Molecular Devices</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-225</td><td></td></tr></tbody></table>

誘導性一過性トランスフェクションを介して制御可能なイオンチャネルの発現

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

トランスフェクションは、細胞への外来核酸の送達は、タンパク質研究の強力なツールです。この方法によって、イオンチャネルは電気生理学的分析、生化学的特徴、突然変異研究、および細胞プロセスへの影響を介して調べることができます。一過性トランスフェクションは、タンパク質が、数時間から数日以内に、分析のために利用可能となるような単純なプロトコルを提供します。この方法は、比較的簡単かつ時間効率的なプロトコルを提示しているが、重要な要素の一つは、分析するのに適している生理学的に適切なレベルまたはレベルの関心対象の遺伝子の発現を較正します。この目的のために、関心対象の遺伝子の発現を制御する能力を提供する多くの異なるアプローチが出現しています。いくつかの安定な細胞トランスフェクションプロトコルは、恒久的に、テトラサイクリン制御transcripの制御下で細胞ゲノム中に目的の遺伝子を導入する方法を提供します的な活性化。この技術は信頼性の高い発現レベルを生成しているが、関心の各遺伝子は、殺害曲線のキャリブレーション、細胞コロニーの選択、および全体的なより多くのリソースを含む、熟練した作業の数週間が必要です。ここでは、イオンチャネルの解析に不可欠である制御された方法でタンパク質を発現するための効率的な方法として、誘導系に一過性受容体電位陽イオンチャネルサブファミリーVメンバー1（TRPV1）遺伝子の一過性トランスフェクションを使用するプロトコルを提示します。我々は、この技術を用いて、我々は、単一のトランスフェクションでのデータ収集の種類ごとに必要な制御チャネルレベルでカルシウムイメージング、全細胞、および単一チャネル分析を実行することが可能であることを示しています。全体として、これは、イオンチャネルの構造と機能を研究するために使用することができる複製可能な技術を提供します。

素早く誘導発現のモデルを作成するために、我々は、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（TR）を発現するHEK293細胞を使用した（ 例えば、T-REX-293）、およびCMVプロモーターおよびマルチクローニング部位との間のテトラサイクリンオペレーター配列（のtetO）を含有するベクター（ 例えば、のpcDNA4 / TO）。 TREX-293細胞にトランスフェクトした場合にTRがのtetOに結合するように、のpcDNA4 / TOにおける目的遺伝子の発現が抑制されます。培地にドキシサイクリンを添加すると、このようにしてトランスフェクトされたタンパク質の発現を可能にする、TR-のtetO相互作用を防止します。ラットTRPV1（rTRPV1）の発現を制御するためには、まず、上記のプロトコルを使用してベクトルに/のpcDNA4にこのチャネルの遺伝子を挿入しました。次に、T-REX-293細胞は、プロトコルの点3の手順に従って、プラスミドTO / rTRPV1-のpcDNA4をトランスフェクトしました。トランスフェクション後、rTRPV1発現...

異種発現しているシステムを介してイオンチャネルを研究することは、生物医学研究の中核技術となっています。本稿では、誘導性プロモーターの制御下で、一過性トランスフェクションを行うことにより厳密に制御イオンチャネルの発現を達成するために、時間効率的な方法を提示します。

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

本手順の全体的な目的は、長時間の細胞培養に伴う複雑な問題を回避しつつ、異種発現系におけるイオンチャネルの発現を制御する簡便な方法を提供することです。これにより、実験間の条件制御が可能となり、より再現性の高い結果を得ることができます。本手法は、イオンチャネル分野における研究を促進するのに役立ちます。薬理学におけるチャネル特性の解析などが挙げられます。現在の手法は複雑であるか、あるいはタンパク質発現に一貫性がないためです。本手法の主な利点は、個々の実験に合わせて調整された多種多様なタンパク質の制御された発現レベルを、比較的短期間で達成できる点にあります。この手順を開始するには、50%のコンフルエンシーにするため、1ウェルあたり0.9 mLの完全DMEMを充填して用意した12ウェルプレートにTREX 293細胞を播種します。その後、CO2インキュベーター内にて37 °Cで一晩培養します。次に、DMEM、ここに示されている目的遺伝子TRPV1、不活性プラスミド、および脂質トランスフェクション試薬で構成されるトランスフェクション混合液を調製します。電気生理学的実験では、トランスフェクションに成功した細胞を可視化するため、哺乳類発現プラスミドに組み込んだEGFPをトランスフェクションカクテルに含めます。トランスフェクション混合液を室温で30分間インキュベートします。その後、12ウェルプレートに播種した細胞上に、トランスフェクション混合液をピペットで滴下してトランスフェクションを行います。DNAとトランスフェクション試薬を均一に分散させるため、プレートを激しく揺らします。その後、トランスフェクションした細胞を27 °Cで一晩インキュベートします。翌朝、電気生理学的測定を行う場合は、UVランプの下でEGFPの蛍光信号を観察し、細胞が正常にトランスフェクションされているかを確認します。電気生理学的な解析を行う場合は、12ウェルプレートからPDLコート済みのカバーガラスへ、500 µLの完全DMEMを用いて細胞を移します。カルシウムイメージングを行う場合は、約20,000個の細胞をPDLコート済みのカルシウムイメージングチャンバーにスポットします。本手順では、2回蒸留水を用いて、1 mg/mLのドキシサイクリンストック溶液を調製します。ストック溶液は4°Cで遮光し、最大3週間保存してください。長期保存の場合は、ドキシサイクリンストック溶液を-20°Cで保存してください。次に、完全DMEMを用いてドキシサイクリン新鮮溶液を調製します。そして、37 °Cまで温めます。電気生理学的記録を行う場合は、各ウェルに2 µg/mLのドキシサイクリン溶液を500 µLピペッティングし、ドキシサイクリンの最終濃度を1 µg/mLにします。カルシウムイメージングを行う場合は、各ウェルに3 µg/m

controllable-ion-channel-expression-through-inducible-transient

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

我々は、イオンチャンネルの機能上の単一の点変異の効果を研究する方法を説明します。...

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

発現とHEK - 293T細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録用に最適化されたトランスフェクション戦略

出典: ベレンズ、C. ほか。 誘導性発現システムを応用して、細菌病原性因子が細胞内シグナル伝達に干渉する様子を研究すること。 J. Vis. Exp.

細菌エフェクタータンパク質を発現する細胞への誘導性遺伝子発現系のトランスフェクション

この動画では、目的の遺伝子を含むプラスミドと制御プラスミドをトランスフェクションして、培養細胞の遺伝子発現を制御する方法を説明しています。このプラスミドの発現は、テトラサイクリンまたはその合成類似体によって制御できるため、このシステムは調節可能な遺伝子発現を研究するための有用なモデルとなっています。...

誘導性Tet-Off制御システム:テトラサイクリンオフシステムを使用して培養細胞における遺伝子発現を調節するIn vitro法

ここで述べられている方法は、抗アポトーシス細菌のエフェクタータンパク質の活性を解剖するために、定義されたステップでアポトーシスシグナル伝達カスケードを誘導するために使用されます。この方法は、アポトーシス促進性または毒性タンパク質の誘導性発現、または他のシグナル伝達経路との干渉の解剖にも使用できます。...

誘導発現系を適用すると、細胞内シグナル伝達と細菌の病原性因子の干渉を研究するために、

継承された不整脈は、しばしば、一つ以上のイオンチャネルの表面の配信を変更する突然変異によって引き起こされます。ここでは、TSA-201細胞で発現された組換えイオンチャネルの相対的な合計および細胞表面タンパク質発現の定量化を提供するために、フローサイトメトリーアッセイを適合させます。...

フローサイトメトリーを用いた組換えイオンチャネルの相対的な細胞表面および合計式の決意

Nonlytic昆虫細胞発現系は、生産、細胞輸送/ローカリゼーション、および組換えタンパク質機能解析のために十分に活用されています。ここでは、市販の鱗翅目の細胞株で発現ベクターおよびそれに続く一過性のタンパク質発現を生成する方法について説明します。細胞内蛍光マーカータンパク質とタバココナジラミのアクアポリンの共局在も提示されています。...

培養昆虫細胞における一過性発現および組換えタンパク質の細胞内局在

ここでは、テブフェノジド処理による pEUI(+) 特異遺伝子スイッチを用いた遺伝子発現の調節のためのプロトコルを提案する.

脱皮ホルモン受容体を介した特異遺伝子スイッチ意図的な堅牢性、可逆性、ごくわずかな水漏れしたためと遺伝子発現の

ここで任意のタンパク質をそれのドミナント ネガティブ変異体バージョンを元に戻せる状態 ⓫ 条件付きで不活性化することができます、ドミナント ネガティブ誘導システムを開発するためのプロトコルを提案する.

誘導およびリバーシブルのドミナント ネガティブ (DN) 蛋白質の阻害

本研究では、3DプリントされたLEDアレイを用いたハイスループット実験を行い、HEK293T細胞における光誘導性遺伝子発現を最適化する方法を紹介します。...

哺乳類の遺伝子発現を制御するための光誘導システムの迅速な最適化

学ぶ誘導性一過性トランスフェクションによるイオンチャネル発現制御法。TREX293細胞を用いて、ドキシサイクリン誘導でタンパク質発現レベルを精密に調節し、電気生理学実験の再現性を向上させる手法です。

誘導性一過性トランスフェクションを介して制御可能なイオンチャネルの発現

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