使用してリンパ球血管外漏出の分析インビトロヒト血液脳関門のモデル

このトランスマイグレーションアッセイの全体的な目標は、in vitroで中枢神経系へのリンパ球の血管外漏出を調査することです。この方法は、中枢神経系の炎症性疾患の理解を深め、新しい治療アプローチの開発に役立ちます。この技術のいくつかの利点は、簡単にアクセスできることと、単一細胞レベルでのまれなリンパ球集団の分析を可能にすることです。

この方法は、血液脳関門を越えるリンパ球の転生に関する洞察を得ることができ、血液脳脊髄液関門を介した転生の研究に適用することができます。さらに、エバンスブルーパーミエーション解析を実行して、血液脳関門モデルの完全性を評価することができます。まず、T-25細胞培養フラスコの底部を2ミリリットルの調製したばかりのフィブロネクチン溶液で覆い、摂氏37度、二酸化炭素5%の細胞培養インキュベーターで少なくとも3時間インキュベートします。

インキュベーションの終了時に、フィブロネクチン溶液を6ミリリットルの完全ECM-b培地中の第4のヒト脳微小血管内皮細胞(HBMEC)の7.2倍の10に交換し、フラスコをインキュベーターに戻します。HBMECが80%のコンフルエントに達したら、上清を15ミリリットルの円錐管に移し、付着細胞を5ミリリットルのPBSで3回洗浄します。3回目の洗浄後、2ミリリットルの予熱したアキュターゼ溶液を細胞に37°Cで2分間加えます。

次に、フラスコを数回しっかりと叩き、光学顕微鏡で細胞の剥離を確認します。細胞がフラスコの底から浮き上がり始めたら、採取した上清を使用してフラスコを繰り返しすすぎ、HBMECの大部分が再懸濁されるまで繰り返します。次に、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐チューブに移して遠心分離し、ペレットを1ミリリットルの新鮮なECM-b培地に再懸濁してカウントします。

トランスマイグレーションアッセイ用の細胞培養インサートを調製するには、まず100マイクロリットルのフィブロネクチン溶液を各インサートに加え、96ウェル平底プレートの1ウェルに添加します。摂氏37度で3時間後、フィブロネクチン溶液を100マイクロリットルのHBMECと交換し、600マイクロリットルの新鮮なECM-b培地を細胞培養インサートの下部コンパートメントに加えます。その後、プレートを細胞培養インキュベーターに3〜4日間戻します。

バリアインテグリティが達成されたかどうかをテストするには、1つの細胞培養インサートの下部および上部のコンパートメントから培地を吸引し、新たに調製したEvansブルー溶液100マイクロリットルをインサートに加えます。B27を添加した600マイクロリットルのPBSを下部コンパートメントに加え、プレートをインキュベーターに戻します。1時間後、鉗子を使用してインサートを慎重に取り外し、下部コンパートメントから100マイクロリットルのPBS B27を黒のポリスチロール、96ウェルの平底板の2つの個々のウェルに移します。

次に、プレートをマルチモードマイクロプレートリーダーにロードし、最適なz位置を決定します。HBMECバリア機能を決定するには、適切な設定を使用してエバンスブルー色素溶液の励起を測定し、取得したデータを、播種後の異なる時点でのHBMEC全体のエバンスブルー透過を示す標準曲線と比較します。細胞単分子膜の形成を確認した後、末梢血単核細胞(PBMC)サンプルを、B27を添加したRPMI培地で1ミリリットルあたり10〜6番目の細胞濃度の5倍に再懸濁します。

次に、コンフルエントHBMEC単分子膜を含む適切な数の細胞培養インサートの下部および上部コンパートメントから培地を吸引し、ドナーあたり100マイクロリットルのPBMCを細胞培養インサートおよびin vitroコントロールあたり24ウェルプレートの1ウェルに加えます。600マイクロリットルのRPMIとB27を細胞培養インサートの下部コンパートメントに加え、500マイクロリットルをin vitroコントロールウェルに加え、プレートを細胞培養インキュベーターに6時間戻します。インキュベーションの終わりに、鉗子を使用して細胞培養インサートを取り外し、膜に触れずに400マイクロリットルのPBSで底を注意深くすすぎます。

次に、20 μリットルのFlow-Count Fluorosphereを実験ウェルおよびin vitroコントロールウェルの細胞と完全に混合し、得られたPBMC懸濁液の1 mliterを適切な対応するフローサイトメトリーチューブに移します。遠心分離により細胞を採取し、目的の蛍光色素標識抗体を100マイクロリットルのフローサイトメトリーバッファーに各サンプルに加えます。摂氏4度で30分後、細胞を250マイクロリットルの新鮮なフローサイトメトリーバッファーで洗浄し、分析のためにペレットを適切な量のフローサイトメトリーバッファーに再懸濁します。

すべてのデータを取得したら、適切なフローサイトメトリー解析ソフトウェアを開きます。NK細胞サブセットのトランスマイグレーションを解析するには、まずサイドスキャッターチャネル対前方散乱チャネルプロットでリンパ球を選択し、CD3対CD56ドットプロットで細胞を表示します。次に、CD56陽性、CD3陰性のNK細胞を選択します。

トランスマイグレーションしたNK細胞サブセットを区別するには、CD56対CD16のプロットで細胞を表示し、CD56bright、CD16dimまたは陰性、およびCD56dim、CD16陽性細胞をゲートします。次に、前方散布図と側面散布図からFlow-Count Fluorospheresを選択します。ビーズ番号を決定するには、選択したデータを、525 ナノメートルから 700 ナノメートルの発光波長と時間の関係をカバーするチャネルのプロットに表示します。

最後に、インビトロコントロールにおける遊走細胞の総数と細胞総数との比として、遊走したNK細胞の割合を決定します。3〜4日間の培養後、HBMECはタイトジャンクション分子Zonula occludens-1を発現し、経内皮電気抵抗を示し、Evans青色色素の透過を減少させる単層で増殖しました。全PBMCトランスマイグレーションアッセイの24時間前にインターフェロンガンマおよびTNFアルファによる内皮細胞単層の刺激により、分析されたすべてのリンパ球集団の移動が増加します。

興味深いことに、CD56bright、CD16dim、または陰性のNK細胞は、刺激されていないHBMECとサイトカイン活性化HBMECの両方で、CD56dim、CD16陽性NKよりも高い遊走能力を示します。炎症細胞単層を介したトランスマイグレーションの相対的な増加は、CD56dim細胞全体では高く、CD56bright、CD16dim陰性NK細胞が髄腔内コンパートメントに濃縮されているというin vivo観察を模倣しています。マスターすれば、このテクニックは10時間以内に完了することができます。

インターフェロンガンマおよびTNFアルファによるin vitroトランスマイグレーションセットアップの前処理により、炎症条件下でのリンパ球の遊走の研究が可能になります。私たちのプロトコルは、せん断力を適用するか、アストロサイトなどの血液脳関門の他の細胞と共培養することにより、中枢神経系へのリンパ球の移行のための洗練されたモデルを提供するために変更することができます。このビデオを見た後、ヒト血液脳関門のinvitroモデルを使用してリンパ球の転生を調査する方法について十分に理解しているはずです。