Name: 使用してリンパ球血管外漏出の分析インビトロヒト血液脳関門のモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 学ぶリンパ球の血管外漏出メカニズムをインビトロのヒト血液脳関門モデルを用いて解析する方法。単一細胞レベルでの希少リンパ球集団の分析が可能で、中枢神経系の炎症性疾患の理解と新規治療法開発に貢献します。

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この研究は、共同研究センターCRC TR128 "Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress toward Tackling the Disease" (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.)の支援を受けています。

ヒト脳微小血管内皮細胞（HBMEC）1.細胞培養<ol><li>細胞培養フラスコのコーティング<ol><li>フィブロネクチン溶液を調製し、15 mL遠心管に10mLのPBSを加えます。 150μLのフィブロネクチンを加え、よく混ぜます。 </li><li>底部を覆うようにT-25細胞培養フラスコは、フィブロネクチン溶液2mLを加えます。インキュベーター中で37℃で少なくとも3時間、細胞培養フラスコをインキュベートします。フィブロネクチンコーティングしたフラスコを37℃/ 5％CO 2で2週間貯蔵することができます。 </li></ol></li><li>シーディングとHBMECの細胞培養<ol><li>細胞培養フラスコの底から吸引フィブロネクチン溶液。 6mLのECM-B培地に懸濁7.2×10 4 HBMEC / cm2での追加（= ECM-Bは、5％ウシ胎児血清、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、および1％の内皮細胞増殖サプリメントを補充しました）。 37℃/ 5％CO 2でインキュベートします。顕微鏡を用いて毎日細胞増殖を確認してください。 </li><li> 3日ごとに培地を変更します。HBMECが約80％コンフルエンスに達し収穫または分割細胞、。 HBMECは、生理学的特性の損失を避けるために、継代1と15の間で使用されるべきです。 </li></ol></li><li>収穫HBMEC。 <ol><li> 1の比でPBSでACCUTASE（1X）を混合することにより、ACCUTASE溶液を調製する：1。さらに使用するまで水浴中で37℃でACCUTASEソリューションをしてください。 </li><li> 15mLの遠心管に細胞培養フラスコからECM-B培地を移します。洗浄HBMEC細胞培養フラスコの底に5 mLのPBSを添加することによって。吸引PBSと洗浄工程を繰り返してさらに2回。 </li><li> 2 mLのACCUTASE予め温めソリューションを追加します。 2分間37℃でインキュベートします。その後、HBMECはしっかりと細胞培養フラスコを数回タップして再懸濁されています。細胞の剥離を顕微鏡を用いて制御されます</li><li>以前に15 mLチューブに格納されたECM-B媒体はすぐHBMECデタッチし始めるようにバック細胞培養フラスコに添加します。最もHBMECがあるまで繰り返しフラスコの底をすすぎます再懸濁しました。 </li><li> 15mLの遠心管に細胞懸濁液を移します。室温で10分間、300×gで遠心分離。上清を捨て、1mLのECM-B培地中に細胞を再懸濁。細胞をカウントし、mLのECM-B培地あたり3×10 5 HBMECの最終濃度を達成するために、細胞懸濁液を希釈します。 </li></ol></li></ol>細胞培養インサートの調製<ol><li>細胞培養インサートのコーティング 重要な注意 ：細胞培養インサートの膜に触れないようにしてください。 <ol><li>各細胞培養インサートに100μLのフィブロネクチン溶液（1.1.1を参照）（ 図1A）、96ウェル平底プレートの1つのウェル（光制御ウェル）を加えます。 37℃で少なくとも3時間インキュベートします。インキュベーション吸引フィブロネクチンソリューションの後。 </li><li>細胞培養インサートとウェルの光学制御に100μLHBMEC懸濁液を加えます。 600μlのECM-B媒体は、セルの下部コンパートメントに追加します培養インサート。 3インキュベート-障壁の完全性（ 図1B）が到達するまでCO 2、37℃/ 5％で4日間、ウェルの光学制御にHBMECの微視的評価によって細胞増殖を確認。注意：4日先以降の細胞増殖を、お勧めしません。 </li><li>オプション：炎症状態を模倣するためには、下部区画から培地を吸引し、24時間遊走アッセイ前に500 U / mLのIFN-γ/ TNF-αを補充したECM-B培地と交換してください。 </li></ol></li></ol>遊出アッセイの日にエバンスブルー3.品質管理<ol><li>エバンスブルー溶液の調製<ol><li> 15mLの遠心チューブを用いて200μlのB27サプリメントとPBS / B27溶液混合物10 mLのPBSを調製しました。エバンスブルーストック溶液を希釈した（20mg / mLのPBS）1：PBS / B27 1,000。 </li></ol></li><li>エバンスブルー透過性アッセイ<ol><li>上部コンパートメントに続く下部コンパートメントから培地を吸引コンフルエントHBMEC単層を含有するもの、細胞培養インサート。細胞培養インサートに100μLエバンスブルー溶液を追加します。 </li><li>下部コンパートメントに600μLのPBS / B27を追加し、37℃/ 5％CO 2で60分間インキュベートします。慎重にピンセットを用いて、細胞培養インサートを取り外します。 </li></ol></li><li>エバンスブルーの測定<ol><li>下部コンパートメントからPBS / B27を除去し、黒色ポリスチロール96ウェル平底プレートの2つのウェルに100μLずつ移します。テカンインフィニットM200プロプレートリーダーでプレートを挿入し、最適なz位置を決定します。 </li><li> （例：励起：620nmで、発光：680nmの励起帯域幅：9nmで、発光帯域幅：20nmの、175x強調、25のフラッシュ、積分時間：20マイクロ秒）エバンスブルー用いて、各設定の尺度励起。 </li><li> HBMECバリア機能を決定するためにシードした後の異なる時点でHBMEC横切るエバンスブルー透過性を示す標準曲線に取得したデータを比較しますINGの細胞（右図1B）。 </li></ol></li></ol> 4.移動アッセイ<ol><li>末梢血単核細胞（PBMC）の調製。 <ol><li> 15 mLの遠心分離管に10 mLのRPMIを追加し、200μLB27のサプリメントを追加します。 5分間300×gでPBMCと遠心細胞を数えます。 5×10 6細胞/ mLでRPMI / B27の最終濃度にPBMCを再懸濁。 </li></ol></li><li>移動アッセイのセットアップ<ol><li>コンフルエントHBMEC単層（ 図1A）を含む細胞培養インサートの上部区画に続く下部区画から吸引媒体。ドナーあたりにつき24ウェルプレートの1つのウェル（in vitroでの対照）にも、細胞培養インサート100μLPBMC懸濁液各々を追加し。 </li><li> in vitroでの対照のPBMCに細胞培養インサート500μLの下部区画に600μLのRPMI / B27を追加し、37℃/ 5％CO 2で6時間インキュベートします。 </lI&gt; </ol></li><li>移行したPBMCの収穫<ol><li>ピンセットを用いて、細胞培養インサートを取り出し、慎重に膜を触れることなく400μLPBSでボトムをすすぎます。細胞培養インサートを廃棄します。 </li><li>ならびにインビトロ制御するために挿入してよく混合細胞培養の下部コンパートメントに20μLフローカウント蛍光粒子（約1,000ビーズ/μL）を加えます。転送サイトメトリー管を流れるようにPBMC懸濁液を得1mLの。 </li></ol></li></ol> 5.フローサイトメトリー<ol><li>サンプル調製<ol><li>室温で5分間、300×gで遠心分離PBMC。 </li><li> 100μLに蛍光標識抗体を添加することによって抗体溶液を調製するには、サンプルあたり緩衝液（PBS / 1％BSA / 2mMのEDTA）フローサイトメトリー。 1μLCD4-FITC、1μLCD3-PerCPを/ Cy5.5を以下に示す結果を得るために、1μLCD56-PC7、1μLCD8-A700、および1μLのCD16-A750は、サンプルごとに使用しました。 </li><li>再懸濁PB抗体溶液の100μLにMC、4℃で30分間インキュベートします。 </li><li> 250μLを5分間300×gでバッファと遠心フローサイトメトリーを追加します。 </li></ol></li><li>サンプル取得<ol><li>フローサイトメトリー緩衝液の必要量の再懸濁PBMC（使用するフローサイトメーターに依存して変化します）。 </li><li> （ - 700 nmの励起488 nmの発光525）フローカウント蛍光粒子を検出するために525と700 nmの波長の間の活性検出器を、フローサイトメーターを用いて染色したPBMCを取得します。 （カルツァGソフトウェアで動作サイトメーターGallios流れた場合、次の手順は一例では、使用される：（1）コンピュータを起動し、オペレーティングシステムが完全にロードされたとき（2）、ボタン「オンサイトメーター」を押すことでフローサイトメーターを開始します。 （3）「オープンプロトコル」ボタンを押すことにより、それぞれの取得プロトコルをロードする。（4）必要なプロトコルを選択し、「開く」を選択する。（5）右でクリックすることにより、すべてのサンプルのためのプロトコルを複製フィールド上の仮想カルーセルと左クリックで表示プロトコルの上でマウスボタンは、「複製」。 （6）サンプル・リスト内の各サンプルにラベルを付けます。 （7）カルーセルの示された位置にサンプルを移し、取得を開始します。） </li></ol></li><li>サンプル分析<ol><li>それぞれのソフトウェアを使用してフローサイトメトリーのデータを結果として開きます。 in vitroでの対照ウェルから遊出PBMCの対象ならびに細胞の亜集団の数を決定し、それぞれの分析ソフトウェアを使用してカウント蛍光粒子を流れます。 ゲーティング戦略を結果部分に与えられている（実施例（ 図1 C：NK細胞サブセットの遊出を分析するために、第一前方散乱チャネル（FSC）プロット対側方散乱チャネル（SSC）中でリンパ球を選択リンパ球です。次いで、CD56プロット対CD3及びCD56 + CD3に表示- NK細胞が選択されるNK細胞サブセットを区別するために、NK細胞は、で表示されますCD56 CD16に対してプロット及びCD56 明るい CD16 /暗く-ならびにCD56 ディム CD16 + NK細胞が選択されます。また、流量計蛍光粒子は、SSCプロット対FSCから選択され、その後、それらの数を決定するための時間対525と700nmの間の発光を有するチャネルのプロットで表示します）。 </li><li>各試料の総細胞数を計算するために、流量計蛍光粒子を用いた細胞の検出数を正規化します。 <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55390/55390eq1.jpg" /></li><li> in vitroでの制御中の全遊走細胞と全細胞の比として遊走した細胞のパーセンテージを決定します。 </li></ol></li></ol>

著者は、この記事の研究、著者、および/または出版に関して、次の潜在的な利益相反を宣言しました。U.B.は財務情報開示を行っていません。TSH。バイオジェンから旅費と会議費を受け取りました。N.S.は、バイオジェンとノバルティス・ファーマから講演者および諮問委員会の謝礼金、およびバイオジェンから旅費を受け取りました。H.W.は、バイエル・ヘルスケア、バイオジェン、メルク・セローノ、ノバルティス、サノフィ・ジェンザイムの科学諮問委員会/運営委員会の委員を務めたことで報酬を受け取りました。また、バイエル・バイタルGmbH、バイエル・シェリングAG、バイオジェン、CSLベーリング、フレゼニウス・メディカルケア、グラクソ・スミスクライン、GWファーマシューティカルズ、ルンドベック、メルク・セローノ、オムニアメッド、ノバルティス、サノフィ・ジェンザイムから講演者の謝礼と旅費支援も受けました。バイオジェン、メルク・セローノ、ノバルティス、サノフィ・ジェンザイムからコンサルタントとして報酬を受け取った。H.W.は、バイエル・バイタル、バイオジェン、ジェンザイム、メルク・セローノ、ノバルティス、サノフィ・アベンティス・ドイツ、サノフィUSから研究支援を受けました。C.C.G.は、ジェンザイム、ノバルティス・ファーマGmbH、バイエル・ヘルスケアから講演者の謝礼と会議への出席に対する旅費を受け取りました。

ここでは、ヒトの血液脳関門を通過するリンパ球の遊出を調査する手法を提示します。 CNSへのリンパ球遊走のin vitroでの解析では 、リンパ球の血管外漏出、潜在的な疾患関連の変更、および新しい治療アプローチの基本的なプロセスを研究することが重要です。 血液脳関門モデルのいくつかの変更が可能です。例えば、上部区画からの細胞を非遊走細胞集団の組成を調べるために分析することができます。さらに、アッセイの24時間前にIFN-γおよびTNF-αとHBMEC単層の処理は、炎症性CNS疾患21、25の効果を研究するために炎症を起こし、血液脳関門を模倣するために使用することができます。同様に、他の物質とHBMECまたはリンパ球の処置は、リンパ球の血管外遊出に及ぼす影響を調べることができ（ 例えば、それらを接着分子に対する効果）30、31。</su...

組織への血液からリンパ球遊走は免疫監視のために重要です。特定の分子間相互作用の順序は、小腸、皮膚、リンパ節、中枢神経系（CNS）、および他の組織1内に部位特異的血管外遊出を確実にします。リンパ球遊走における変化は広い拡散疾患2の数の病態生理に関与しています。免疫特権CNSへの移行は厳密に調節され、それに応じて、このプロセスの変化は脳脊髄炎3、視神経脊髄炎、脳卒中、及び多発性硬化症（MS）2、4、5、6、7のようなCNS関連疾患に関与しています。したがって、より良い病気の病態生理を理解し、のためのツールを開発するために、リンパ球の血管外漏出を研究することが重要です<html>疾病負担8、9、10、11、12の干拓。 リンパ球は、異なる経路を介してCNSに移動します。脈絡叢内の血液-脳脊髄液関門を介して、及び血液脳関門を通過くも膜下空間に後毛細血管細静脈を通って溢出1に記載されている、13、14、15。血液脳関門を横切って移動は、内皮細胞14とリンパ球との相互作用によって行われます。周囲の内皮細胞とは対照的に、CNSの内皮細胞は、それによって厳密に血液脳関門を通過することが可能な細胞およびタンパク質の量を制限する、タイトジャンクション分子を大量に発現します小娘= &quot;外部参照&quot;&gt; 16。タイトジャンクションの緩みにおける炎症の結果および接着分子の発現を誘導します。従って、CNS 1、17、18へのリンパ球の遊走を増強します。 血液脳関門を介した血管外漏出は、多段階プロセスです。内皮細胞へのテザーを、リンパ球、次いで主セレクチン1、15により媒介されるプロセスにおける内皮に沿って転がります。その後、リンパ球上に発現内皮によって分泌ケモカインそれぞれケモカイン受容体との間の相互作用は、それによって内皮細胞1に強固な接着を促進し、インテグリンの立体構造変化を誘導します。最後に、血管周囲の空間にtransmigrating前に、血流に対する内皮バリアに沿っていずれかのクロールをリンパ球、または直ちに直接transmストール強固な接着1、19、20のサイトでigrate。リンパ球の血管外漏出のすべての手順は、異なる技術21を用いてインビトロで分析することができます。タイムラプスビデオ顕微鏡は、初期テザリングとローリング15を研究するために使用されます。接着アッセイは、障壁22を内皮細胞へしっかり逮捕に関する詳細な情報を提供します。ここで実証されるように遊出アッセイは、免疫細胞の遊出21、23、24、25、26、27、28、29の分析を可能にします。 体外血液脳関門モデルに人間を使用して、我々は最近、高いMIGRことを示すことができましたCD56 明るい CD16 dimに/のatory容量-そのCD56 ディム CD16 +対応物と比較して、NK細胞は、クモ膜下区画21において、このNK細胞サブセットの優位性により反映されました。したがって、我々の実験は、in vivoでの状況を模倣するのに適しのようです。

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>CaCl2 または MgCl2</td></tr><tr><td>Fibronectin 1 mg/mL</td> シ<td>グマ</td><td>F1141-5MG</td><td>ウシ血漿</td></tr><tr><td>T-25 細胞培養フラスコ</td><td>Greiner BioOne</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>HBMEC</td><td>ScienCell</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pelobiotech</td><td>PB-H-6023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ECM-b</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>内皮細胞増殖サプリメント</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>トランズウェル</td><td>コーニング</td><td>3472</td><td>透明、直径 6.5 mm、直径 3.0 &マイクロ;m 細孔径</td></tr><tr><td>96 ウェル平底板</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>エバンス ブルー</td><td>Sigma</td><td>E2129-10G</td><td>ストック溶液: 1 g/50 mL PBS</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50x 濃縮</td></tr><tr><td>Infinite M200Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル黒 平底板</td><td>Greiner BioOne</td><td>675086</td><td></td></tr><tr><td>48 ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>フローカウント フルオロスフィア</td><td>ベックマン・コールター</td><td>7547053</td><td></td></tr><tr><td>NA-EDTA</td><td>シグマ</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>シグマ</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>ガリオス 10色フローサイトメーター</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カルーザ 1.5a</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-&アルファ;</td><td>ペプロテック</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&ガンマ;</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300430</td><td>クローン UCHT1</td></tr><tr><td>CD56-PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21692</td><td>クローン N901</td></tr><tr><td>CD16-A750</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66330</td><td>クローン 3G8</td></tr><tr><td>CD4-FITC</td><td>Biolegend</td><td>300506</td><td>クローン RPA-T4</td></tr><tr><td>CD8-A700</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66332</td><td>クローン B9.11</td></tr></tbody></table>

使用してリンパ球血管外漏出の分析<em&gt;インビトロ</em&gt;ヒト血液脳関門のモデル

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

中枢神経系（CNS）へのリンパ球の血管外漏出は、免疫監視のために重要です。リンパ球の血管外漏出の疾患関連変異は、CNSにおける病態生理学的変化をもたらす可能性があります。このように、CNSへのリンパ球遊走の調査は、炎症性CNS疾患を理解するために、新たな治療アプローチを開発することが重要です。ここでは、リンパ球の血管外漏出を研究するために、ヒトの血液脳関門のin vitroモデルを提示します。ヒト脳微小血管内皮細胞（HBMEC）がコンフルエント血液脳関門の内皮を模倣するように挿入TRANSWELL多孔性ポリエチレンテレフタレート上に成長させます。バリア機能は、閉鎖帯occludens免疫組織化学、経内皮電気抵抗（TEER）の測定ならびにエバンスブルー透過の分析によって確認されます。 NK細胞-このモデルは、CD56 明るい CD16 dimに/ような稀なリンパ球サブセットの漏出の調査を可能にします。 Furtherm鉱石、他の細胞、サイトカインおよびケモカイン、疾患関連の変化、およびリンパ球の遊走能に異なる治療計画の効果を研究することができます。最後に、内皮バリアに炎症性刺激の影響だけでなく、異なる治療計画を解析することができます。

ヒト血液脳関門モデル（ 図1A）を使用して、NK細胞およびT細胞サブセットの遊出を示す代表的な結果が示されています。 HBMEC単層の完全性は、タイトジャンクション分子ZO-1、経内皮電気抵抗（TEER）の測定、及びエバンスブルー透過（ 図1B）の染色によって確認しました。 3次- 4日間培養HBMECは、タイトジャンクション分子ZO-1（左図1Bを ）発現しました。さらに、HBMEC（右図1B）エバンスブルーのための経内皮電気抵抗（ 図1Bの中央）ならびに減少浸透を示す単層で成長しました。 2元として及びCD56 ディム CD16 + NK細胞サブセット及びCD4 +およびCD8 + T細胞を含むT細胞- HBMEC単層をCD56 明るい CD16 dim</su...

ここでは、中枢神経系へのリンパ球の移行をin vitroで調査することを可能にするヒトの血液脳関門モデルについて説明します。

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

この遊走アッセイの全体的な目的は、中枢神経系へのリンパ球の血管外遊出をin vitroで調査することです。この手法は、中枢神経系の炎症性疾患に対する理解を深め、新たな治療法の開発に役立ちます。この技術の利点としては、簡便に実施可能であること、および希少なリンパ球集団を単一細胞レベルで解析できることが挙げられます。この手法は、血液脳関門を介したリンパ球の透過に関する知見を提供し、血液脳脊髄液関門を介した透過の研究にも適用可能です。さらに、血液脳関門モデルの完全性を評価するために、エバンスブルー透過性分析を行うことができます。まず、T-25細胞培養フラスコの底部を、調製したばかりのフィブロネクチン溶液 2 mL で覆い、37 °C、5% CO2 の細胞培養インキュベーター内で少なくとも 3 時間インキュベートします。インキュベーション後、フィブロネクチン溶液を、完全ECM-b培地6 mLに懸濁した7.2 × 10⁴個のヒト脳微小血管内皮細胞（HBMEC）に交換し、フラスコをインキュベーターに戻します。HBMECが80%コンフルエントに達したら、上清を15 mLコニカルチューブに移し、接着細胞を5 mLのPBSで3回洗浄します。3回目の洗浄後、あらかじめ温めておいたAccutase溶液2 mLを細胞に加え、37 °Cで2分間置きます。その後、フラスコを数回しっかりと叩き、光学顕微鏡で細胞の剥離を確認します。細胞がフラスコの底から剥がれ始めたら、回収した上清を用いてフラスコを繰り返し洗浄し、ほとんどのHBMECを再懸濁させます。次に、細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに移して遠心分離し、ペレットを1 mLの新鮮なECM-b培地で再懸濁して計数します。トランスミグレーションアッセイ用に細胞培養インサートを準備するには、まず、各インサートと96ウェル平底プレートの1ウェルに、フィブロネクチン溶液を100 µLずつ加えます。37 °Cで3時間置いた後、フィブロネクチン溶液を100 µLのHBMECに置換し、細胞培養インサートの下部コンパートメントに新鮮なECM-b培地を600 µL加えます。その後、プレートを細胞培養インキュベーターに戻し、3〜4日間培養します。バリアの完全性が達成されたかを確認するために、1つの細胞培養インサートの上室および下室から培地を吸引し、新鮮に調製したEvans blue溶液 100 µLをインサートに加えます。下室にB27を補充したPBS 600 µLを加え、プレートをインキュベーターに戻します。1時間後、ピンセットを用いて慎重にインサートを取り出し、下室からPBS B27 100 µLを、黒色のポリスチレン製96ウェル平底プレートの個別の2つのウェルに分注します。次に、プレートをマルチモードマイクロプレートリーダーにセットし、最適なzポ

analysis-lymphocyte-extravasation-using-an-vitro-model-human-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオは、血液脳関門(BBB)内皮モデルを介したリンパ球の移動の実験的調査を示しています。in...

微小血管内皮細胞単層におけるリンパ球トランスマイグレーションの研究

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